ANÁLISE IN VITRO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE ERVA MATE (ILEX PARAGUARIENSIS) J.H. Cerqueira 1, J.N. Uecker 2, C. S. Moreira 3, J.O. Penteado 4 S. Pieniz 5. 1- Nutricionista Departamento de Nutrição Universidade Federal de Pelotas, Campus Porto CEP: 96010-610 Pelotas RS Brasil, Telefone: (53)8119-5493 e-mail: (jenyferheller@hotmail.com) 2- Mestranda em Ciência e Tecnologia de Alimentos Departamento de Agronomia Universidade Federal de Pelotas, Campus Capão CEP: 96010-610 Pelotas RS Brasil, Telefone: (53)8123-7035 e-mail: (julia_uecker@hotmail.com) 3- Acadêmica do Curso de Nutrição Departamento de Nutrição Universidade Federal de Pelotas, Campus Porto CEP: 96010-610 Pelotas RS Brasil, Telefone: (53)99066845 e-mail: (candidasoaresmoreira@hotmail.com) 4- Mestranda em Ciências da Saúde Faculdade De Medicina Universidade Federal Do Rio Grande, Campus da Saúde CEP 96203 900 Centro Rio Grande RS Brasil, Telefone: (053)81422616 e-mail: (juliapenteado@hotmail.com) 5- Professora Orientadora Departamento de Nutrição Universidade Federal de Pelotas, Campus Porto CEP: 96010-610 Pelotas RS Brasil, Telefone: (53)3921-1304 e-mail: (nutrisimone@yahoo.com.br) RESUMO A Erva Mate (Ilex paraguariensis) é usada no preparo de uma bebida peculiar, consumida por parte da população da América do Sul. Estudos comprovam que derivados da Erva Mate possuem atividade antioxidante, digestiva, cicatricial e estimulante, conferindo um grande potencial terapêutico. O presente estudo teve por objetivo analisar o potencial antioxidante do extrato aquoso da Erva Mate. Foram realizadas análises da atividade antioxidante pelo método DPPH e TBARS em diferentes concentrações e temperaturas. Por meio dos resultados obtidos observou-se que na concentração de 5% em todas as temperaturas e, na concentração de 10% na temperatura de 0ºC o extrato de Erva Mate apresentou potencial antioxidante pelo método TBARS. O método de DPPH demonstrou que em todas as concentrações e temperaturas de extração analisadas apresentaram atividade antioxidante. Conclui-se que o consumo de Erva Mate pode contribuir significativamente para a ingestão de antioxidantes na dieta com efeitos benéficos para a saúde humana. ABSTRACT Yerba Mate (Ilex paraguariensis) is used in the preparation of a peculiar beverage, consumed by the South American population. Studies show that derivatives of Yerba Mate have antioxidant activity, digestive, healing and stimulating, giving a great therapeutic potential. This study aimed to analyze the antioxidant potential of aqueous extract of Yerba Mate. Antioxidant activity analysis of DPPH method and TBARS method at different concentrations and temperatures were conducted. By the results obtained it was observed that in the concentration of 5% at all temperatures and at 10% concentration at a temperature of 0 C to Yerba Mate extract showed antioxidant potential by the TBARS method. The DPPH method showed that in all concentrations and temperatures extraction analyzed had antioxidant activity. It is concluded that the consumption of Yerba Mate can contribute significantly to the intake of antioxidants in the diet with beneficial effects on human health. PALAVRAS-CHAVE: antioxidante; peroxidação lipídica; radicais livres. KEYWORDS: antioxidant; lipid peroxidation; free radicals.
