Crescimento Microbiano 1
Cultivo e Crescimento de Micro-organimos Everlon Cid Rigobelo 2
Objetivos Cultivo laboratorial de Micro-organismos Técnica asséptica Meios de cultura Meios sólidos Meios Líquidos 3
Objetivos Crescimento de micro-organismos Crescimento de bactérias Crescimento de Fungos Multiplicação dos vírus 4
Objetivos Métodos utilizados para a contagem do crescimento de micro-organismos Contagem em placas Contagem em lâmina Turbidimetria 5
Micro-organismos Escherichia coli Aspergillus niger Bacteriófago Fonte: www.hyperscience.com 6
Finalidade de cultivo Isolar e identificar Testes utilizados: Tintoriais, morfológicos, bioquímicos sorológicos e moleculares 7
Morfologia dos Micro-organismos Vírus animal Bactérias do solo Micorrizas Fonte: www.hyperscience.com 8
Testes de Identificação Teste Tintorial Teste Bioquímico Teste Sorológico Fonte: www.rehagro.com.br Teste Molecular 9
Importância dos micro-organismos Doenças de Planta Álcool e Bebidas Bactericidas Produtos Láctios Probióticos Antibióticos Fonte: www.brasilescola.com.br 10
Cultivo laboratorial de microorganismos Cultura com um único micro-organismo Ausência de contaminantes Meios sólidos crescimento das colônias Uniformidade das colônias Fonte: www.worldespress.com 11 Cultura Pura
Cultivo laboratorial de microorganismos Técnica asséptica Meios esterilizados Câmara de fluxo laminar Esterilização calor úmido Uso da chama do bico de Bunsen 12 Fonte: www.worldespress.com
Técnicas Assépticas Fluxo Laminar Bico de Bunsen Fonte: www.worldespress.com 13
Cultivo de micro-organismos Meios de Cultura Soluções nutrientes que promovem o crescimento microbiano Classes de meios de cultura Meios definidos e meios complexos Fonte: www.biomedicinamicro.com 14 Agar Sangue
Meios Definidos Quantidades precisas de compostos: Orgânicos e inorgânicos Fonte de Carbono Origem e a concentração da fonte de Carbono Depende Do micro-organismos cultivado 15
Meios Complexos Digestos de produtos animais ou vegetais Caseína (proteína do leite) Carne (extrato de carne) Soja (caldo tríptico de soja) Agar Trípico Soja Células de leveduras (extrato de leveduras) Fonte: www.biomedicinamicro.com 16
Meios Complexos Possuem substâncias altamente nutritivas Porém impuras Comercializados na forma de pó Pesados e dissolvidos em água destilada Fonte: www.biomedicinamicro.com Agar Seletivo 17
Meios Complexos caseína Extrato de carne Trípico de soja Fonte: www.biomedicinamicro.com Extrato de Levedura 18
Meios Seletivos Inibem seletivamente o crescimento de micro-organismos Presença de compostos Fonte: www.pvl.pt Agar Baird Parker 19
Meio Diferencial Possui um indicador Agar TSI Permite a diferenciação de reações químicas Específicas que ocorrem durante o crescimento Alguns microrganismos realizam: Reações particulares outros não São úteis na distinção e espécies bacterianas Fonte: www.pvl.pt 20
Meio Sólido Adição de um agente gelificante aos meios líquidos Vantagens Agar NI Imobilizam as células Crescem em massas isoladas e visíveis Fonte: www.mkldiagnostic.com 21
Agar Alga da classe Rodophyta Agar Agar Mitis Salivarius Fonte: www.mkldiagnostic.com 22
Crescimento de Bactérias Fase elongação Podem atingir o dobro do comprimento Formação do septo Crescimento da membrana plasmática Parede celular no interior da célula Divisão Formam partição que divide a célula em duas Fonte: www.mkldiagnostic.com 23
Fissão Binária Geração Tempo de geração 24
Crescimento de bactérias Culturas de batelada Sistema fechado Sofre alterações contínuas Atividades metabólicas dos micro-organismos Alterações drásticas na composição química e física dos meios de culturas 25
Culturas de Batelada Fermentação Alcoólica Usina Sucro alcooleira Fonte: www.shared.com Fermentação Acoólica 26
27
Ciclo de Crescimento Microbiano Fase Lag Pouca ou ausência de divisão celular Síntese enzimática e de moléculas variadas Pode ser curta ou longa dependendo das condições fisiológicas do inóculo Aumento da quantidade de proteínas no peso seco, e no tamanho celular 28
Ciclo de Crescimento Microbiano Fase Exponencial Crescimento Exponencial das células Tempo de geração constante Taxa de Crescimento Exponencial Número de gerações por Unidade de Tempo Será curto ou longo dependendo da disponibilidades de nutrientes Estudos enzimáticos são realizados nesta fase 29
30
Ciclo de Crescimento Microbiano Fase Estacionária Não se observa crescimento microbiano Podem prosseguir o metabolismo energético e processos biossintéticos Consumo de um nutriente essencial Acúmulo de um produto de excreção do organismo 31
Ciclo de Crescimento Microbiano Fase Morte Número de células mortas excede o de células vivas A taxa de morte pode ser inferior a taxa de crescimento exponencial A contagem total permanece constante, enquanto que a taxa de células viáveis cai lentamente Pode ocorrer lise celular 32
