Interbio v.1 n.1 2007 21 CONSUMO DE OXIGÊNIO, ESTRESSE OXIDATIVO E ATIVIDADE DE ENZIMAS ANTIOXIDANTES COMO FERRAMENTAS PARA O ESTUDO DO MECANISMO DE INJÚRIA OXIDATIVA PRÉ-HEMOLÍTICA. OXYGEN CONSUMPTION, OXIDATIVE STRESS AND ANTIOXIDANT ENZYMES ACTIVITIES AS A TOOL FOR PREHEMOLYTIC OXIDATIVE INJURY MECHANISM STUDY. SIMÃO, Andréa Name Colado 1 ; SUZUKAWA, Andréia Akemi 2, LOZOVOY, Marcell Alysson Batisti 3, CECCHINI, Rubens 4 Resumo O estresse oxidativo é uma importante causa de indução de doenças, tais como a anemia hemolítica. Os azocompostos têm sido usados para estudar o mecanismo de estresse oxidativo em eritrócitos. O AAPH (2,2`azobis amidinopropano) produz radicais livres do tipo peroxil por decomposição térmica unimolecular em uma taxa constante. Estes radicais alteram a estrutura e função dos eritrócitos incluindo as proteínas e lipídeos de membrana e o estado de oxidação da hemoglobina. Neste estudo, eritrócitos humanos foram incubados com AAPH numa faixa de concentração entre 0 a 15mM e incubado por até 6 horas. A hemólise foi avaliada à 540 nm e hemoglobina e hemicromos foram determinados por análise espectral usando a equação de Winterborn. O consumo de oxigênio foi estimado por eletrodo de Clark. A lipoperoxidação foi determinada pela reação de TBARS. A hemólise mostrou uma curva sigmóide em função do tempo de incubação e a extensão da hemólise foi proporcional a concentração à concentração de AAPH. Os níveis MDA aumentaram em função do tempo de incubação. A oxihemoglobina foi oxidada a metahemoglobina e hemicromo tanto no compartimento intracelular como extracelular. O tempo de indução (Tind) determinado pelo consumo de oxigênio pelo eritrócito foi significativamente reduzido após incubação com AAPH e foi concentração dependente. A atividade da superóxido dismutase aumentou após 4 horas de incubação. De acordo com estes resultados, nós devemos considerar que ambos, a injúria da membrana celular pela ação direta do azocompostos e a oxidação intracelular como parte do mecanismo de lesão pré-hemolítica. Palavras-chave: AAPH, estresse oxidativo, eritrócitos, hemólise, MDA Abstract Oxidative stress could be an important causative factor inducing a number of human diseases, such hemolytic anemia. Azo compounds have been used to study the mechanism of oxidative stress in erythrocytes. AAPH (2,2 azobis amidinopropane) produce peroxyl radicals for unimolecular thermal decomposition at constant rate. These radicals alter the erythrocytes structure and function including membrane protein and lipid and state of hemoglobin oxidation. In this study, human erythrocytes were incubated with AAPH at concentration ranging from 0 to 15 mm and incubated from 0 to 6 h. The hemolysis was evaluated at 540 nm and methemoglobin and hemichrome were measured from differential spectral analysis using Winterbourne equation. Oxygen consumption was estimated for Clark electrode in thermostatic holder. The lipid peroxidation was measured from TBA reaction. The hemolysis showed a sigmoid curve as a function of incubation time and the extent of hemolysis was proportional to the AAPH concentration. The MDA levels increased as a function of the incubation time. The oxyhemoglobin was oxidized to methemoglobin and hemichrome both in intracellular and extracelular compartiments. The induction time (t-ind) measured for erythrocyte O2 consumption was significantly reduced after incubation with AAPH and was concentration dependent. The SOD activity was increased after 4 h of incubation. About theses results, we should consider both membrane injury for direct action of azo compound and intracellular oxidation as a part of prehemolitica damage mechanism. Key-words: AAPH, oxidative stress, erytrocytes, hemolysis, MDA 1 Docentes do Departamento de Patologia, Análises Cínicas e Toxicologia, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Estadual de Londrina (UEL), Londrina, Paraná, Brasil. 2. Acadêmica de Biomedicina, Universidade Estadual de Londrina (UEL), Londrina, Paraná, Brasil. 3. Acadêmico de Farmácia, Universidade Paranaense (UNIPAR), Umuarama, Paraná, Brasil. 4. Docente do Departamento de Ciências Patológicas, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Londrina (UEL), Londrina, Paraná, Brasil.