1. INTRODUÇÃO A Erva Mate (Ilex paraguariensis) pertence à família Aquifoleaceae, tem sua origem na América do Sul, nos países Argentina, Paraguai e Brasil, estando distribuída principalmente pelos estados do Mato Grosso, São Paulo, Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul segundo (Esmelindro et al. 2002) folhas secas e moídas de Ilex paraguariensis são usadas no preparo de uma bebida peculiar, consumida por parte da população da América do Sul. Nos países onde é consumida recebe diferentes denominações, sendo chimarrão no Sul do Brasil, mate na Argentina e Uruguai e tererê no Paraguai (Heck e Mejia, 2007). Alguns estudos indicam que os derivados da Erva Mate (IIex paraguariensis) possuem várias propriedades benéficas. Pesquisas comprovam atividade antioxidante, antimicrobiana, diurética, digestiva, cicatricial e estimulante, conferindo um grande potencial terapêutico (Asolini et al. 2006). Os antioxidantes são substâncias que retardam a velocidade da oxidação, inibindo os radicais livres e prevenindo a formação de doenças, contribuindo assim para uma maior longevidade. Desta forma, torna-se essencial o equilíbrio entre os radicais livres e o sistema de defesa antioxidante (Vargas et al. 2008). Segundo Boaventura (2010) para prevenir ou reduzir os efeitos do estresse oxidativo, os organismos apresentam mecanismos de defesa enzimáticos e não-enzimáticos denominados antioxidantes, os quais são produzidos pelo próprio organismo ou provenientes de fontes exógenas (dietéticas). O chimarrão constituiu-se uma bebida típica do Rio Grande do Sul, presente no dia-a-dia de muitos gaúchos. Portanto, devido ao seu alto consumo entre a população e, aliado aos possíveis benefícios advindos de seu consumo, este estudo teve por objetivo analisar o potencial antioxidante do extrato aquoso da Erva Mate (IIex paraguariensis), como perspectiva de uso para benefícios da saúde. 2. MATERIAL E MÉTODOS A amostra comercial de Erva Mate utilizada neste estudo foi selecionada aleatoriamente em um supermercado da cidade de Pelotas RS, do tipo moída fina, sem adição de açúcar. A preparação do extrato de Erva Mate foi realizada com água em diferentes concentrações (5%; 10%; 15% e 20%) e temperaturas (água fria (0 C) e água quente (70 C e 100 C)), o qual foi exposto a infusão durante 30 minutos. Após, a amostra foi peneirada (Peneira 10cm - Gourmet Mix) e o extrato utilizado nos métodos descritos a seguir. Todas os extratos foram preparados no dia do uso. O método DPPH utilizado para avaliar a atividade antioxidante foi o descrito por Brand- Williams et al. (1995), baseado na captura do radical DPPH (2,2-difenil-1-picril-hidrazil) por antioxidantes, produzindo um decréscimo da absorbância a 515 nm. O DPPH foi utilizado na concentração de 60 μm, dissolvido em álcool metílico. Em ambiente escuro, foi transferida uma alíquota de 0,1 ml de amostra para tubos de ensaio contendo 3,9 ml do radical DPPH (60 μm) e, em seguida, homogeneizados. Foi utilizado 0,1 ml de uma solução controle (solução controle de álcool metílico 50% (40 ml), acetona 70% (40 ml) e água (20 ml)) com 3,9 ml do radical DPPH (60 μm). Após o preparo, as amostras foram armazenadas em ambiente escuro por 45 minutos. Como branco foi utilizado álcool metílico e a curva padrão de 2,2-difenil-1-picril-hidrazil foi realizada a partir da solução inicial de DPPH (60 μm), variando a concentração de 10 μm a 50 μm. Os resultados foram expressos em EC 50 (μg ml -1 ). O experimento foi realizado em triplicata. A inibição da peroxidação lipídica foi realizada por meio da Reação ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) de acordo com a metodologia de Ohkawa et al. (1979). Primeiramente foi incubado em
banho maria a 80 ºC, tubos de ensaio contendo água Mili Q, Azeite de Oliva Extra Virgem submetidos à oxidação por 100 µm de sulfato ferroso, por 10 minutos. Posteriormente, foi adicionado em cada tubo a amostra com diferentes concentrações e temperaturas de extração, Lauril Sulfato de Sódio (SDS) 8,1 %, Tampão de Ácido Acético ph 3,44 e Ácido Tiobarbitúrico (TBA) 0,6 %. Em seguida, foi incubado novamente em banho maria a 100 ºC por 1 hora. Os produtos da reação foram determinados por medida de absorbância em 532 nm, em espectrofotômetro. A concentração de TBARS foi calculada através de uma curva padrão, concentrações conhecidas de 1,1,3,3 tetrametoxipropano, e os resultados foram expressos em nm de Malonaldeído (MDA) g -1 de amostra. O experimento foi realizado em triplicata. Os dados foram analisados utilizando a análise de variância (ANOVA) e o teste de comparação de médias (teste Tukey), tomando como base os níveis de significância maiores que 95 % (p< 0,05). 