Nome Seção 7.012 Conjunto de Problemas 4 Pergunta 1 Você está estudando a síntese do aminoácido triptofano em bactérias. As enzimas TrpA, TrpB, TrpC, TrpD, TrpE e AroH são essenciais para a síntese desse aminoácido. Bactérias do tipo selvagem não sintetizam nenhuma dessas proteínas na presença do triptofano; entretanto, na ausência do triptofano todas as enzimas são sintetizadas em grandes quantidades. a) Teoricamente, se a síntese das enzimas acima for regulada de forma negativa i) que alteração na proteína repressora causaria a síntese das enzimas mesmo na presença do triptofano? ii) que alteração na seqüência operadora causaria a síntese das proteínas mesmo na presença do triptofano? iii) que alteração na proteína repressora inibiria a síntese da enzima mesmo na ausência do triftofano b) Se a síntese das enzimas acima for regulada de forma positiva, i) que alteração na proteína ativadora causaria a síntese das enzimas mesmo na presença do triptofano? ii) que alteração na proteína ativadora impediria a síntese das enzimas mesmo na ausência do triftofano? iii) que alteração na seqüência operadora impediria a síntese das enzimas mesmo na ausência do triptofano? 1
Pergunta 1, continuação c) Por intermédio de uma análise mutacional, você identifica duas regiões do DNA que são importantes na regulação da síntese do triptofano. A primeira dessas duas regiões, trpr, é um gene que codifica a proteína de ligação ao DNA. A segunda região, chamada de trpo, é uma seqüência de DNA na qual o gene trpr produz ligações. Análises de três cepas de bactérias com genótipos diferentes nos locos trpr e trpo fornecem os seguintes resultados: Cepa trpr trpo trpr trpo trpr trpo Meio de crescimento com triptofano sem triptofano com triptofano sem triptofano com triptofano sem triptofano níveis de mrnas de trpa, trpb, trpc, trpd e trpe 0,1% i) O controle da síntese do triptofano é um exemplo de regulação positiva ou negativa? ii) A proteína produzida pelo gene trpr é um ativador ou um repressor? d) Experimentos para monitorar a presença ou ausência da enzima sintetizada a partir dos genes trpc, trpd, trpe e AroH em alguns organismos mutantes isolados rendeu os seguintes resultados: nível de TrpC mutante wt 1 2 3 4 5 Nível de TrpD Nível de TrpE Nível de AroH i) Relacione todos os mutantes que apresentam mutações que afetam a produção de qualquer TrpC funcional. ii) Relacione todos os mutantes que apresentam mutações que afetam a produção de qualquer TrpD funcional. iii) Relacione todos os mutantes que apresentam mutações que afetam a produção de qualquer AroH funcional. 2
Pergunta 1, continuação e) Os dados acima são consistentes com a teoria de que muitos desses genes estão no mesmo operon (e portanto sob o controle de um único promotor)? Por que? Quais genes estariam contidos nesse operon? f) Como você explicaria o mutante 5 em termos de mutações regulatórias? Pergunta 2 Ao trabalhar com camundongos como UROP, você descobriu uma enzima catabólica muito importante. Você realiza mutações no gene que codifica essa enzima, de forma a tornar a enzima mutante sempre ativa. Os camundongos portadores desse gene mutante apresentam um emagrecimento permanente e rápido sem outros eventos adversos. VOCÊ ACABOU DE DESCOBRIR A PÍLULA MÁGICA QUE MILHÕES DE PESSOAS ESTÃO PROCURANDO HÁ VÁRIAS GERAÇÕES! Mas você precisa da versão mutante desse gene. Para começar, você decide criar uma biblioteca genômica de DNA do ser humano. a) No espaço abaixo, descreva sucintamente como você desenvolveria uma biblioteca genômica de DNA para bactérias. Use os termos: genômico, enzima de restrição, plasmídeo, transformação, placas de Petri, sonda e hibridação. 3
