Caracterização de fungos envolvidos em infecções nosocomiais

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO E CULTURA UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA XISTO SENA PASSOS Caracterização de fungos envolvidos em infecções nosocomiais ORIENTADORA: PROFª DRª MARIA DO ROSÁRIO RODRIGUES SILVA Tese de Doutorado GOIÂNIA GO, 2007

UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL XISTO SENA PASSOS Caracterização de fungos envolvidos em infecções nosocomiais ORIENTADORA: PROFª DRª MARIA DO ROSÁRIO RODRIGUES SILVA Tese de Doutorado apresentada ao Curso de Pós- Graduação em Medicina Tropical do Instituto de Patologia e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás como requisito parcial para obtenção de Grau de Doutor em Medicina Tropical. Área de concentração: Microbiologia. GOIÂNIA GO, 2007

Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP) (GPT/BC/UFG) Passos, Xisto Sena. P289c Caracterização de fungos envolvidos em infecções nosocomiais / Xisto Sena Passos. Goiânia, 2007. xiv,99f. : il., figs., tabs. 1 Orientadora: Maria do Rosário Rodrigues Silva. Tese ( Doutorado ) Universidade Federal de Goiás, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, 2007. 2 Bibliografia: f. 61-78. Inclui lista de abreviaturas, símbolos e unidades. Anexos. 1. Candidíase 2. Candidíase Mucosa bucal 3. Candidíase Mucosa vaginal 4. Fungos (Candida) Tratamento I. Silva, Maria do Rosário Rodrigues II. Universidade Federal de Goiás, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública III. Título CDU: 616.98:616.934

A Deus por sempre me dar forças, iluminar e guiar. i

As tarefas diárias jamais impediram alguém de seguir seus sonhos Paulo Coelho ii

À minha esposa Ana Luiza e aos meus filhos, Rodolfo Lucas e Gabriel Augusto, a essência da magia que é a razão da minha energia, persistência e luta. iii

Zaia, O amor é a asa que Deus deu à alma para que ela pudesse subir até Ele. Quem é bom tem olhos de bondade para ver até os erros dos outros, tem coração para perdoar e tem, sobretudo, coragem para dividir a sabedoria que possui. A você na qualidade de amiga e orientadora sou eternamente grato, sobretudo, pelo privilégio de haver trabalhado e recebido tanto de você nesses anos de convivência, pois você é a síntese da bondade. Muito obrigado e que Deus ilumine sempre sua vida. iv

AGRADECIMENTOS Dois homens juntos são mais felizes que um isolado. Se um vier a cair o outro o levanta. Mas, ai do homem solitário, se ele cair, não há ninguém para levantá-lo (Ecle 4.1-10). Pelas motivações, somadas à genosidade de vocês conseguimos concluir este trabalho. Esta foi a maior alegria que experimentei... contar com todos vocês Orionalda de Fátima Lisboa Fenandes Lúcia Kioko Hasimoto e Souza Carolina Rodrigues Costa Crystiane Rodrigues de Araújo Janine de Aquino Lemos Ana Cristina Machado de Souza Hildene Menezes e Silva Elisa Sales Nascimento Werther Souza Sales Patrícia Jackeline Maciel Denise Milioli Ferreira Karla Carvalho Miranda Miranildes de Abreu Batista José Clementino de Oliveira Neto Kariny Vieira Soares Luiz Augusto Pereira Keili Souza v

Aos professores do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, um agradecimento especial, pela acolhida e pelo muito que me ensinaram ao longo da minha caminhada. vi

À Universidade Federal de Goiás por fornecer uma excelente estrutura, o que possibilitou a realização deste trabalho. vii

À Universidade Paulista, representada pelos professores do programa de pós-gradução, que subvenciou recursos para a efetivação desta pesquisa e pelas valiosas sugestões. viii

LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES. AIDS ATCC α BSI β Acquired immunodeficiency syndrome American type culture colletion Alfa Bloodstream infection Beta C Grau Celsius CFU/ml CIM CLSI CVV DNA HAART HC HIV ICU IgA MIC ml μg NCCLS PCR ph RAPD RFLP Unidade formadora de colônia por mililitro Concentração inibitória minima Clinical and Laboratory Standards Institute Candidíase vulvovaginal Ácido desoxirribonucléico Highly active anti-retroviral therapy Hospital das Clínicas Human immunodeficiency virus Intensive care unit Imunoglobulina A Minimal inhibitory concentration Mililitro Micrograma National Committee for Clinical Laboratory Standards Polymerase Chain Reaction Potencial hidrogeniônico Random Amplified Polymorphic DNA Restriction Fragment Length Polymorphisms ix

SIDA sp. spp. SPSS UFG USA UTI Síndrome da imunodeficiência adquirida Espécie Espécies Statistical Programmer for Social Sciences Universidade Federal de Goiás United State of América Unidade de terapia intensiva x

SUMÁRIO AGRADECIMENTOS... v LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES.... ix RESUMO... xiii ABSTRACT... xiv 1 INTRODUÇÃO... 1 1.1 ASPECTOS GERAIS... 1 1.2 MECANISMO DE PATOGENICIDADE... 2 1.2.1 Fatores relacionados ao hospedeiro... 2 1.2.2 Fatores relacionados ao microrganismo... 3 1.3 MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS... 7 1.3.1 Candidíase superficial... 7 1.3.2 Candidíase sistêmica... 9 1.4 INFECÇÕES NOSOCOMAIS POR CANDIDA SPP... 10 1.5 TRATAMENTO... 12 1.6 SUSCETIBILIDADE ANTIFÚNGICA IN VITRO... 15 1.6.1 Resistência aos antifúngicos... 18 1.7 MÉTODOS MOLECULARES... 20 2 JUSTIFICATIVA... 24 3 OBJETIVOS... 26 3.1 OBJETIVO GERAL... 26 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 26 xi

4 PRODUÇÃO CIENTÍFICA... 27 4.1 ARTIGO 1: CANDIDA COLONIZATION IN INTENSIVE CARE UNIT PATIENST S URINE... 28 4.2 ARTIGO 2: SPECIES DISTRIBUTION AND ANTIFUNGAL SUSCEPTIBILITY PATTERNS OF CANDIDA SPP. BLOODSTREAM ISOLATES FROM A BRAZILIAN TERTIARY CARE HOSPITAL... 33 4.3 ARTIGO 3: MOLECULAR EPIDEMIOLOGICAL ANALYSIS OF BLOODSTREAM OF CANDIDA ALBICANS... 41 4.4 ARTIGO 4: NOSOCOMIAL INVASIVE INFECTION CAUSED BY CUNNINGHAMELLA BERTHOLLETIAE: CASE REPORT... 55 5 CONCLUSÕES... 59 6 REFERÊNCIAS RELACIONADAS À INTRODUÇÃO... 60 7 ANEXOS... 79 7.1 NORMAS PARA PUBLICAÇÃO NA REVISTA MEDICAL MYCOLOGY INSTRUCTIONS TO AUTHORS (ARTIGO 3)... 79 7.2 PROTOCOLO DO CEPMHA/HC/UFG... 92 7.3 TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO... 96 xii

RESUMO Os pacientes da unidade de terapia intensiva apresentam um índice elevado de infecções do trato urinário e da corrente sanguínea causadas por Candida spp. As infecções por esse microrganismo, na maioria das vezes, estão relacionadas à fonte endógena. Entretanto, fontes exógenas provenientes do meio ambiente foram descritas como prováveis fontes de candidíase. Neste trabalho, foram coletadas amostras de sangue, urina, cateter de pacientes e da superfície da cama e mesa de Meyer da unidade de terapia intensiva de um hospital terciário, durante o período de um ano para pesquisa e identificação de fungos. Os potenciais fatores de risco para candidemia e candidúria foram analisados e o teste de suscetibilidade antifúngica para os fungos isolados da corrente sanguínea foram realizados usando-se o método de microdiluição em caldo. A diversidade genética entre isolados de C. albicans foi avaliada na tentativa de se verificar possíveis correlações de padrões de DNA das cepas obtidas de amostras clínicas e do meio ambiente da unidade de terapia intensiva. Dentre as 345 amostras de sangue, Candida foi detectada em 33 pacientes, e em um paciente foi identicado a presença de um fungo filamentoso, Cuninghamella bertholetiae. Candida não-albicans foi responsável por 51,5% dos casos de candidemia. Das 153 amostras de urina coletadas, candidúria foi verificada em 68 pacientes, sendo que Candida nãoalbicans foi identificada em 31,9%. O período de internação relacionado com candidemia e candidúria foi estatisticamente significante. Uso de antibióticos e de cateter invasivo foram fatores predominantes nos casos de candidemia e de candidúria. A suscetibilidade in vitro dos isolados do sangue revelou alta sensibilidade aos antifúngicos estudados. A análise de RAPD para os 31 isolados de C. albicans do sangue, catheter, urina, superfície de cama e mesa de Meyer confirmou que os oligonucleotídios Cnd3 e Cnd4 possuem alto valor discriminatório. Os resultados obtidos permitiram concluir que embora candidemia estivesse largamente associada à fontes endógenas como candidúria, a presença de Candida nas superfícies do cateter, cama e da mesa de Meyer foram consideradas importantes fontes exógenas. xiii