3. RESULTADOS E DICUSSÃO Os resultados da capacidade de sequestro de radicais livres, realizada pelo método de DPPH, demonstraram que as amostras contendo extrato de Erva Mate em todas as concentrações e temperaturas de extração analisadas apresentaram atividade antioxidante (p 0,05) quando comparadas ao controle conforme mostra a (Tabela 1). Ressalta-se que a menor atividade das amostras em relação ao controle (EC 50 = 27,32 μg ml -1 ) foi observada na temperatura de 70 ºC e concentração de 5 % (EC 50 = 0,23 μg ml -1 ). Tabela 1 - Determinação da capacidade antioxidante do extrato de Erva Mate (Ilex paraguariensis) pelo método de DPPH. Os resultados estão expressos em média ± erro padrão. Concentração Temperatura 0 ºC 70 ºC 100 ºC ----- EC 50 μg ml -1 ----- Controle 27,32 a ± 0,34 27,32 a ± 0,34 27,32 a ± 0,34 5 % 0,45 b ± 0,05 0,23 b ± 0,03 0,38 b ± 0,02 10 % 0,40 b ± 0,01 0,46 b ± 0,03 0,53 b ± 0,03 15 % 0,40 b ± 0,02 0,63 b ± 0,04 0,59 b ± 0,04 20 % 0,91 b ± 0,05 1,64 c ± 0,12 1,47 c ± 0,12 * Médias seguidas por letras iguais não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey (p>0,05). Souza (2009) relata em seu estudo que a captura do radical DPPH (EC 50 ) do chá mate variou de 11,90 a 16,70 µg ml -1. Rivelli et al. (2007) testaram extratos hidroalcoólicos de Erva Mate verde com radical DPPH e encontraram uma variação de 14,70 a 15,10 µg ml -1. No presente estudo, os resultados encontrados nos extratos de Erva Mate analisados foram inferiores aos relatados por Souza (2009) e Rivelli et al. (2007) apresentando uma variação de 0,23 a 1,64 µg ml -1 indicando maior potencial antioxidante. A inibição da peroxidação lipídica foi realizada por meio do método de TBARS. De acordo com os resultados obtidos pode-se inferir que na concentração de 5 % em todas as temperaturas analisadas: 0 ºC (461,40 nmol de MDA g -1 ), 70 ºC (462,37 nmol de MDA g -1 ) e 100 ºC (302,18 nmol de MDA g -1 ) e, na concentração de 10 % na temperatura de 0 ºC (441,82 nmol de MDA g -1 ) o extrato de Erva Mate demonstrou diferença estatisticamente significativa (p 0,05) em relação ao controle (0
%) (629,56 nmol de MDA g -1 ), indicando potencial antioxidante. Foi observado também que, quanto maior a concentração de Erva Mate, maior a absorbância em relação ao controle, indicando menor atividade antioxidante com o aumento da concentração em todas as temperaturas analisadas (Tabela 2). Tabela 2 - Inibição da peroxidação lipídica do extrato de Erva Mate (Ilex paraguariensis) pelo método de TBARS. Os resultados estão expressos em média ± erro padrão. Concentração Temperatura 0 ºC 70 ºC 100 ºC -----nmol de MDA g -1 ----- 0 % 629,56 a ± 9,08 629,56 a ± 9,08 629,56 a ± 9,08 5 % 461,40 b ± 22,12 462,37 b ± 33,98 302,18 b ± 32,40 10 % 441,82 b ± 37,35 812,33 c ± 14,11 640,52 a ± 19,27 15 % 861,67 c ± 21,65 1073,9 c ± 47,30 943,45 c ± 16,68 20 % 1297,53 c ± 48,50 1102,74 c ± 41,88 1236,09 c ± 91,44 * Médias seguidas por letras iguais, não diferem estatisticamente entre si pelo teste de Tukey (p>0,05). Bastos et al. (2007) testaram os extratos aquosos de Erva Mate para chimarrão (verde) e para chá mate (tostada) e verificaram que a inibição da oxidação lipídica foi 78,3 e 86,2 %, respectivamente (concentração de 0,5 mg/ml). Os resultados foram estatisticamente significativos, indicando que a Erva Mate tostada apresenta maior atividade antioxidante por este método do que a Erva Mate verde. De acordo com Melo e Guerra (2002) estes compostos apresentam atividade antioxidante diferenciada em função do substrato lipídico em que atuam e das características químicas inerentes a cada um deles. Apesar dos potenciais benefícios oriundos do consumo de extratos aquosos de Erva Mate, como os apresentados neste estudo, é necessário considerar com atenção também a temperatura da água com a qual é preparado o chimarrão, visando evitar danos á saúde dos consumidores. O preparo do chimarrão com a água quente acima de 60 ºC pode ser o responsável pela maior incidência de câncer de esôfago na região Sul do Brasil, pois a temperatura elevada da água e o seu frequente consumo (de 1,2 L a 6 L por pessoa ao dia), podem destruir a mucosa esofágica e provocar a proliferação desordenada das células (Barros et al. 2000). Uma alternativa seria a ingestão dos extratos de Erva Mate consumidos sob outras formas, como tererê que é obtida pela maceração da Erva Mate em água fria ou gelada, ou ainda sob a forma de chá mate, sendo essa bebida produzida a partir da infusão de Erva Mate que sofreu processo de torrefação e, cuja temperatura de ingestão, frequência e volumes ingeridos são menores relativamente do que aqueles do chimarrão (Bastos e Torres 2003). Desta forma, as consequências provenientes da ingestão por água quente (70 ºC-100 ºC) poderiam ser minimizadas com a preparação em água com temperaturas inferiores a do chimarrão. 4. CONCLUSÕES Verificou-se que a Erva Mate apresentou atividade antioxidante in vitro frente ao radical DPPH. Da mesma forma, observou-se que, pelo método de TBARS, a Erva Mate apresentou inibição da peroxidação lipídica na concentração de 5 % em todas as temperaturas analisadas, e na concentração de 10 % na temperatura de 0 ºC.