Interbio v.1 n.1 2007 22 Introdução O estresse oxidativo tem importante papel em uma série de fenômenos fisiológicos e patológicos do organismo, tais como: o envelhecimento, o câncer, a aterosclerose, o diabetes mellitus, a anemia hemolítica, entre outros (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999). Os eritrócitos são muito susceptíveis ao estresse oxidativo e o seu emprego, bem como de suas membranas isoladas, constituem bons modelos experimentais para o estudo dos mecanismos de lesão por radicais livres em membranas, assim como o efeito protetor de alguns compostos (BARTOSZ et al., 1997; ROSS et al., 1998; LENFANT et al., 2000; GUO, et al., 1994; SATO et al., 1995; SATO et al, 1998; SATO et al., 1999; ZOU et al., 2001). A ação dos radicais livres em membranas eritrocitárias pode levar a uma série de alterações como formação de lipoperóxidos, redução da deformabilidade, mudanças na morfologia, ligação cruzada e fragmentação de proteínas, hemólise e alterações no metabolismo intracelular (BEGUM & TERAO, 2002; SATO et al, 1995; SANDHU et al., 1992). Essas alterações têm como principal conseqüência a diminuição do tempo de sobrevida do eritrócito. O 2,2- azo-bis (2-amidinopropano) é um azocomposto hidrossolúvel gerador de radicais livres que atacam a região aquosa da membrana. Os radicais livres gerados por decomposição térmica à 37ºC são de uma única espécie (SATO et al, 1995) e foram identificados como sendo radicais peroxil (LENFANT et al, 2000). A geração de radicais pelo AAPH é tempo e dose dependente (SANDHU et al., 1992; SATO et al, 1995; LENFANT et al.,2000; ZOU et al., 2001). Uma vez gerado esses radicais no meio extracelular, eles irão atacar a membrana eritrocitária causando várias alterações oxidativas em lipídeos e proteínas presentes. Sato e colaboradores (1995) demonstraram que a hemólise causada pelo AAPH pode ser caracterizada principalmente por dois eventos: a lipoperoxidação e a redistribuição de proteína de banda 3 oxidada na membrana, devido a sua alteração conformacional. Esta redistribuição leva a formação de poros hemolíticos e o formato característico de disco bicôncavo dos eritrócitos é alterado principalmente para formato esferocítico. Sabe-se, que este fenômeno in vivo poderia resultar em hemólise e conseqüentemente levar ao desenvolvimento de anemia. Não há, no entanto, estudos do estresse oxidativo induzido pelo AAPH procurando estabelecer os mecanismos de lesões pré-hemolíticas avaliando a injúria intracelular e da membrana dos eritrócitos. Neste estudo investigamos os mecanismos de injúria oxidativa intracelular pela avaliação do perfil espectral da hemoglobina e seus derivados, da medida do tempo de indução e da lesão da membrana pela avaliação do consumo de oxigênio, além da medida do malondialdeído (MDA), um produto resultante da lipoperoxidação. Material e Métodos Preparo da suspensão de eritrócitos O sangue venoso humano heparinizado obtido de doadores saudáveis, não fumantes e não submetidos a tratamento farmacológico foi centrifugados a 2000 rpm e a camada leucocitária descartada. Os eritrócitos foram submetidos a três lavagens consecutivas com solução salina 0,9% para eliminar possíveis interferentes. Os ensaios foram realizados com uma suspensão de eritrócitos a 1% e a 5% em tampão fosfato de potássio monobásico 10 mm ph 7.4 com NaCl 0,9%. Incubações com AAPH A suspensão de eritrócitos a 1% foi incubada com AAPH em diferentes tempos e concentrações, afim de, determinar o tempo e a dose ideal do sistema gerador de radicais livres para que se possa avaliar a