ABSTRACT Nosocomial bloodstream and urinary tract infections caused by Candida spp. are common among the ICU patients. Candida nosocomial infection has been generally related to the endogenous flora but exogenous infection originating from the environment has occurred. In this work, we collected samples of blood, urine, catheter of patients and the surface of bed and Meyer table from ICU from tertiary hospital during one year period for research and identification of fungus. It was yet verified the potential risk factors for candidemia and candiduria and the antifungal susceptibility was performed by broth microdilution method for Candida isolates recovered from bloodstream. Additionally, we assessed the genetic diversity among C. albicans isolates in an effort to establish the relationship between DNA patterns of the strains recovered from clinical and environment samples from the ICU. Among 345 blood samples, candidemia was recovered in 33 patients caused by different species of Candida while fungaemia by Cunninghamella bertholetiae was identified in one patient. Candida nonalbicans was responsible by 51.5% of the cases of candidemia. Among 153 urine samples, candiduria was detected in 68 patients, from which it was isolated 31.9% of Candida non-albicans. Candida species in the blood and urine were statiscally associated with long term hospitalization and the most common risk factors were the use of antibiotics and indwelling urinary catheter. The majority of Candida isolates from blood were susceptible to the antifungals tested. The analyses using RAPD among 31 C. albicans isolates from blood, urine, catheter, surface of bed and Meyer table confirmed that the Cnd3 and Cnd4 primers have high discriminatory power. In conclusion, although candidemia was strongly associated to endogenous sources such as candiduria, it was observed that catheter, surface of bed and Meyer table were also considered important exogenous sources of infection. xiv

1 INTRODUÇÃO 1.1 Aspectos gerais Candidíase é uma infecção normalmente secundária aguda ou crônica, com manifestações clínicas extremamente diversificadas podendo produzir lesões que variam de uma simples irritação no tecido cutâneo até uma resposta granulomatosa. As lesões podem ser superficiais com localização principalmente nas mucosas bucal e vaginal, ou sistêmica, verificando-se em alguns casos, septicemia por Candida (Menezes et al. 2005). As leveduras do gênero Candida incluem aproximadamente 200 espécies, dentre as quais C. albicans, C. dubliniensis, C. famata, C. glabrata, C. guilliermondii, C. haemualaii, C. inconspicua, C. kefyr, C. krusei, C. lambica, C. lipolytica, C. lusitaniae, C. novergensis, C. parapsilosis, C. pelliculosa, C. rugosa, C. sake, C. spharice, C. tropicalis e C. zeylanoides estão associadas com candidíase no homem e/ou em animais (Hajjeh et al 2004; Segal, 2004; Almirante et al. 2005; Colombo et al. 2006). Candida albicans é a espécie patogênica de maior prevalência na maioria das casuísticas estudadas (Richet et al. 2002). Espécies não-albicans, entretanto têm aumentado gradativamente, sendo que C. tropicalis, C. glabrata e C. parapsilosis são comumente isoladas em casos de candidíase relatadas por diferentes pesquisadores (Pfaller et al. 1999; Sota et al. 1999; Cantón et al. 2001; Galván & Mariscal 2006).

O gênero Candida faz parte da microbiota da pele, das mucosas, do trato digestivo e geniturinário humano ou de animais, encontrando-se também saprofiticamente em plantas, objetos inanimados e no meio ambiente havendo, portanto fatores ligados ao hospedeiro ou ao microrganismo que influenciam na transformação dessas leveduras de saprófitas para parasitas (Galván & Mariscal, 2006). 1.2 Mecanismo de patogenicidade 1.2.1 Fatores relacionados ao hospedeiro A capacidade de produção de infecção por espécies de Candida depende mais do hospedeiro do que do fungo. A candidíase pode ocorrer pelo rompimento do equilíbrio parasita-hospedeiro, que pode ser desencadeado pelas alterações das barreiras teciduais, da microbiota autóctone e da resposta imune (Drago et al. 2000; Calderone & Fronzi, 2001). Alterações na superfície da pele ou mucosas possibilitam a proliferação ou mudança do sítio anatômico da levedura contribuindo para a instalação de Candida no organismo do hospedeiro. Esse fator é comum em pacientes que sofrem constantemente traumatismo devido a procedimentos invasivos, como sondas e cateteres, e em pacientes com extensas queimaduras (Pulcini et al. 2006). Espécies de Candida, especialmente C. albicans, consideradas como pertencentes à microbiota autóctone humana, de orofaringe, dobras da pele, secreções brônquicas, vagina, urina e fezes (Odds, 1988; Macphail et al. 2002) podem, em determinadas circunstâncias como uso de antibioticoterapia 2

prolongada, proliferarem desencadeando infecção. Pacientes de unidade de terapia intensiva, que geralmente recebem altas doses de antibióticos, tornamse mais propensos à produção de infecção por estas leveduras (Safdar et al. 2002). Mecanismos mediados por imunidade celular e humoral constituem uma eficiente proteção contra infecções por fungos do gênero Candida (Richardson & Warnock, 1994). O papel da atividade de neutrófilos contra infecções sistêmicas pode ser evidenciado pelo aumento de infecções disseminadas em pacientes submetidos à quimioterapia (Merz, 1990). Neutrófilos e macrófagos participam na defesa do hospedeiro devido à sua ação microbicida (Greenfield, 1992). Por outro lado, a importância das células T na prevenção do desenvolvimento de candidíase mucocutânea tem sido demonstrada. Candidíase é freqüente em crianças com problemas no timo, principal órgão formador de linfócitos T, e em pacientes com a síndrome da imunodeficiência humana adquirida (AIDS ou SIDA), em que se observa uma acentuada diminuição dessas células (Merz, 1990). A imunidade humoral pode auxiliar na defesa do hospedeiro através da formação de anticorpos, que associados ao sistema complemento, atuam como opsonizadores para as células fagocitárias, ou impedem a adesão do microrganismo às células do hospedeiro (IgA secretora) (Odds, 1988; Samaranayake & MacFarlane, 1990). 1.2.2 Fatores relacionados ao microrganismo Candida albicans e outras espécies do gênero possuem características celulares e moleculares que possibilitam a produção de infecções. Estas 3

características estão relacionadas principalmente à adesão, ao dimorfismo (variação de antígenos de superfície), à variabilidade fenotípica (fenômeno switching), e à produção de toxinas e exoenzimas, como proteases e fosfolipases produzidas pelos microrganismos (Hellstein et al. 1993; Vargas et al. 2000; Fotedar & Al-Hedaithy, 2003). Os mecanismos de patogenicidade das espécies de Candida variam de acordo com o tipo de infecção. A invasão da corrente sangüínea e crescimento nos tecidos podem requerer determinados fatores de virulência que podem ser diferentes daqueles para causar doenças na superfície das mucosas (De Bernardis et al. 1993; Venkatesan et al. 2005). No estabelecimento da infecção sistêmica os patógenos oportunistas são capazes de evadirem do sistema imune, sobreviverem e iniciarem o seu processo de divisão, difundindo-se para os órgãos internos do hospedeiro (Casadevall & Piorfski, 2001). O mecanismo de produção de lesões por fungos do gênero Candida não é totalmente conhecido. Não há evidências se a invasão da levedura está mais relacionada à falhas no sistema de defesa do hospedeiro ou a propriedades específicas da levedura (Venkatesan et al. 2005). A capacidade que o microrganismo tem de se aderir a superfícies das células do hospedeiro representa o primeiro mecanismo da patogênese (Calderone & Fronzi, 2001). As doenças infecciosas, de uma maneira geral, são conhecidas por começar com a fixação do patógeno a um alvo particular no hospedeiro, como ocorre com a candidíase. A parede das leveduras do 4

gênero Candida, como C. albicans, não possui apenas a propriedade de conferir a forma estrutural à célula, mas também é o local onde se inicia a interação entre esse fungo e o meio ambiente (Calderone & Fronzi, 2001). Isso ocorre porque estas leveduras apresentam proteínas denominadas adesinas que permitem a sua adesão a elementos extracelulares, considerados receptores, como fibrinogênio, fibronectina e laminina, presentes nos tecidos humanos (Vardar-Ünlü, 1998, Calderone & Fronzi, 2001; Yang, 2003). Candida albicans pode se apresentar sob a forma de levedura ou filamentosa, o que caracteriza o seu dimorfismo (Brown & Gow, 1999; Ernst, 2000). A formação de hifas é considerada importante fator de virulência não apenas por promover a invasão da célula para o interior da mucosa, mas também por impedir que as células de Candida sejam englobadas por macrófagos e neutrófilos (Yang et al. 2003). A transição de leveduras para hifas pode ser influenciada pela temperatura, ph, fontes de carbono e substâncias químicas (Odds, 1988, Lan et al. 2002). Sua capacidade de mudar de fase de levedura para filamentosa é importante para uma maior interação com o hospedeiro, facilitando a adesão, e aumentando assim a sua virulência (Cutler, 1991). As células em forma de leveduras e de hifas podem estar presentes no hospedeiro não somente durante o processo de infecção, mas também durante o processo de colonização do fungo (Souza et al. 1990; Bartie et al. 2001). 5

As variações na morfologia de colônias de espécies de Candida, descritas principalmente em C. albicans, caracterizadas como fenômeno switching, parecem estar envolvidas no mecanismo de virulência dessas leveduras. Nesse fenômeno, a mudança fenotípica que se expressa pela morfologia, induz provavelmente alteração na fisiologia e na patogenicidade do microrganismo (Lian et al. 2003, Laffey & Butler, 2005). Esse mecanismo pode permitir que um organismo adaptado ao meio ambiente altere, através da expressão de um gene seletivo, a resposta fúngica frente aos agentes antifúngicos (Lachke et al. 2002; Miller et al. 2006). A produção de proteinase e da fosfolipase tem sido relatada como sendo um importante determinante de patogenicidade de C. albicans (Cutler, 1991; Pincus et al. 1999, Menezes et al. 2005). As proteinases têm afinidade por substratos tais como queratina, colágeno desnaturado, hemoglobinas, matriz celular e albumina (Rüchel et al. 1982; McDonalds & Odds, 1983; Ghannoun & Abu-Elteen, 1990; Culter 1991; Odds 1994, Ibrahim et al. 1995, Calderone & Fronzi, 2001) envolvidas em vários processos bioquímicos. Esses atributos estão associados a diversos fatores de virulência como formação de pseudomicélio, adesão e fenômeno switching, tornando mais complexos os mecanismos de patogenicidade de leveduras (Naglik et al. 2003, Naglik et al. 2004). O primeiro relato de fosfolipase em C. albicans foi publicado em 1966 (Werner, 1966). A presença de fosfolipases na superfície da levedura e na extremidade do pseudomicélio propicia a lesão tecidual por alterar os constituintes lipídicos da membrana celular do hospedeiro. Esta enzima tem 6