Cultura contínua: quimiostato Culturas são mantidas constantes Longo período de tempo Sistema aberto Mantém um volume constante Adicionado um meio de cultura fresco a uma taxa constante Remove-se o mesmo volume de meio usado 33
Cultura contínua: quimiostato Cultura contínua Sistema em equilíbrio O volume do quimiostato Número de células e a quantidade de nutrientes Permanecem constantes Fonte: www.podcastmicro.com 34
Quimiostato Permite o controle Taxa de crescimento populacional da cultura Densidade populacional da cultura Fatores importantes para esse controle Taxa de diluição Concentração de um nutriente limitante C - N 35
Crescimento em Fungos Crescimento e disseminação de filamentos de hifas Produção assexuada de esporos Produção esporos sexuais Simples divisão celular - brotamento 36
Micorrizas Fonte: www.infoescola.com 37
Crescimento de vírus Vírus Parasitas obrigatórios Crescimento utilizando a maquinaria celular da célula hospedeira Fonte: www.infoescola.com 38
Multiplicação dos Vírus Multiplicação do vírus Culturas de células Hela, Vero, BHK, IBRS2 Células de Fibroblastos Fonte: www.infoescola.com 39
Multiplicação dos Vírus Inoculação em ovos embrionados Vias de Inoculação Lesões Virais Fonte: www.infoescola.com 40
Multiplicação Viral Animais de Laboratório Fonte: www.infoescola.com 41
Medidas do Crescimento Microbiano Medidas do Crescimento Microbiano Diretas Indiretas Contagem de Viáveis Verificação da Turbidez Contagem de Células Totais 42
Medidas de Crescimento Contagem Direta No número de células viáveis Alterações na concentração de algum componente celular Proteínas, ácidos nucleicos e peso seco das próprias células 43
Medidas de Crescimento Contagem de Células Totais Contagem microscópica células Amostras secas ou líquidas Amostras secas Podem ser coradas para aumentar o contraste em as células e o fundo 44
Medidas Diretas do Crescimento Microbiano Contagem em placas Contagem das células viáveis Cada colônia é originada de uma única bactéria (UFC) Inóculo original é sempre homogêneo Não existe agregação de células Desvantagem: precisa de 24 horas de incubação 45
Contagem de Células Viáveis Viável capaz de se dividir Contagem do número de células em uma placa Capazes de formar colônias Contagem de placa Método da semeadura por espalhamento Método da semeadura em profundidade 46
47
Método da Semeadura por Profundidade Volume de 0,1 1mL Pipetado em uma placa de meio estéril Adiciona-se meio de cultura fundido Mistura-se com movimentos delicados Formação de colônias por toda a placa Não somente na superfície do ágar 48
Método de Semeadura 49
Medidas Diretas do Crescimento Microbiano Contagem em Lâmina Utilização de câmaras de contagem (Neubauer) Lâmina quadriculada de área conhecida (grid) Lamínula sobre a superfície da lâmina de vidro Fonte: www.infoescola.com 50
Limitações da Contagem Microscópica Apesar de serem rápidas e simples Limitações são: Não se distingue células vivas e mortas sem coloração especial Células pequenas são de difícil visualização Técnica pouco precisa Células móveis precisam ser fixadas 51
52
Método da Semeadura por Espalhamento Volume de 0,1mL Espalhado sobre a superfície do meio sólido com o auxílio de alça Incubação da placa e crescimento Contagem do número de colônias 53
Contagem por Turbidimetria Medição do aumento de componentes celulares Proteínas, DNA e peso seco de uma cultura Medidas de turbidez Suspensão celular aspecto turvo Quanto maior o número de células maior a luz dispersa Avaliação da massa total de células proporcional ao número de células 54
Turbidimetria Fonte: www.infoescola.com 55
Número Mais Provável 56
Contagem de Vírus Placas de Lise Inoculação do vírus em culturas celulares Contagem de células lisadas Cada célula equivale a um vírion Teste de Elisa Número de ligações entre os vírus e o anticorpo 57
Contagem de Vírus em Placas de Lise 58
Teste de Elisa 59
Temperatura e Crescimento Microbiano Temperatura Fator mais importante que afeta o crescimento microbiano Temperaturas muito frias ou muitos quentes os micro-organismos não são capazes de crescer As temperaturas máximas e mínimas refletem a variação da temperatura média de seus hábitats. 60
Classes Térmicas de Microorganismos Psicrófilos Temperaturas baixas Mesófilos Temperaturas medianas Termófilos Temperaturas altas Hipertermófilos Temperaturas muito elevadas 61
62
Fatores que influenciam a atividade Temperatura ph enzimática Em altas temperaturas, as enzimas sofrem desnaturação e perdem suas propriedades catalíticas Em baixas temperaturas, a taxa de reação diminui ph no qual a atividade enzimática é máxima é conhecido como ph ótimo Concentração do substrato Dentro de limites, a atividade enzimática aumenta com o aumento da concentração do substrato 63
64
65
Literatura Consultada Microbiologia de Brook, Michael T. Madigan, 2010. Pelczar, Jr., Joseph Michael. Microbiologia, 66
Muito Obrigado! 67