Interbio v.1 n.1 2007 23 lesão oxidativa pré-hemólise das células. As soluções de AAPH foram preparadas em tampão fosfato de potássio monobásico 10mM ph 7.4 com NaCl 0,9%. As amostras foram incubadas em banho-maria 37ºC com agitação constante (100 rpm) e ao abrigo da luz. Determinação de hemólise A suspensão de eritrócitos 1% após incubação com AAPH 5mM entre 0 a 6 horas foi centrifugada por 10 minutos a 2000 rpm. O grau de hemólise (%) foi determinado pela medida da absorbância a 540 nm. O padrão 100% de hemólise foi determinado pelo preparo de suspensão de eritrócitos 0,25% em água destilada incubada por 10 minutos em banho-maria 37ºC (SATO et al., 1995). Determinação da oxidação da hemoglobina Para avaliar a capacidade do AAPH em causar oxidação intracelular e extracelular foram determinadas as concentrações de oxihemoglobina e de seus derivados oxidados, a metahemoglobina e o hemicromo, de acordo com o proposto por Winterbourn, 1985. Após incubação com o azocomposto, as hemácias foram hemolisadas e o conteúdo de hemoglobina e seus derivados analisado. Para avaliar se o AAPH é capaz de oxidar a hemoglobina livre, o material hemolisado durante a incubação com este composto também foi avaliado. Consumo de O 2 O consumo de O 2 por eritrócitos foi obtido através de polarografia computadorizada utilizando um eletrodo de Clark (LISSI et al., 1986) em câmara de consumo projetada e construída para este fim. O ensaio do consumo de O 2 baseia-se na medida do oxigênio que é consumido durante a reação estimulada com o hidroperóxido de tert-butil (t-buooh) a 2mM. Dois parâmetros foram avaliados: tempo de indução (T-ind) que corresponde ao tempo medido entre a adição de t- BuOOH e o início do consumo de oxigênio e a velocidade de consumo de O 2. Quantificação de substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS) A medida da lipoperoxidação foi realizada pela medida da formação do cromóforo entre ácido tiobarbitúrico (TBA) e o malondialdeído (MDA), um produto peroxidado da membrana lipídica. A absorbância do cromóforo foi determinada em espectrofotômetro a 535 nm e os resultados expresso em absorbância (BISWAS et al., 1995; CECCHINI et al., 1990). Dosagem de proteína Utilizou-se o Método de Lowry e colaboradores (1951) modificado por Miller (1959). Atividade da superóxido dismutase (SOD) A interferência do estresse oxidativo gerado pelo AAPH na atividade da enzima SOD intracelular foi determinada de acordo com o método descrito por Beutler (1984). Determinação da atividade da catalase A determinação da atividade da enzima catalase em suspensão de eritrócitos pré-incubados com o AAPH foi realizada de acordo com o método proposto por Cohen e colaboradores (1970) e Aebi (1974). A decomposição do H 2 O 2 está relacionada diretamente com a queda da absorbância em 240 nm. A atividade da catalase é medida pelo tempo que leva para a absorbância cair de 0.500 a 0.450. Análise estatística As análises descritivas de todas as variáveis estudadas estão apresentadas como
Interbio v.1 n.1 2007 24 média e erro padrão da média (SEM). Utilizamos o programa de análise estatística computadorizada (Grapf Pad In Stat, San Diego Califórnia). Foram utilizados o teste de Tukey, T Student para amostras pareadas e não pareadas e teste alternativo de Welch para amostras não pareadas com diferentes SD. Os resultados foram considerados estatisticamente significativos quando p<0,05. direto do AAPH sobre a molécula de hemoglobina uma vez liberada no meio extracelular pela hemólise (figura 3). Resultados e Discussão HEMÓLISE ( %) 60 50 40 30 20 10 O AAPH 5 mm causou acentuada hemólise tempo e dose dependentes a partir de 3 horas de incubação (figura 1). 