sido detectada em poucas espécies, como C. albicans e C. glabrata (Samaranayake et al. 1984; Banno et al. 1985; Hube, 1996; Ghannoum, 1998; Ghannoum, 2000). Williams et al. (1990) verificaram que 94% de C. albicans isoladas da cavidade bucal de pacientes com AIDS, foram produtoras de fosfolipase. Outras enzimas, como glucoamilase, fosfatase ácida e metalopeptidase, provavelmente correlacionadas com virulência podem ser encontradas em leveduras do gênero Candida (Naglik et al. 2003). 1.3 Manifestações clínicas As infecções decorrentes da ação patogênica de fungos do gênero Candida, denominadas candidíases, podem envolver a pele, as mucosas e órgãos internos atingindo algumas vezes o sistema sanguíneo. De acordo com o envolvimento do organismo no hospedeiro, a candidíase pode ser classificada em superficial e sistêmica. 1.3.1 Candidíase superficial A candidíase com envolvimento superficial acomete pele, unhas e mucosas orofaríngeas e genitais (Ghannoum, 2001). As infecções da pele se localizam principalmente em áreas intertriginosas úmidas, como os espaços interdigitais, os sulcos submamários, axilas e pregas suprapúbicas. As lesões se caracterizam por se apresentarem eritematosas, úmidas, com bordos mal definidos e escamosos formados por vesículas que se rompem precocemente. Em alguns casos, observa-se a presença de placas secas, escamosas e pústulas (Samanarayake et al. 2002). 7

A onicomicose, definida como infecção fúngica ungueal, representa 20% das doenças das unhas, sendo uma das mais freqüentes causas de onicopatias em todo o mundo (Arena & Ruiz-Esmenjaud, 2004). Essa infecção pode manifestar-se como um edema eritematoso da prega ungueal (paroníquia), ou como uma separação da placa ungueal do seu leito (onicólise). Esse tipo de infecção, segundo as recomendações da nomenclatura das infecções fúngicas proposta pela "Sociedade Internacional de Micologia Humana e Animal", quando o agente causal se trata de leveduras do gênero Candida, deve ser denominada candidoses ungueais (López-Jodra et al. 1999). Onicomicose por Candida spp afeta aproximadamente 5% da população mundial, sendo altamente freqüentes na América Latina (Arenas & Ocego 1997; Murray & Dawber, 2002) e representa em torno de 30% de todas as infecções micóticas superficiais (Migdley et al. 1994). A candidíase de mucosa bucal pode se apresentar sob quatro formas clínicas. A forma eritematosa, a qual é representada por áreas avermelhadas, localizadas principalmente no palato, língua e mucosa bucal. A pseudomembranosa, onde se observa a formação de lesões membranosas de cor branca à amarelada em toda a mucosa, a queilite angular que acomete as comissuras labiais com aspectos clínicos, que variam desde os fissurais a ulcerados e a candidíase hiperplásica que se apresenta sob a forma de placas ou nódulos esbranquiçados, firmemente aderidos às áreas da mucosa, podendo ocorrer na língua e ser confundida com a leucoplasia pilosa 8

(Cavassani et al. 2002). Lesões de mucosa bucal são frequentemente relatadas em pacientes imunocomprometidos, particularmente em AIDS. Candidíase vulvovaginal (CVV), processo inflamatório que acarreta corrimentos, pruridos, além de incômodos como ardência e dor ao urinar podem ser decorrentes de diversos fatores, como o abafamento da área vaginal, higiene pessoal inadequada, mudança de ph ou até mesmo o uso de contraceptivos (Ferrazza et al. 2005). A freqüência de CVV tem aumentado gradativamente, evoluindo de 0,5% em 1968 para 22,5% em 1998, época em que se tornou a causa mais comum de infecção vaginal (Adad et al. 2001). Atualmente, CVV está entre os principais problemas ginecológicos que afetam mulheres em idade reprodutiva, atingindo milhares de pessoas no mundo (Costa et al. 2004). Há estimativas de que provavelmente 55,7% de todas as mulheres terão pelo menos um episódio de vulvovaginite por Candida spp ao longo de suas vidas (Foxman et al. 2000). 1.3.2 Candidíase sistêmica Esse tipo de infecção ocorre quando o fungo se instala em diferentes órgãos do hospedeiro, com localização mais freqüente nos pulmões e trato urinário, sendo que em determinados indivíduos podem levar a candidemia (Galván & Mariscal, 2006). Uma das características mais importantes com relação à candidíase sistêmica é sua associação à altas taxas de mortalidade. A taxa média de mortalidade em pacientes com essa patologia nos Estados Unidos é de aproximadamente 38% (Beck-Sagué & Jarvis 1993), em Israel de 21,5% 9

(Rennert et al. 2000), na Espanha oscila entre 22 e 33,3% (Sota et al. 1999; Saballs et al. 2000), enquanto no Brasil é de aproximadamente 50% (Colombo et al. 1999). Em pacientes hospitalizados a combinação de vários fatores constitui riscos para candidíase invasiva e candidemia (Cantón et al. 2001). O uso de cateter, de antibióticos, nutrição parenteral, freqüentementes utilizados em pacientes internados contribuem para uma maior capacidade de invasão por leveduras do gênero Candida (Frazer et al. 1992; Franklin & Metry 1992; Fridkin & Jarvis, 1996). A incidência das infecções sistêmicas por Candida tem sido descrita principalmente em indivíduos hospitalizados, particularmente em unidade de terapia intensiva (Vincent et al. 1998), verificando-se um grande aumento nas últimas décadas. Segundo Schwesinger et al. (2005), em um hospital terciário alemão, de necropsias realizadas no período de 1994 1998, verificou-se uma incidência de 3% de candidíases invasivas e no período compreendido entre 1999 2003, a mesma passou a ser de 10%. 1.4 Infecções nosocomais por Candida spp. Infecções invasivas são consideradas importantes causas de morbidade e mortalidade em hospitais (Saleh & Al-Hedaithy, 2003, Boo et al. 2005). A tecnologia disponível na área médica e laboratorial, para diagnóstico e tratamento, além do aprimoramento das medidas de suporte de vida a pacientes críticos, particularmente os de unidade de terapia intensiva, possibilitaram uma maior sobrevida de portadores de doenças degenerativas 10

e neoplásicas, pós-cirúrgicos e de crianças prematuras, aumentando o risco à aquisição de infecções (Araújo, 1998, Antunes et al. 2005). Alterações na resposta imune do hospedeiro, rompimento de barreiras e exposição a vários antibióticos, rendem aos pacientes de UTI altamente suscetíveis, infecções da corrente sangüínea, do trato respiratório e urinário (Arantes et al. 2003). Um estudo realizado por Appelgren et al. 2001, em unidades de terapia intensiva, mostrou que 35% dos pacientes tiveram infecção nosocomial, sendo que 17% eram infecções da corrente sanguínea. Espécies de fungos pertencentes aos gêneros Candida e Aspergillus e a classe dos Zygomycetos são os responsáveis pela maioria dessas infecções (Anaisse et al. 1989; Wingard et al. 1991). É de grande interesse a elevada freqüência de candidíase detectada nos grandes hospitais. Diversos fatores concorrem para o aumento de infecções nosocomiais por Candida. Colombo & Guimarães (2003) identificaram azotemia, uso de cateter venoso central, uso de esteróides, cirurgia de grande porte, colonização por Candida spp. e hemodiálise, como fatores de risco associados em pacientes hospitalizados. Segundo esses autores, considerando os fatores de riscos mencionados, é possível entender porque a maior freqüência de candidemia tem sido documentada em indivíduos críticos admitidos em unidade de terapia intensiva. C. albicans é a principal espécie capaz de produzir candidemia (Colombo & Guimarães, 2003), mas outras espécies não-albicans, como C. parapsilosis, C. glabrata, C. krusei e C. tropicalis estão implicadas como agentes dessa 11

infecção (Colombo et al. 1999; Ellis et al. 2003; Marchetti et al. 2004, Medrano et al. 2006). O aumento de espécies não-albicans como agentes importantes de candidemia está ligado ao uso profilático, ou empírico, de agentes antifúngicos, com menor suscetibilidade a esses (Rodriguez & Moreira, 1999; Lewis & Klepser, 1999; Pfaller, 2000). As espécies de Candida podem causar o mesmo tipo de enfermidade, no entanto, a gravidade e as opções terapêuticas diferem entre as distintas espécies e dentro da mesma espécie (Sandven, 2000; Cantón, 2001), justificando o uso dos testes de suscetibilidade in vitro para uma terapia adequada. 1.5 Tratamento Anfotericina B é considerada o padrão ouro da terapia antifúngica. Esse fármaco é um antibiótico macrolideo com atividade antifúngica frente a numerosas espécies de fungos como Candida, Cryptococcus, Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis e Aspergillus. É um antifúngico altamente lipofílico, sendo administrado em associação à desoxicolato. A sua principal limitação no emprego clínico é decorrente de seus efeitos secundários, dos quais um dos mais graves é a nefrotoxicidade (López- Medrado et al. 2005). O tratamento das infecções fúngicas tem sido também realizado com derivados azólicos, como fluconazol, itraconazol, voriconazol, ou ainda com cancidas, como caspofungina, equinocandina e micafungina, os quais apresentam maior facilidade na sua administração, e menores efeitos 12

colaterais do que os observados para anfotericina B (Ayeni et al. 1999; Berrouane et al. 1999; Sheehan et al. 1999). A pouca toxicidade, fácil administração e eficácia no tratamento têm resultado no uso abusivo de fluconazol, o que provavelmente possibilitou o desenvolvimento da resistência desse antifúngico em espécies de Candida (Rex et al. 1995; Rex & Pfaller 2002). As infecções invasivas por C. glabrata, principalmente em indivíduos transplantados, têm ocorrido com altos índices de mortalidade devido ao uso de fluconazol como profilático. Candida krusei é considerada intrinsecamente resistente a este derivado azólico (Abi-Said et al. 1997; Bodey et al. 2002). Em casos de candidíase que não respondem ao tratamento com fluconazol e itraconazol, tem sido instituído o uso de voriconazol com boa eficácia (Lozano- Chiu et al. 1999; Pfaller et al. 2002). Voriconazol é um agente antifúngico triazólico de segunda geração, com amplo espectro, sendo derivado sintético do fluconazol. As modificações introduzidas na molécula de voriconazol resultaram em uma maior afinidade à enzima 14-α-lanosterol demetilase e no aumento do espectro de ação. Voriconazol exibe um amplo e potente espectro de ação contra os fungos: C. albicans, Aspergillus sp, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Scedosporium spp., Fusarium spp., Penicillium marneffei, Trichosporon spp. e Saccharomyces cerevisae (Sabo & Abdel- Rahmanl, 2000; Bizarro & Dinis, 2003, Gimeno & Martinez, 2007), podendo apresentar atividade contra isolados que são resistentes ao fluconazol, itraconazol e anfotericina B. 13