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Asolini, F.C., Tedesco, A.M., Carpes, S.T., Ferraz, C., & Alencar, S.M. (2006). Atividade antioxidante e antibacteriana dos compostos fenólicos dos extratos de plantas usadas como chás. Journal of Food Science and Technology, 9, 209-215. Barros, S.G., Ghisolfi, E.S., Luz, L.P., Barlem, G.G., Vidal, R.M., Wolff, F.H., Magno, V. A., Breyer, H. P., Dietz, J., Grüber, A. C., Kruel, C. D. P., & Prolla, J. C. (2000). High temperature mate infusion drinking in a population at risk for squamous cell carcionoma of the esophagus in southern Brazil. Arquivos de Gastroenterologia, 37, 25-30. Bastos, D.H.M., & Torres, E.A.F.S. (2003). Bebidas a base de erva-mate (Ilex paraguariensis) e saúde pública. Revista da Sociedade Brasileira de Alimentação e Nutrição, 26, 77-89. Bastos, D.H.M., Oliveira, D.M., Matsumoto, R.L.T., Oliveira, P.C., & Ribeiro, M.L. (2007). Yerba mate: Pharmacological Properties Research ad Biotechnology. Medicinal and Aoromatic Plant Science and Biotechnology, 1(1), 37-46. Boaventura, B. (2010). Avaliação do efeito antioxidante da erva mate (ilex paraguariensis) em indivíduos com dislipidemia (Dissertação de mestrado). Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis. Brand-Williams, W., Cuvelier, M.E., & Berset, C. (1995). Use of free radical method to evaluate antioxidant activitylebensmittel-wissenschaft & Technologie, 28, 25-30. Esmelindro, M.C., Toniazzo, G., Waczuk, A., Dariva, C., & Oliveira, D. (2002). Caracterização físicoquímica da erva-mate: influência das etapas do processamento industrial. Ciência e Tecnologia de Alimentos, 22, 193-204. Heck, C.I., Mejia, E.G. (2007). Yerba mate tea (Ilex paraguariensis): A comprehensive review on chemistry, health implication, and technological consideration. Journal of Food Science, 72, 138-151. Melo, E.A., & Guerra, N.B. (2002) Ação antioxidante de compostos fenólicos naturalmente presentes em alimentos. Boletim da SBCTA, 36(1), 1-11. Ohkawa, H., Ohishi, H., & Yagi, K. (1979). Assay for lipid peroxide in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Analytical Biochemistry, 95, 351-358. Rivelli, D.P., Silva, V.V., Ropke, C.D., Miranda, D.V., Almeida, R.L., Sawada, T.C.H., *Barros, S. B. M. (2007). Simultaneous determination of chlorogenic acid, caffeic acid and caffeine in hydroalcohoolic and aqueous extracts of Ilex paraguariensis by HPLC and correlation with antioxidant capacity of the extracts by DPPH reduction. Journal of Pharmaceutical Sciences, 43(2), 215-222. Souza, M.F.F. (2009). Chá mate (Ilex paraguariensis): compostos bioativos e relação com atividade biológica (Dissertação de mestrado). Universidade de São Paulo, São Paulo. Vargas, P.N., Hoelzel, S.C., & Rosa, C.S. (2008). Determination of total polyphenols content and antioxidant activity in commercial grape juices. Alimentos e. Nutrição, 19(1), 11-15.