3 mm 5 mm 10 mm 15 mm Figura 2 - Concentração de Oxihemoglobina (OxiHb) e Metahemoglobina (MetaHb) intracelular em eritrócitos submetidas a estresse oxidativo com AAPH. A suspensão de eritrócitos 1% foi incubada com AAPH 5mM em diferentes tempos em banhomaria 37ºC com agitação (100rpm). 0 0 1 2 3 4 5 6 TEMPO DE INCUBAÇÃO (Hrs) Figura 1 - Curva de eritrócitos submetidos a estresse oxidativo. A suspensão de eritrócitos 1% foi incubada com AAPH em diferentes concentrações por até 6 horas, a 37ºC com agitação (100rpm). As concentrações de oxihemoglobina e metahemoglobina intracelulares sofreram alterações significativas quando incubadas com AAPH em diferentes tempos. A figura 2 demonstra queda dos níveis intracelulares de oxihemoglobina e aumento nos níveis de metahemoglobina, o seu produto direto de oxidação. Esses resultados demonstram a ação oxidativa do AAPH intracelular. Embora sejam gerados no meio extracelular, os radicais peroxil foram capazes de causar oxidação intracelular. Os níveis extracelulares de oxihemoglobina, metahemoglobina e hemicromo também aumentaram, o que sugere ataque oxidativo Figura 3 - Concentração extracelular de hemoglobina e seus derivados oxidativos em eritrócitos submetidas a estresse oxidativo com AAPH. A suspensão de eritrócitos 1% foi incubada a 37ºC com AAPH 5mM com agitação (100rpm) e a concentração de oxihemoglobina (oxihb), metahemoglobina (metahb) e hemicromo determinada no sobrenadante hemolítico No teste de consumo de oxigênio são avaliadas a capacidade antioxidante intracelular (Tind) e a velocidade de consumo de O 2. Verificou-se uma significativa diminuição no Tind após 4 horas de incubação (figura 4).
Interbio v.1 n.1 2007 25 Por outro lado, a velocidade de consumo de O 2 pelo eritrócito, que representa uma susceptibilidade a lipoperoxidação, não sofreu qualquer alteração nos diferentes tempos de incubação (figura 5). preservação quando comparadas a outras proteínas intracelulares. Isso não ocorreu com a catalase que manteve sua atividade intracelular sem alterações significativas nos diferentes tempos de incubação (figura 7). Após 2 horas de incubação com AAPH foi demonstrado um significativo aumento nos níveis de MDA de forma tempo-dependente (figura 8). Isso demonstra a ação oxidativa do azocomposto nos lipídeos de membrana. Figura 4 - Tind medido pelo início do consumo de O2 induzida por tert-hidroperóxido 2mM foi realizada utilizando eletrodo de Clark termostatizado a 37ºC. A suspensão de eritrócitos 5% foi incubada por diferentes tempos com AAPH 5mM a 37ºC com agitação (100rpm). * p=0,0389 (comparado ao controle tempo 0 hora). Figura 6 - Concentração intracelular de SOD em eritrócitos submetidos a estresse oxidativo com AAPH 5mM. A suspensão de eritrócitos 1% foi incubada em diferentes tempos com AAPH 5mM a 37ºC com agitação (100 rpm). * p < 0,01 (comparado ao controle tempo 0 hora) Figura 5 - Velocidade de Consumo de O2 induzido por tert-hidroperóxido 2mM em eritrócitos submetidos a estresse oxidativo por AAPH. A suspensão de eritrócitos 5% foi incubada por diferentes tempos com AAPH 5mM a 37ºC com agitação (100rpm). Não há diferença significativa entre as amostras e o controle (tempo 0 hora). A atividade da enzima SOD intraeritrocitária aumentou significativamente após 4 horas de incubação (figura 6). Isso talvez possa ser explicado por uma maior resistência desta enzima ao ataque de radicais livres e assim sua maior Figura 7 - Concentração de catalase intracelular em eritrócitos submetidos a estresse oxidativo por AAPH. A suspensão de eritrócitos 1% foi incubada com AAPH 5mM a 37ºC com agitação (100rpm). Não há diferença significativa entre as amostras e o controle (tempo 0 hora).