As equinocandinas, pertencente ao grupo das candinas, possuem três agentes antifúngicos, caspofungina, micafungina e anidulafungina, sendo fármacos que inibem a síntese da β-1,3-d glucana, componente da parede celular de muitos fungos filamentosos e de leveduras (Bergold & Georgiadis 2004). A sua ação na parede faz com que esses agentes antifúngicos tenham maior facilidade de ação sobre os fungos sem haver interferência no hospedeiro e dessa forma são menos tóxicos para o paciente (Gimeno & Martinez, 2007). A caspofungina, licenciada para uso clínico, é um derivado semi-sintético da pneumonocandina B, única equinocandina aprovada nos Estados Unidos, indicada no tratamento de candidíase, onde as espécies de Candida respondem a este antifúngico, inclusive as resistentes ao fluconazol (Deresinski & Stevens, 2003). Resultados de estudos de caspofungina na candidíase invasiva e na candidemia sugerem equivalente eficácia à anfotericina B, mas com menos efeitos tóxicos (Abuhammour & Habte-Gaber, 2004). Em um estudo realizado por Odio et al. (2004) foi avaliado o tratamento com caspofungina em 10 recém-nascidos, com candidíase invasiva, causada por C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis e C. glabrata. Embora tivesse sido registrada resistência ao fluconazol nas espécies não-albicans e em dois casos de C. albicans, bem como resistência a anfotericina por C. glabrata, a caspofungina mostrou-se com elevada eficácia, no tratamento da candidíase destas crianças. 14

Embora haja boa resposta às terapias com diferentes agentes antifúngicos no tratamento de candidíase, para pacientes de UTI há uma enorme dificuldade na eficácia, pois além da sintomatologia das infecções fúngicas ser totalmente inespecífica nesses pacientes dificultando o diagnóstico, a debilidade do hospedeiro leva a uma diminuição na resposta ao agente antifúngico (Muñoz et al. 2000). Nesses pacientes, a utilização de antifúngicos se tem restringido àqueles com infecções fúngicas documentadas ou com um alto risco de apresentar infecções por esses fungos (Wade, 1993; Pizzo, 2000), para evitar o desenvolvimento de resistência aos antifúngicos. Com a crescente incidência das infecções fúngicas sistêmicas, o aumento do número de agentes antifúngicos além do aparecimento de isolados resistentes, torna-se necessário à seleção adequada do antifúngico, o que pode ser realizado através dos testes de suscetibilidade. 1.6 Suscetibilidade antifúngica in vitro A utilização dos testes de suscetibilidade antifúngica in vitro para que seja realizado um tratamento rápido, adequado e eficaz, tornou-se necessária devido às constantes resistências detectadas em diferentes fungos (Colombo, 1994; Zardo & Mezzan, 2004; Yang et al. 2005; Magill et al. 2006) Na última década, foram padronizados vários métodos para provas de sensibilidade in vitro a antifúngicos e alguns deles são atualmente indicados como referência, servindo para validar outras provas, incluindo àquelas comerciais. 15

Alguns testes preconizados para detectar resistência a antifúngicos, têm mostrado boa reprodutibilidade intra e interlaboratorial, além de correlação com a evolução clínica dos pacientes. O National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), atual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), publicou o documento M27-A2, para provas de suscetibilidade a antifúngicos em leveduras como método de referência (NCCLS/CLSI, 2002). Esse documento contém técnicas de macro e microdiluição em caldo para determinar a concentração inibitória mínima (CIM). Elas foram desenvolvidas para testes com leveduras dos gêneros Candida e Cryptococcus, frente à anfotericina B, 5-fluorocitosina e azólicos, incluindo cetoconazol, fluconazol, itraconazol, posaconazol, ravuconazol e voriconazol. Os possíveis fatores como meio de cultura, ph, temperatura de incubação e leitura do teste, que podem causar erros na determinação da CIM são padronizados neste método (NCCLS/CLSI, 2002). Um outro método do CLSI foi descrito no documento M44-A que descreve uma prova sensível e prática, validada para testes de suscetibilidade em Candida spp., utilizando discos impregnados com fluconazol ou com voriconazol. O documento inclui critério de interpretação para os diâmetros de halos obtidos com discos de fluconazol e valores esperados para cepaspadrão permitindo verificar a concentração inibitória mínima (NCCLS/CLSI, 2004). Testes de suscetibilidade in vitro aos antifúngicos são realizados por vários sistemas comerciais, incluindo, dentre outros, ASTY (Kyokyuto Pharma- 16

Centical, Japão), ATB Fungus 2 (Api-bioMérieux, França), Candifast (International Microbio, Itália), Etest (AB-Biodisck, Suécia), Fungitest (Bio-Rad, Farança), Integral Systems Yeast (Liofilchen Diagnostics, Itália), Mycostandard (Institut Pasteur, França), Mycototal (Behring Diagnostic, França) e Sensititre YeastOne (Trek Diagnostic System, EUA) (Arikan & Akova, 1997; Morace et al. 2002; Bae et al. 2004; Durussel et al. 2004; Lombardi et al. 2004; Carrillo- Muñoz et al. 2006). Dentre os sistemas comerciais estudados, apenas alguns demonstraram potencial suficiente para se constituir em uma alternativa para os laboratórios assistenciais, como o Sensititre YeastOne e o Etest, os quais mostraram boa reprodutibilidade e indiscutível capacidade em detectar a resistência in vitro aos azóis, sobretudo ao fluconazol, quando comparados aos métodos de macro e microdiluição para leveduras (Lombardi et al. 2004; Carrillo-Muñoz et al. 2006). Sensititre YeastOne é um método de microdiluição em caldo baseado no documento M27-A2, que consiste de uma placa de microtitulação descartável, que contém diluições seriadas desidratadas de seis agentes antifúngicos, incluindo anfotericina B, fluconazol, itraconazol, cetoconazol, voriconazol e 5-fluorocitosina, em cavidades individuais. As cavidades contêm azul de Alamar como indicador colorimétrico, o qual melhora a leitura do ponto de corte mediante mudança de cor azul para rosa. Os resultados são expressos em CIM e estudos comparativos com os métodos NCCLS/CLSI mostraram-se concordantes (Chaturvedi et al. 2004). 17

O Etest, método de difusão em ágar, utiliza uma tira contendo um gradiente de concentração do agente antimicrobiano em estudo permitindo a determinação de CIM. Este método é disponível para detectar a CIM de anfotericina B, 5-fluorocitosina, cetoconazol, itraconazol, voriconazol, fluconazol e caspofungina para leveduras dos gêneros Candida e Cryptococcus e para alguns fungos filamentosos (Denning et al. 1997; Clancy & Nguyen, 1999; Fernandes et al. 2003; Costa et al. 2004). Trabalhos experimentais têm demonstrado concordância de Etest com os resultados encontrados pelo NCCLS/CLSI (Hazen et al., 2003; Pfaller et al., 2003). 1.6.1 Resistência aos antifúngicos Os derivados azólicos, como fluconazol e itraconazol, largamente utilizados para o tratamento de candidíase, atuam inibindo a C14α demetilase, uma citocromo P-450 acarretando o acúmulo de esteróides metilados e diminuição da síntese do ergosterol. Essa enzima inibe a produção de ergosterol, que é o principal constituinte da membrana celular do fungo, com conseqüente inibição do crescimento celular (Hitchocock et al. 1993; Vanden Bossche, 1997; Manavathu et al. 1999, Nenoff et al. 1999; Burgess et al. 2000; Bizarro & Dinis, 2003). Alguns isolados de fungos podem apresentar resistência aos derivados azólicos. São conhecidos três mecanismos de resistência aos azólicos. 1- Redução do acúmulo intracelular do fármaco resultante da utilização reduzida deste agente antifúngico ou do aumento da efluxo do fármaco devido à ação de produtos de genes de resistência aos antifúngicos, 2- Alteração estrutural da enzima C14α- 18

demetilase, resultando em uma diminuição na sua ligação aos azólicos, 3- Aumento da produção de 14α-demetilase, superando o efeito inibidor dos azólicos (Nenoff et al. 1999; Gao et al. 2003). A resistência aos derivados azólicos pode ser influenciada pela imunossupressão dos pacientes e uso prolongado do agente antifúngico (Yang et al. 2003). O uso freqüente de terapia antifúngica em pacientes imunocomprometidos, em decorrência de constantes recidivas de candidíase, é o fator que provavelmente tenha maior influencia na ocorrência de resistência a diferentes fármacos e selecionando espécies. Espécies de Candida como C. glabrata e C. krusei, têm se mostrado resistentes ao fluconazol devido ao uso prolongado desse agente antifúngico (Abbas et al. 2000; Kauffman et al. 2000; Taylor et al. 2000; Colombo et al. 2002; Trick et al. 2002). Segundo Barchiesi et al. (2002), pacientes infectados pelo HIV que fazem uso de terapia antiretroviral altamente ativa (HAART) freqüentemente apresentam leveduras na cavidade bucal resistentes ao fluconazol. Há poucos relatos de resistência de espécies de Candida frente ao voriconazol. Takakura et al. (2004) relataram que 100% dos isolados de C. krusei e 60% de outras espécies não-albicans, com baixa suscetibilidade ao fluconazol, foram suscetíveis ao voriconazol. A anfotericina B pertence à ampla família dos macrolídeos poliênicos e atua ligando-se ao ergosterol da membrana celular fúngica, alterando sua permeabilidade o que acarreta desequilíbrio osmótico, pela perda de íons intracelulares e conseqüentemente lise e morte das células (Vanden Bossche, 19