Pergunta 2, continuação Você conseguiu descobrir o análogo humano. Você encontrou a colônia que contém um plasmídeo, chamado plib1, com homólogo humano. Você isola o plasmídeo, clona o gene ao qual dá o nome de gene svelte. Idealmente, você deseja expressar lotes de enzimas humanas um estudo bioquímico completo da proteína. Consequentemente, você precisa mover o gene svelte dos plasmídeo plib1 para um vetor de expressão. Você tem um vetor de expressão grande, p7.01mit, para ser usado em E. coli. Um diagrama do vetor de expressão p701mit e o plib1 é fornecido a seguir, ilustrando os sites únicos de enzimas de restrição. b) Você deseja inserir um fragmento de DNA contendo o gene svelte e o gene de resistência à kanamicina (kanr) no vetor de expressão p701mit. i) Qual (is) enzima(s) você usaria para cortar plib1 para obter um único fragmento contendo o gene svelte e o gene de resistência à kanamicina (kanr)? Qual seria o tamanho dos fragmentos? ii) Qual (is) enzima(s) você usaria para cortar p701mit? Qual seria o tamanho dos fragmentos? c) Após a ligação, você transforma o novo vetor p701mit contendo os genes svelte e kanr em uma cepa de E. coli. i) Antes da transformação, essa cepa de E. coli deveria ser... (sublinhe a alternativa que se aplica). resistente à ampicilina resistente à kanamicina sensível à ampicilina. sensível à kanamicina. ii) Como você detectaria quais células possuem um vetor contendo o gene svelte? iii) Qual é a vantagem de incluir o gene kanr no fragmento clonado em p701mit? 4
Pergunta 3 a) Você isolou células de comportamento previsível. Você isolou o vetor que essas células carregam. Para confirmar que esse é o vetor p701mit que contém o gene svelte, você realizou uma série de digestões de restrição. Marque no gel abaixo os locais onde você espera encontrar bandas. Identifique cada banda com o número de bases que o fragmento pode conter. Agora que você tem a versão humana do gene svelte clonado e pode expressar a proteína, a revista Science e empresas de biotecnologia estão batendo na sua porta!! Você pode ganhar rios de dinheiro antes mesmo de se formar pelo MIT! No entanto, um estudante um pouco mais cético diz que é sempre bom sequenciar novos genes clonados para certificarse de que você tem o que você acha que tem. Você decide realizar a seqüência do gene svelte. b) Para o filamento simples de DNA a seguir, relacione a seqüência de um promotor de 10 bases que poderia ser usado para realizar a seqüência desse fragmento. Marque as pontas 5 e 3 do promotor. Esse promotor deve hibridizar as 10 primeiras bases em uma ponta e ser alongado na reação de seqüenciamento. promotor: 5 ATGCTGGGCGTAAAGGCCCGCTACTGATACTC3 c) Qual é a seqüência do DNA recentemente sintetizado? Inclua e marque o promotor e marque as pontas 5' e 3'. 5
Pergunta 4 Você é assessor de genética em um grande hospital de Boston. Um casal (representado na árvore genealógica a seguir como 1 e 2) quer saber quais são as probabilidades de que o filhos que estão esperando tenham orelhas grandes. Recentemente, o gene responsável pelas orelhas grandes foi clonado e sequenciado. A região do gene para tamanho de orelhas é mostrada a seguir. a) Você deseja amplificar esse gene de cada um dos pais por intermédio do PCR. Forneça a seqüência dos dois promotores para essa reação de PCR. Identifique as pontas 5 e 3. promotor A: promotor B: b) O esquema a seguir ilustra a mesma região. No diagrama abaixo, identifique o sítio de ligação de cada promotor. c) Em um esquema semelhante ao b) ilustre os filamentos de DNA que estariam presentes após dois testes de PCR. Inclua promotores nos locais adequados em cada filamento. 6
Pergunta 4, continuação Um mapa de restrição dessa região é fornecido a seguir: O DNA amplificado por PCR de cada membro da família foi submetido à digestão com Hind III, Nde I e Bgl II. O DNA digerido foi separado por ume eletroforese em gel e os resultados são fornecidos a seguir. d) O fenótipo orelha grande é dominante ou recessivo em relação ao fenótipo normal? Como você chegou a essa conclusão? e) Em posse da árvore genealógica dessa família do gel, quais são as chances de que os indivíduos 1 e 2 tenham um filho com orelhas grandes? Por favor explique. 7