Interbio v.1 n.1 2007 26 Os aumentos de Tind, da velocidade de oxidação intracelular da hemoglobina e da atividade da SOD indicam claramente que o AAPH induziu um estresse oxidativo intracelular. O aumento nos níveis de MDA e da oxidação extracelular da hemoglobina aponta, por outro lado, para um estresse oxidativo nas vizinhanças do eritrócito e uma possível lipoperoxidação de sua membrana. É possível que a associada à ação direta do AAPH intracelularmente, ocorra também uma ação oxidativa indireta através da aceleração da oxidação da hemoglobina. BEGUM, A. N.; TERAO, J. Protective effects of alpha-tocotrienol against free radical-induced impairment of erytrocyte deformability. Bioscience, Biotechnology & Biochemistry, 66(2): 398-403, 2002. BEUTLER, E. Superoxide Dismutase. In: Red Cell Metabolism: a manual of Biochemical Methods. Philadelphia: Grune & Stratton, 1984. p.83-85. BISWAS, T.; PAL, J. K.; NASKAR, K., GHOSH, D. K.; GHOSAL, J. Lipid peroxidation of erytrocytes during anemia of the hamsters infected with Leishmania donovanii. Molecular and Cellular Biochemistry, 146:99-105, 1995. CECCHINI, R.; ARUOMA, O. I.; HALLIWELL, B. The action of hydrogen peroxide on the formation of thiobarbituric acid-reactive material from microsomes or from DNA damage by bleomycin or o-phenanthroline. Artefacts in the thiobarbituric acid test. Free Radical Research Communications, v. 10, p. 245-58, 1990. COHEN, G.; DEMBIEC, D.; MARCUS, J. Measurement of catalase activity in tissue extracts. Anal Biochemistry, v.34, p.30-8, 1970. DACIE, J.; LEWIS, S. M. Pratical Haematology. 8º ed. Einburgh, Churchill Livingstone, 1995. 453p. Figura 8 - Níveis de MDA após incubação com AAPH. A suspensão de eritrócitos 5% foi incubada com AAPH 5mM a 37ºC com agitação (100rpm). * p< 0,05 (comparado ao controle tempo 0 hora) Conclusões Nossos resultados indicam que a lesão de membrana através da ação direta do azo composto e a oxidação intracelular, estariam envolvidos no mecanismo de lesão préhemolítico induzida por esse gerador de radicais livres. Referências Bibliográficas AEBI, H. Catalase in vitro. Methods in Enzymology, v.105, p.121-126, 1984. GUO, L.; OGAMO, A.; OU, Z.; SHINOZUKA, T.; NAKAGAWA, Y. Preferential formation of the hydroperoxide of linoleic acid in choline glycerophospholipids in human erytrocytes membrane during peroxition with a azo initiator. Free Radical Biology & Medicine, v.18, nº6, p.1003-1012, 1995. HALLIWELL, B.; GUTTERIDGE, J. M. C. Free radicals in biology and medicine 3ºed. cap.9, p. 617-783, 1999. LENFANT, F.; LAHET J. J.; VERGELY, C.; VOLOT, F.; FREYSZ, M.; ROCHETTE, L. Lidocaine inhibits potassium efflux and hemolysis in erytrocytes during oxidative stress in vitro. General Pharmacology 2000; 34: 193-199. LISSI, E.; FRANS, R.; CABEZAS, J.; FERNADEZ, V.; VIDELA, L. A. Effects of antioxidants and hemoglobin status on the t-butil hydroperoxidesinduced oxygen uptake by red blood cells. Cell Biochemistry Function v. 4, p. 61-68, 1986. BARTOSZ, M.; KENZIORA, J.; BRATOSZ, G. Antioxidante And prooxidant Properties of Captopril and Enalapril. Free Radical Biology & Medicine v. 23, p. 729-735, 1997.