1997). A resistência de leveduras à anfotericina B é raramente detectada. A resistência a anfotericina B por isolados de C. lusitaniae e C. tropicalis, assim como de alguns fungos filamentosos como Trichosporon spp. e Fusarium spp tem sido descrita (Vanden Bossche, 1997; Godoy et al. 2003; Antunes et al. 2005). Diferenças na suscetibilidade, importante característica fenotípica de um determinado patógeno aos agentes terapêuticos, pode ser detectada pela variabilidade genética existente entre os isolados (Cirak et al. 2003; Schaller et al. 2005). 1.7 Métodos moleculares Várias técnicas de tipagem molecular têm sido utilizadas para caracterização de diferentes microrganismos produtores de infecções no ser humano (Voss et al. 1995; Lian et al. 2003). Esses procedimentos podem responder questões relacionadas à patogênese do fungo, detecção de microepidemias, distinção de infecção primária ou recidiva, à similaridade entre as diferentes cepas e a tentativa de relacionar o isolado à fonte de infecção (Merz, 1990; Voss et al. 1995; Soll, 2000; Lian et al. 2003). A caracterização dos isolados de leveduras inclui métodos de tipagem molecular, análise do DNA polimórfico amplificado aleatoricamente (RAPD), métodos de fingerprinting, análise de fragmentos de DNA gerados por enzimas de restrição (RFLPs) e hibridação por Southern blot do DNA (Andrigheto et al. 2000; Dassanayake et al. 2000; Ergon & Gülay, 2004). 20

A cariotipagem por eletroforese de campo pulsado é considerada útil devido ao seu alto poder discriminatório, sendo utilizada para diferenciação intra e interespecífica de leveduras, devido a grande variedade no tamanho e número de seus cromossomos (Dassanayake et al. 2000; Cirak et al. 2003). Dentre as técnicas moleculares, o RAPD tem sido usado no estudo da variabilidade entre espécies (Uijthof et al. 1994; Molnár et al. 1996). A detecção e exploração de seqüências de polimorfismos de DNA ocorridos naturalmente representam um dos mais significativos desenvolvimentos na biologia molecular. O método RAPD tem sido bastante utilizado principalmente pela vantagem de ser simples e rápido (Tavares et al. 1992). O RAPD requer uma pequena quantidade de DNA e permite a visualização de um grande número de marcas polimórficas. O uso de RAPD tem-se mostrado útil nos estudos de microrganismos para o quais não se tem muita informação genética. A técnica é baseada na amplificação de fragmentos não específicos de DNA, em reações sucessivas de polimerização. Como descrito por Williams et al. (1990), os oligonucleotídios são construídos com seqüências aleatórias, ao contrário da PCR fingerprinting, revelando polimorfismos em toda a extensão do genoma. Tais polimorfismos são reconhecidos pela presença de um fragmento amplificado em um dos genomas em relação à ausência desse mesmo fragmento em outro. O desenvolvimento da técnica de RAPD representou um marco na caracterização molecular de diversos microrganismos, especialmente para 21

identificação de espécies microbianas, quando pequenas seqüências genômicas são avaliadas (Ergon & Gülay, 2004; Pinto et al. 2004). A análise de RAPD é projetada para caracterizar isolados dentro de uma mesma espécie (Melo et al. 1998; Cirak et al. 2003) e para enfoques epidemiológicos evidenciando uma relação entre fonte ambiental e manifestações clínicas (Soll, 2000; Lian et al. 2003). Essa técnica, além de gastar menos tempo, é de fácil aplicabilidade e os resultados têm demonstrado o alto poder discriminatório e eficácia (Soll, 2000). A análise de RAPD tem também sido usada em vários estudos em que é investigada a relação clonal entre diferentes espécies de Candida obtidas de vários espécimes de pacientes hospitalizados em diferentes unidades hospitalares, incluindo unidade de terapia intensiva (Arif et al. 1996; Hedderwick et al. 2000). A análise de RAPD foi usada por Pinto et al. (2004), para verificar a variabilidade genômica de 37 isolados obtidos de diferentes regiões do corpo de 11 pacientes imunocomprometidos infectados com o HIV, permitindo verificar polimorfismo intra e inter específicos entre isolados de um mesmo paciente e entre os isolados de diferentes pacientes. Em experimentos utilizando diferentes materiais clínicos de um mesmo indivíduo, usando RAPD para tipagem de C. albicans isoladas de pacientes de UTI, Vrion & Matsiota-Bernard (2001) conseguiram estabelecer a natureza endógena de 17 isolados desta espécie. Em isolados clínicos de C. parapsilosis, Dassanayake et al. (2000) observaram através de RAPD variações genéticas intra-espécies, as quais foram verificadas pelos padrões 22

diferentes de bandas. Esses experimentos demonstram a capacidade desse método em determinar a epidemiologia de infecções por Candida. PCR fingerprinting utiliza oligonucleotídeos que são específicos para seqüências curtas e repetitivas hipervariáveis de leveduras, permitindo que isolados sejam identificados com sensibilidade suficiente para detectar diferenças inter e intra espécies (Dassanayake et al. 2000; Meyer et al. 2001). Esse método, devido à sua eficácia, é usado com freqüência, pois permite verificar a epidemiologia de fungos envolvidos em infecções nosocomiais (Schönian et al. 1993; Dassanayake et al. 2000). A técnica de RFLP é utilizada para caracterizar microrganismos pelos padrões derivados da clivagem de seu DNA, cujos comprimentos dos fragmentos produzidos podem diferir quando o DNA é digerido com diferentes enzimas de restrição. Os padrões de bandas gerados podem ser usados para diferenciar uma espécie de outra (Irobi et al. 1999; Mirhendi et al. 2005). 23

2 JUSTIFICATIVA Como exposto anteriormente, o aumento da incidência das infecções fúngicas nosocomiais nas últimas décadas, faz com que esse tema seja abordado por muitos pesquisadores. O registro de maior incidência dessas infecções é observado principalmente em indivíduos imunocomprometidos, como pacientes com AIDS, transplantados de medula óssea e órgãos sólidos, nos submetidos à quimioterapia e naqueles que permanecem longos períodos em hospitais essencialmente nos pacientes de UTI (Hazen 1995, Voss et al. 1995). A maior sobrevivência detectada nestes indivíduos induz a aquisição de infecções oportunísticas como a candidíase. Em pacientes imunocomprometidos com granulocitopenia acentuada, há um risco maior de infecções sistêmicas por Candida, como a candidemia (Medrano et al. 2006). A identificação da espécie de Candida, nos últimos anos, tem-se mostrado de grande importância, pois tem sido verificada uma tendência de mudança de etiologia da candidíase. Apesar de C. albicans ser o agente etiológico mais comumente identificado, espécies não-albicans, têm-se mostrado predominantes (Brilhante et al. 2005, Menezes et al. 2005). As infecções observadas em diferentes casuísticas estudadas em pacientes de unidade de terapia intensiva mostram as espécies de Candida não-albicans como responsáveis por altas taxas de morbidade e mortalidade (Aquino et al. 2005). O tratamento rápido de candidíase, provavelmente faz com que diminua os casos de mortalidade. A eficácia do agente antifúngico pode ser detectada através da realização prévia de testes de suscetibilidade in vitro, pois há 24

alguns microrganismos que podem ser resistentes aos diferentes antifúngicos. O teste de suscetibilidade de diluição em caldo, preconizado pelo CLSI, proporciona na maioria das vezes, bons resultados de leitura de end-point. Tem sido descrito que há uma concordância in vitro e in vivo dos resultados de suscetibilidade, principalmente quando se refere a detecção de resistência. Há vários fatores que interferem na aquisição de candidíase nos pacientes de UTI. Eliminar os fatores endógenos é uma tarefa difícil, mas fatores exógenos podem perfeitamente serem contornados, o que provavelmente evitaria vários casos de candidíase nosocomial. Sendo assim, a verificação das características moleculares, usando testes como o RAPD, que permite diferenciação intra-espécie torna-se de grande valia para o auxílio de determinação dessas fontes exógenas ou endógenas, contribuindo na prevenção de candidíase. 25

3 OBJETIVOS 3.1 Objetivo Geral Identificar e caracterizar leveduras do gênero Candida de fômites (cateter, mesa de Meyer e cama) e amostras clínicas (sangue e urina) de pacientes da unidade de terapia intensiva do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás. 3.2 Objetivos específicos a. Isolar e identificar fungos presentes na corrente sangüínea e urina de pacientes da UTI. b. Avaliar a prevalência das espécies de Candida presentes na corrente sangüínea e na urina e detectar os fatores de riscos para candidemia e candidúria em pacientes da UTI. c. Avaliar o padrão de suscetibilidade in vitro de amostras de Candida isoladas do sangue dos pacientes frente à anfotericina B, fluconazol, itraconazol e voriconazol. d. Analisar os isolados de C. albicans genotipicamente, tentando correlacionar os padrões de DNA obtidos de amostras clínicas e ambientais da Unidade de Terapia Intensiva. 26

4 PRODUÇÃO CIENTÍFICA a. ARTIGO 1: Candida colonization in intensive care unit patienst s urine b. ARTIGO 2: Species distribution and antifungal susceptibility patterns of Candida spp. bloodstream isolates from a Brazilian tertiary care hospital c. ARTIGO 3: Molecular epidemiological analysis of bloodstream of Candida albicans d. ARTIGO 4: Nosocomial invasive infection caused by Cunninghamella bertholletiae: case report 27

4.1 ARTIGO 1: Candida colonization in intensive care unit patienst s urine 28

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4.2 ARTIGO 2: Species distribution and antifungal susceptibility patterns of Candida spp. bloodstream isolates from a Brazilian tertiary care hospital. 33

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4.3 ARTIGO 3: Molecular epidemiological analysis of bloodstream of Candida albicans 41

Molecular epidemiological analysis of bloodstream of Candida albicans Xisto Sena Passos 1, Werther Souza Sales 2, Carolina Rodrigues Costa 2, Janine de Aquino Lemos 2, Lúcia Kioko Hasimoto e Souza 2, Keili Souza 2, Luiz Augusto Pereira 3, Maria do Rosário Rodrigues Silva 2,4 1 Universidade Paulista, Goiânia, GO; Brazil; 2 Instituto de Patologia e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás, GO, Brazil, 3 Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás, 4 Rua 15, no. 108 Apto. 700, Setor Oeste, Goiânia, GO, 74.140-090, Brazil Summary: Candidemia is generally related to the endogenous flora but exogenous infection originating from hospital staff or from the environment has been determined as occurring. The randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) method can reveal strain specific variation. In this work, we used a RAPD assay to assess genetic diversity among C. albicans isolates in an effort to find the relatedness between DNA patterns of the strains recovered from clinical and environment samples from the ICU from the Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás. The primers named Cnd3 (5 -CCAGATGCAC-3`) and Cnd4 (5 -ACGGTACACT-3`) were used as single primers in the PCR. RAPD profiles from blood and urine from the same patient were identical in almost all samples studied, except for one patient. The bed of this patient had the same genotype from his blood. Although most of C. albicans isolates probably had had an endogenous origin, the finding of isolates from the patients with same profile as the environment isolates suggest that the candidemia may be resulted from an exogenous source. Key words: Candida albicans, PCR, RAPD, nosocomial infection Correspondence: Dra. Maria do Rosário Rodrigues Silva. Rua 15, n o. 108 Apto. 700, Setor Oeste. 74.140-090 Goiânia GO, Brasil. Phone: 55 62 3209-6127; Fax: 55 62 3202-3022. E-mail: rosario@iptsp.ufg.br 42

Introduction Candida septicemia is considered as fungal major nosocomial infection and it is largely associated with a least a 50% mortality rate [1,2,3]. ICU patients are particularly susceptible to systemic infection because they are seriously ill and are subjected to a number of therapeutic and supportive interventions (central venous catheters, mechanical ventilations and tracheostomy), which breach physiological barriers to infection [4,5]. Although the yeast species are considered important nosocomial pathogens, little is known of their epidemiology. Candidemia is generally related to the endogenous flora but exogenous infection originating from hospital staff or from the environment has been determined as occurring [5]. In cases in which an exogenous source is involved, the sanitary measures are mandatory to prevent the crosstransmission of C. albicans. Molecular typing system can be employed to characterize the pathogen to the subspecies level or still to determine whether the infections studied are due to same strain or due to different strains [3,6,7]. The randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) method, that use specific short oligonucleotide primers which can be arbitrarily primed at multiple positions of the yeast genome, can reveal strain specific variation. This method has been used to characterize the genetic relations among Candida species isolates [8,9]. In this work, we used a RAPD assay to assess genetic diversity among C. albicans isolates in an effort to find the relationship between DNA patterns of the strains recovered from clinical and environment samples from the ICU from the same hospital over a period of one year. 43

Materials and Methods Isolates and patients. A total of 10 C. albicans isolates recovered from blood specimens of 10 patients of the ICU from a tertiary hospital between March 2004 and April 2005 were included in this study. Isolates of the same species recovered from other sources related to these patients such as urine, catheter besides isolates from environmental sources as of surface of bed and from Meyer table collected on the same day were also taken in this study. The sources of isolates studied are related in table 1. The isolates were identified by conventional sugar assimilation and fermentation methods and the germ-tube formation and confirmed by the commercially available API 20C identification test (API Laboratory Products Ltd., Grafton Way, Basingstoke, Hants, England). All isolates were maintained in sterile water at 20 o C and the purity of cultures was ensured by regular identification using standard techniques. Genotypic characterization Preparation of DNA for randomly amplified polymorphic DNA (RAPD). Yeasts obtained from stock cultures were sub-cultured on yeast-peptone dextrose medium (1% yeast extract peptone, 2% glucose, 1.2% agar) at 37 o C for 24 to 48 hours. Genomic DNA extraction was based on the method described by Del Poeta et al. 1999 [10] modified by Casali et al. 2003 [11]. Briefly, a heavy inoculum of C. albicans strains grown in YEPD agar (Yeast Extract Peptone Dextrose) were suspended in 0.5 ml TENTS (10 mm Tris, ph 7.5, 1 mm EDTA ph 8.0, 200 mm NaCl, 2% Triton, 1% SDS) containing 0.2 ml of 0.45 mm glass beads and 0.5 ml of 44

phenol:chloroform and vortexed for 2 min. After the centrifugation for 10 min at 13000 g, the aqueous phase transferred to a new tube and the same volume of 100% ethanol was added and incubated at -20 o C for 1 h for DNA precipitation. The precipitated DNA was resuspended in 0.5 ml TE (10 mm Tris HCl ph 8, 1 mm EDTA ph 8.0) containing 50 µg/ml RNAse A, and incubated at 37 o C for 30 min. The yeast DNA was deproteinated and extracted from the sample by adding equal volume of phenol and chloroform. Finally, the DNA was precipitated with 70% ethanol and after dryed, stored at-20 o C in 100 μl of TE buffer until further processing for PCR. RAPD analysis The primers named Cnd3 (5 -CCAGATGCAC-3`) and Cnd4 (5 -ACGGTACACT-3`) were used as single primers in the PCR. Amplifications reactions as described by Ergon & Gülay [12], were performed in volumes of 25 μl including about 25 ng of the DNA template; 10 mm Tris-HCl, ph 8.3, 50 mm KCl, 1.5 mm MgCl, 0.2 mm each of the datp, dctp, dgtp and dttp and 2.5 U Taq DNA polymerase (Invitrogen). The primers were used at a concentration of 30 ng. Amplification was performed in a PCR MJ Research Thermal Cycler model PTC-100 TM programmed for denaturation at 94 º C for 3 min; 45 cycles of 1 min at 94 º C, 1 min at 36 º C and 2 min at 72 º C, and extension at 72 0 C for 7 min. Amplification products were separated by electrophoresis in 1.2% agarose gel containing 1x tris-borate-edta (TBE) buffer, stained with ethidium bromide at 0.5 μg/ml and visualized under UV light. All amplifications were reapeated at least twice. 45

PCR profile analysis The banding profiles for each isolate were compared visually. Bands were recorded as present (1) or absent (0). Simple matching s similarity coefficient (SM) values for each pair wise comparison between isolates were calculated and a similarity coefficient matrix was constructed. An SM value of 1.00 represented the same genotype; SM values between 0.80 and 0.99 represented clonally related isolates and SM under 0.80 represented distinct strains [12]. Clonally related isolates are presented as of the same pattern added of ` (e.g. A and A for Cnd3 and 1 and 1 for Cnd4). Results A total of 31 C. albicans isolates (10 of blood, 9 of urine, 5 of catheter, 4 of Meyer table and 3 of bed) were submitted to molecular typing using the RAPD method. Both two primers (Cnd3 and Cnd 4) used in this study were successful in eliciting banding profiles for each isolate. Amplification products obtained were specific to each primer and ranged from 4 to 8 bands with fragment size from 350 bp to 2000 bp for Cnd3 and from 3 to 6 bands with fragment size from 300 bp to a 3500 bp for Cnd4. Most of the major bands were present in all isolates studied and almost all strains had a conserved fragment: 650 Kb for both primers (Figs 1 and 2). Both two primers had high discriminatory power. Among 31 C. albicans isolates, 12 patterns were detected with primer Cnd3 and 14 patterns with Cnd4 (Table 1). The similarity coefficients for Cnd3 between profiles A-L were calculated and ranged from 28% to 85%. Some strains had closely related patterns. The isolate 7 (A ) had high similarity with the isolates 4, 5 and 6 (A), the isolate 24 (F ) with isolates 23 and 25 (F) and the isolate 34 (B ) with the isolates 10 and 11 (B). The 46

similarity coefficients for Cnd 4 between the profiles 1-14 ranged from 16 to 80%. Profiles 1 to 15 were clearly different from 15 previously identified. RAPD profiles from blood and urine from the same patient were identical in almost all sample studied, except for patient 5, where the two clinical samples were different by using the two primers. However it was observed that the isolate from the bed of this patient (5) had a similar genotype as the one isolated from his blood. Another interesting fact was verified with isolates 12 (surface of Meyer table of patient 3) and 40 (bed of patient 8) of C. albicans. These isolates presented had the same genotype when isolated from blood and urine of their patients. Additionally, it was detected the same genotype in isolates, 19 (catheter from patient 4), 32 (bed from patient 6) and 42 (catheter from patient 9) Discussion Although nosocomial candidemia constitutes a growing issue, [3] it is quite difficult to achieve a precise understanding of its epidemiology. Colonization precedes candidemia and it is considered to be an important risk factor in endogenous infections [13]. Tortorano et al. 2004 [14] showed a previous colonization of the alimentary tract by the same Candida specie causing fungaemia. Candidemia has been relationship with previous colonization of the urinary tract [15]. Urinary tract colonization deserves consideration, because it is a common event in hospitalized patients affecting 6.5-20% of patients [16]. In this work, molecular typing demonstrated that the paired isolates from blood and urine were identical for patients with C. albicans, suggesting an endogenous origin of candidemia. It is well known that exogenous sources of C. albicans may be involved in the development of nosocomial candidiasis [17]. In this study, it was found that strains of 47

C. albicans isolated from the blood of patients 5 and 8 were identicals to isolated from surface of their beds. Besides, identical strains were isolated from blood of patient 3 and surface of Meyer table (table 1). These samples from environment were collected on the same day of blood collection of patients with candidemia. Robert et al. 1995 [18] characterized strains of C. albicans colonized on admission as identical to other patient that was culture negative on admission and acquired the yeast after 25 days, suggesting cross infection. The epidemiology of nosocomial C. albicans isolates infection is complex and the mechanism by which the patients in our study acquired their strains remains not totally clear. However the finding of three isolates from the blood of patients with the same molecular profile as the ones isolated from the environment isolates suggest that the candidemia may be resulted from exogenous source. Exogenous acquisition of candidemia is also postulated to be associated with intravascular devices and parenteral nutrition. The candidemia related to catheter has been suggested by some researchers [19, 20]. The isolates from catheter and blood of patient 6 had the same genotype, suggesting that the portal of entry of C. albicans was via the catheter. Interestingly, molecular typing, demonstrated that isolates of catheter from patient 4 (isolate 19), of bed from patient 6 (isolate 32) and of catheter from patient 9 (isolate 42) also had the same genotypes. These results may infere in cross infection. It is possible that C. albicans strains recovered in catheter or surface of bed was arised from hands of hospital coworkers. The 12 and 14 different patterns presented by primers Cnd3 and Cnd4 respectively, confirm the discriminatory value of RAPD, which is considered quite similar to other powerful genotyping methods [3,5]. The RAPD assay using primers 48

Cnd3 and Cnd4 can be an important tool to identify the intra-specific genetic variability among C. albicans isolates. In conclusion, although candidemia was strongly associated to endogenous sources as candiduria, it was indicated that catheter, surface of bed and Meyer table can also be considered important exogenous sources of infection. ACKNOWLEDGMENTS The financial help received by the first author from the Universidade Paulista Brazil. REFERENCE 1. Meunier F, Aoun M, Bitar N. Candidemia in immunocompromised patients. Clin Infect Dis 1992; 14:120-125. 2. Giammanco GM, Lopes MM, Coimbra RS, Pignato S, Grimont PAD, Grimont F, et al. Value of morphotyping for the characterization of Candida albicans clinical isolates. Mem Inst Oswaldo Cruz 2005; 100: 483-490. 3. Shin JH, Og YG, Cho D, Kee SJ, Shin MG, Suh SP et al. Molecular Epidemiological Analysis of Bloodstream Isolates of Candida albicans from a University Hospital over a Five-Year Period. J Microbiol 2005; 43:546-554. 4. Pfaller MA. Epidemiology of Nosocomial candidiasis: the importance of molecular typing. Brazilian J Infect Dis 2000; 4:161-167. 5. Vrioni G, Matsiota-Bernard P. Molecular typing of Candida isolates from patients hospitalized in an intensive care unit. 2001; J Infect. 42:50-56. 6. Mehta SK, Stevens DA; Mishra S, Feroze F, Pierson DL. Distribution of Candida albicans genotypes among family members - demonstration by sequential DNA fingerprinting with probes Ca3, C1 and CARE2. Diag Microbiol Infect Dis 1999; 34:19-25. 49

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Table 1. Candida albicans isolates recovered from 10 ICU patients with candidemia and from other clinical and environment materials relationship to these patients. Isolation date Genotype (patterns) Patients Isolates Sources of isolates (mo/day/yr) Cnd3 Cnd4 1. 09/12/2003 4-112A3E Catheter A 1 09/26/2003 5-112C6E Blood A 1 09/19/2003 6-112B7E Urine A 1 09/23/2003 7-112C1A Meyer table A 2 2. 12/18/2003 10-159C6A Blood B 3 12/12/2003 11-159B7A Urine B 3 3. 12/15/2003 12-164A1A Meyer table C 4 12/15/2003 13-164A6A Blood C 4 12/15/2003 14-164A7A Urine C 4 4. 01/06/2004 15-174B1E Meyer table C 4 01/06/2004 17-174B6A Blood D 5 01/06/2004 18-174B7A Urine D 5 01/06/2004 19-174B2A Catheter E 6 5. 05/31/2004 23-231I6A Blood F 7 05/17/2004 24-231G7A Urine F 8 05/31/2004 25-231I2E Bed F 7 6. 04/05/2004 30-234A3E Catheter G 9 04/05/2004 31-234F6A Blood G 9 04/05/2004 32-234A2A Bed E 6 7. 08/11/2004 34-280C1E Meyer table B 10 08/18/2004 35-280D6A Blood H 11 08/04/2004 36-280B7E Urine H 11 8. 10/29/2004 37-315A6E Blood I 12 11/19/2004 38-315D7E Urine I 12 10/29/2004 39-315A3E Catheter J 12 10/29/2004 40-315A2E Bed I 12 9. 11/10/2004 42-320A3E Catheter E 6 11/10/2004 43-320A6E Blood K 13 11/10/2004 44-320A7A Urine K 13 10. 05/04/2005 45-365B6A Blood L 14 05/04/2005 46-365B7A Urine L 14 52

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 MM 12000 5000 2000 1650 1000 850 650 500 400 Figure1. RAPD Profiles of 31 Candida albicans isolates obtained with primer Cnd3. Profile A (lines 1-3: catheter, blood and urine related with patient 1); profile A (line 4: table Meyer related with patient 1); profile B (lines 5, 6: blood and urine related with patient 2); profile C (lines 7, 8, 9 and 10: table Meyer, blood and urine related with patient 3 and table Meyer related with patient 4); profile D (lines 11, 12 blood and urine related with patient 4); profile E (lines 13,19, 27: catheter related with patient 4, 19 bed related with patient 6, 27 catheter related with patient 9, respectively); profile F (lines 14, 16: blood and bed related with patient 5); profile F (line 15: urine related with patient 5); profile G (lines 17, 18: catheter and blood related with patient 6); profile H (lines 21, 22: blood and urine related with patient 7); profile I (lines 23, 24, 26: blood, urine and bed related with patient 8); profile J (line 25: catheter related with patient 8); profile K (lines 28, 29: blood and urine related with patient 9), and profile L (lines 30, 31: blood and urine related with patient 10). 53

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 MM 12000 5000 2000 1650 1000 850 650 500 400 300 Figure 2. RAPD Profiles of 31 Candida albicans isolates obtained with primer Cnd4. Profile 1 (lines 1, 2, 3: catheter, blood and urine related with patient 1), profile 2 (line 4: Meyer table related with patient 1); profile 3 (lines 5, 6: blood and urine related with patient 2); profile 4 (lines 7, 8, 9 and 10: Meyer table, blood and urine related with patient 3 and Meyer table related with patient 4); profile 5 (lines 11, 12: blood and urine related with patient 4), profile 6 (line 13, 19, 27: catheter related with patient 4, bed related with patient 6; catheter related with patient 9, respectively); profile 7 (lines 14, 16: blood and bed related with patient 5), profile 8 (line 15: urine related with patient 5); profile 9 (lines 17, 18: catheter and blood related with patient 6); profile 10 (line 20: Meyer table related with patient 7); profile 11 (lines 21, 22: blood and urine related with patient 7); profile 12 (lines 23, 24, 25, 26 blood, urine, catheter and bed related with patient 8); profile 13 ( lines 28, 29: blood and urine related with patient 9); and profile 14 (lines 30, 31: blood and urine related with patient 10). 54

4.4 ARTIGO 4: Nosocomial invasive infection caused by Cunninghamella bertholletiae: case report 55

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5 CONCLUSÕES 1. Foi observada uma elevada freqüência de candidúria em pacientes da UTI (44,4%). 2. Candidúria e candidemia podem ser adquiridas após um longo período de internação. 3. Espécies de Candida não-albicans estavam presentes no sangue e urina com um percentual elevado. 4. A atividade in vitro de voriconazol foi maior do que a do itraconazol, fluconazol e anfotericina B, sugerindo que voriconazol pode ser o azólico mais efetivo no tratamento de infecções por Candida na corrente sangüínea. 5. O encontro de isolados resistentes a diferentes antifúngicos mostra a importância do uso dos testes de suscetibilidade in vitro para a terapia adequada. 6. O ensaio de RAPD usando os primers Cnd3 e Cnd4 podem ser uma ferramenta importante para identificar a variabilidade genética intraespecífica entre isolados de C. albicans. 7. A possível fonte de transmissão ambiental de candidíase encontrada em três casos justifica a importância de maiores cuidados na UTI para evitar a transmissão da infecção. 8. O achado de infecção por C. bertholletiae causando fungemia em pacientes imunocomprometidos foi muito importante, porque este microrganismo é normalmente um contaminante. Este achado mostra que tem que se ter um grande cuidado no isolamento de fungos não usualmente causadores de infecção. 59

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7 ANEXOS 7.1 Normas para publicação na revista Medical Mycology Instructions to Authors (Artigo 3) The official publication of the International Society for Human and Animal Mycology, Medical Mycology is an international journal which focuses on original and innovative studies of all aspects of medical, veterinary and environmental mycology. The topics include, but are not limited to mycological, biochemical and molecular investigations of etiological agents of mycoses; aspects of pathogenesis, immunology, and epidemiology of mycotic diseases; case reports of unusual medical or veterinary fungal infections; laboratory approaches to the identification of fungal pathogens, antifungal therapy and prophylaxis; mode of action, pharmacokinetics and assessments of new antifungal agents; investigations of the mycological aspects of the indoor environment, with a focus on human and animal health. The aim of the journal is to present the best scientific reports from throughout the world and in so doing to provide a comprehensive reference base for medical mycologists, microbiologists, clinicians, and environ-mental specialists. Further information about the Journal including links to the online sample copy, contents pages and copyright assignment form can be found on the Journal homepage. 79

Please note that you and your co-authors in submitting this manuscript are confirming that all authors have (a) made a substantial contribution to the information or material submitted for publication, (b) read and approved the final manuscript, and (c) no direct or indirect financial incentive associated with publishing the article. In addition, by submitting your work, you and your co-authors are stipulating that the manuscript is not, either in whole or in part, currently under consideration by any other scientific journal or has been previously published in either hard copy or electronic format. Types of Papers Original papers. These may be of any length, but must have; (a) a Cover-Page listing all authors and their affiliations and contact information for the corresponding author, (b) a separate page for a Summary, (c) text consisting of Introduction, Materials & Methods, Results, and Discussion, (d) References, (e) Tables with footnoted descriptions of all abbreviations contained in the table, and (f) Figures, with appropriate figure legends allowing a reader to understand their content without reference to the text. Manuscripts should be in English, double-spaced, in no less than size 12 font. Pages should be numbered consecutively, beginning with the cover-page. References are to be 80

numbered, in brackets, e.g., [1], in order of their citation in the text and listed in the Reference section by their appearance in the text. Reviews. Authors must first electronically submit an outline of their proposed article for evaluation by the Editor. The outline should be no more than two, double-spaced pages in 12 font, in which the authors describe the objectives and contents of the report. The outline must be submitted to the Reviews Editor, Francoise Dromer: dromer@pasteur.fr. Once the proposal has been evaluated, the authors will be informed of the results of the Review Editor s initial consideration of their proposal. NOTE - the journal does NOT accept uncommisioned reviews for publication. Case Reports. Such articles must make a distinct, novel contribution to the understanding of the etiologic agents, its clinical manifestations, and/or its treatment. They should NOT be based merely on the first incidence of a known cosmopolitan or widely distributed etiologic agent in the nations of the authors residence. Reports of unusual etiologic agents MUST be substantiated with a living culture deposited in an internationally recognized professional culture collection, defined as a collection that has full-time staff dedicated to receiving, preserving and shipping of culture cultures. Manuscripts MUST be in English and 81

prepared as is an original article, EXCEPT that the text should consist of an Introduction, Case Report and Discussion. Short Communications. These manuscripts are to provide an opportunity for the presentation of preliminary or brief observations that do not warrant a full paper. The manuscript should be prepared as is an original article, except they may be no more than 10 double-spaced pages in no less than size 12 font (including cover-page, abstract, text, references, and tables/figures). Letters. Letters to the Editor are intended to provide an opportunity to discuss issues related to previous published original articles, case reports or short communications and should not be used for the presentation of the authors preliminary data from their own investigations. Letters should be no more than 2 double-spaced pages, in no less than size 12 font, including references. Submission of manuscripts All submissions to this journal should be made via the Manuscript Central site: http://mc.manuscriptcentral.com/tmmy. Users who have not used the site before must create an account from the link on the login page. Assistance with this and all other areas of the site are available in 82

the User Guide, which is accessed via the Get Help Now button at the top right of all Manuscript Central web pages. Preparation of manuscripts 1. Manuscripts must be written in English and submitted as a Word for Windows (PC) file. 2. Manuscripts must be prepared in 12pt font with one (1) inch margins all around and double spaced. 3. Papers should be organized as follows: Full title and Short title; Name(s) and affiliations of author(s); Full postal address, telephone and fax numbers, and email address for the corresponding author; Summary (maximum 200 words); Keywords (up to five); Introduction; Materials and Methods; Results; Discussion (as appropriate to the article); Acknowledgements; References; Tables; Figure captions. 4. Statistics and measurements should be given in numerals when followed by a unit (e.g., 2 mg but two patients). SI units must be used. 5. Abbreviations should be defined when first used in the text. References Use the Vancouver system in preparing the references. They should be numbered sequentially in the order in which they first appear in the text. References should be cited in the text within brackets. e.g., [1]. In 83

preparing your reference list, please note that works with six (6) or more authors should be cited by the names of the first three (3) authors, with the remaining authors included by et al. Journal names must be abbreviated without the use of periods and should be in italic font. The journal number should be in bold font and issue numbers should not be included. In addition, include all page numbers of the citations. The following examples illustrate the correct style for the different types of references: 1. Journal article Author AB, Author CD, Author EF, et al. [if six or more] Title of paper. J Title Abbrev 1995; 00: 000-000. 2. Book chapter Author AB, Author CD, Author EF, et al. [if six or more] Chapter title. In: Editor AB, Editor CD, eds. Book Title With Initial Uppercase Letters, 5th edn. Place: Publisher, 1995: 000-000. 3. Book Author AB, Author CD (eds). Book Title With Initial Uppercase Letters, 5th edn. Place: Publisher, 1995. 84

4. Thesis Author AB. Paper title with lowercase initials to all words. PhD thesis, University, 1995. 5. Conference proceedings Author AB. Paper title. In: Editor AB, ed. Proceedings Title, place, date. Place: publisher, 1995: 000-000 (for abstracts the abstract number should be cited instead of the page number). 6. Personal communications, Unpublished results etc References to personal communications, unpublished results and papers submitted for publication (but not yet accepted) should only appear in the text, and in the following form: [A. B. Author, unpublished results]. [C. D. Author, personal communication]. 7. Journal article on the Internet Abood S. Quality improvement initiative in nursing homes: the ANA acts in an advisory role. Am J Nurs [serial on the Internet]. 2002 Jun [cited 2002 Aug 12];102(6):[about3 p.]. Available from: <http://www. nursingworld.org/ajn/2002/june/wawatch.htm> 85

8. Monograph on the Internet Foley KM, Gelband H, editors. Improving palliative care for cancer [monograph on the Internet]. Washington: National Academy Press; 2001 [cited 2002 Jul 9]. Available from: <http://www.nap.edu/books/0309074029/html> 9. Homepage/Web site Cancer-Pain.org [homepage on the Internet]. New York: Association of Cancer Online Resources, Inc.; c2000-01 [updated 2002 May 16; cited 2002 Jul 9]. Available from: <http://www.cancer-pain.org> 10. Part of a homepage/web site American Medical Association [homepage on the Internet]. Chicago: The Association; c1995-2002 [updated 2001 Aug 23; cited 2002 Aug 12]. AMA Office of Group Practice Liaison; [about 2 screens]. Available from: <http://www.ama-assn.org/ama/pub/category/1736. html> 11. Database on the Internet Open database: Who s Certified [database on the Internet]. Evanston (IL): The American Board of Medical Specialists. c2000-[cited 2001 Mar 8]. Available from: <http://www.abms.org/newsearch.asp_/www.abms.org/newsearch.asp> 86

Closed database: Jablonski S. Online Multiple Congential Anomaly/Mental Retardation (MCA/MR) Syndromes [database on the Internet]. Bethesda (MD): National Library of Medicine (US). c1999 [updated 2001 Nov 20; cited 2002 Aug 12]. Available from: <http://www.nlm.nih.gov/mesh/jablonski/syndrome_title.html> 12. Part of a database on the InternetMeSH Browser [database on the Internet]. Bethesda (MD): National Library of Medicine (US); 2002-[cited 2003 Jun 10]. Meta-analysis; unique ID: D015201; [about 3 p.]. Available from: <http://www.nlm.nih.gov/mesh/mbrowser_/www.www.nlm.nih.gov/mesh/ MBrowser> Files updated weekly. Tables Tables should be numbered according to their sequence in the text; all tables should be referred to in the text. Each table should be supplied on a separate sheet, never within the body of the text. The table heading should be brief and self explanatory. Column headings should be brief and include units in parentheses where applicable. Only horizontal rules should be used. 87

Figures Graphics must be submitted as JPEG, GIF or BMP files. Scanned images should be of a sufficient resolution: 300 dpi for halftones/color; 500 dpi for combination halftones; 1000 1200 dpi for line art. Illustrations should be submitted separate from the manuscript text file, either as individual files or together in a single file. The journal has a limited number of free colour pages within its annual page allowance. Authors should consult the editorial office with respect to colour reproduction at submission stage. Authors may be required to pay to guarantee colour reproduction. Any figure submitted as a colour original may appear in colour within the journal s online edition. Nomenclature Proposals for names of new taxa of fungi must conform with the requirements of the current International Code of Botanical Nomenclature, as should the scientific names used for fungi. Binomials should appear in italic; each must be spelt out in full at first mention in both the abstract and text (thereafter, the generic name may be appropriately abbreviated) and whenever used in the titles of figures and tables. 88

Animals in research Manuscripts containing information related to the experimental use of animals must clearly state that the studies complied with relevant professional and institutional animal welfare policies. Specifically, that procedures involving animals conformed to the ILAR Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (1996 and later editions) of the Institute of Laboratory Animal Research, Commission on Life Sciences, National Research Council (http://www.nap.edu/catalog/5140.html). Disclosures of potential conflicts of interest Authors of research articles should disclose at the time of submission any financial arrangement they may have with a company whose product is pertinent to the manuscript or with a company making a competing product. Such information will be held in confidence while the paper is under review and will not influence the editorial decision, but if the article is accepted for publication, a disclosure statement will appear in the journal. The intent of this policy is not to prevent authors with these relationships from publishing work, but rather to adopt transparency such that readers can make objective judgements on conclusions drawn. 89

Authorship contributions Contributions must be substantial in order to warrant authorship. Each author should have participated sufficiently in the work to take public responsibility for the content. All other contributors should be listed in the acknowledgements. Electronic proofs When proofs are ready, corresponding authors will receive e-mail notification with a password and Web address from which to download a PDF. Hard copies of proofs will not be mailed. To avoid delays in publication, corrections to proofs must be returned within 48 hours, by electronic transmittal, fax or mail. Offprints Corresponding authors will receive either fifty printed offprints or a PDF of the final version of the paper. Preferences should be stipulated when returning proofs. Copyright It is a condition of publication that authors assign copyright or licence the publication rights in their articles, including abstracts, to ISHAM. This enables us to ensure full copyright protection and to disseminate the 90

article, and the journal, to the widest possible readership in print and electronic formats as appropriate. Authors may, of course, use the article elsewhere after publication without prior permission from Informa UK Ltd., provided that acknowledgement is given to the journal as the original source of publication, and that Informa Healthcare is notified so that our records show that its use is properly authorised. Authors retain a number of other rights under the Informa UK Ltd. rights policies documents. These policies are referred to at the Copyright FAQs page. 91

7.2 Protocolo do CEPMHA/HC/UFG 92

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