UNIJUÍ - UNIVERSIDADE REGIONAL DO NOROESTE DO ESTADO DO RIO GRANDE DO SUL DHE: DEPARTAMENTO DE HUMANIDADE E EDUCAÇÃO CURSO: EDUCAÇÃO FÍSICA Suplementação com L-glutamina associada ao treinamento aeróbio moderado aumenta a tolerância à glicose e altera parâmetros de estresse oxidativo em tecidos metabólicos de camundongos Analú Bender dos Santos Trabalho de conclusão de Curso, Apresentado como requisito parcial para a obtenção de grau de Bacharelado em Educação Física. Professor Orientador: Thiago Gomes Heck IJUÍ-RS 2015.
Analú Bender dos Santos Suplementação com L-glutamina associada ao treinamento aeróbio moderado aumenta a tolerância à glicose e altera parâmetros de estresse oxidativo em tecidos metabólicos de camundongos Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Educação Física do Departamento de Humanidades e Educação (DHE) da Universidade Regional do Noroeste do Estado do Rio Grande do Sul Unijuí, como exigência parcial para obtenção do título de Bacharel em Educação Física. IJUÍ-RS 2015. II
DEDICATÓRIA Este trabalho eu dedico primeiramente a meu namorado Elias Ricardo Borré da Silva, pelo constante apoio, compreensão e incentivo em todos os momentos cruciais vividos nestes últimos cinco anos do curso de educação física e dos quatro anos de iniciação científica. A minha família por conviver comigo em todos estes momentos de alegrias, tristezas, entusiasmo e sempre me recebendo com carinho e compreensão. Meu muito obrigado à Cecília Jurema Bender dos Santos, minha mãe, Valdenor dos Santos, meu pai, e Taisa Bender dos Santos, minha irmã. A estas quatro pessoas, dedico não só este trabalho, mas minha vida e meu amor pela eternidade. III
AGRADECIMENTOS A construção de sonhos e a realização de feitos científicos perpassam por caminhos muitas vezes inacreditáveis. E neste encontramos pessoas com as quais nos surpreendemos muitas vezes. E durante todo o processo de desenvolvimento do meu curso e deste projeto de pesquisa muitas pessoas fizeram parte desta realização. Meu professor orientador Thiago Gomes Heck, que enxergou em mim um potencial que ninguém acreditava existir, a força e determinação para o desenvolvimento da pesquisa, e dessa forma em seu primeiro ano de aula na UNIJUI me incluiu no grupo de pesquisas em fisiologia, do qual participo até hoje. A professora Mirna Stela Ludwig, que foi minha primeira orientadora de bolsa, apostando em minha capacidade de desenvolvimento dentro do laboratório como pesquisadora. Estes dois professores mudaram a direção de minha vida acadêmica por acreditar em minha capacidade, dois anjos que entraram em minha vida. Os colegas de laboratório pelo acolhimento, pelas broncas, pelos ensinamentos, e pela ajuda prestada em todos os momentos da pesquisa. Com certeza passamos por momentos inesquecíveis, de muito trabalho, sempre com muita alegria e criatividade, fazendo com que momentos complicados e desgastantes passassem com suavidade. Meu muito obrigado à Maicon Machado Sulzbacher, Fernanda Geisel Baldissera, Eloisa Gabriela de Pelegrin Basso, Pauline Brendler Goetemms Fiorin, Eliara Ten Caten Martins, Bethânia Salamoni, Renan Daniel Bueno Basso, Yohanna Hannah Donato, Maciel Bruxel e Iberê Machado Kostrycki. Meus professores da graduação que sempre dedicaram-se a dar o seu melhor em cada disciplina. Aos meus colegas de curso que foram amigos preciosos durante todos os momentos vividos até aqui. Aos professores que durante todos esses anos de iniciação científica foram se agregando ao nosso grupo de pesquisa e trazendo consigo seu conhecimento e um IV
maior apoio e sustentação teórico-prático aos trabalhos desenvolvidos no GPeF. Além de vários alunos de graduação que em algum momento participaram de nossas atividades e possuem parte neste trabalho. Meu muito obrigado a todos. V
RESUMO Na atualidade a utilização de suplementos por atletas e frequentadores de academias é muito comum, sendo a utilização de glutamina bem difundida neste meio. Desta forma a investigação da associação da suplementação com glutamina ao treinamento aeróbio moderado torna-se de suma importância, pois o mesmo não é um aminoácido essencial, e deve ser utilizado na forma de suplemento em casos especiais, como doenças e exercícios exaustivos, como uma maratona. Logo, é necessário entender se de alguma forma esta suplementação pode alterar o metabolismo, promovendo alterações no estado redox e consequentemente o conteúdo de HSP70. O objetivo deste estudo foi analisar alterações no estado redox dos tecidos renal, hepático, adiposo epididimal, pancreático e muscular, e neste último o conteúdo de HSP70 em camundongos que realizaram treinamento aeróbio moderado, suplementados com L-glutamina durante seis semanas, além da análise do controle glicêmico destes animais. A associação dos tratamentos (TG) demonstrou melhorar a tolerância à glicose em três semanas, mantendo-se até o final da 6ª semana de tratamento, sendo que a suplementação (G) e o exercício (T) de forma isolada atingiram o mesmo resultado, porém apenas na 6ª semana de tratamento. O tecido muscular mostrou um aumento nas concentrações de MDA e da atividade das enzimas SOD e CAT (TG) (p<0,05), e a suplementação isolada (G) aumentou os níveis de MDA e a atividade da SOD no tecido pancreático (p<0,05), indicando um possível aumento no metabolismo oxidativo destes tecidos. Estes resultados demonstram que pode haver uma maior captação de glicose pelo musculo (gastrocnêmio) e um aumento da secreção de insulina pelo pâncreas em resposta ao exercício e a suplementação com glutamina, respectivamente. Não obstante estes animais sejam sadios, ou normoglicêmicos, estas alterações no seu metabolismo não produziram efeito hipoglicemiante durante o período experimental. Juntos, esses resultados sugerem que a associação da glutamina com o exercício moderado pode ser uma estratégia útil contra doenças relacionadas com a obesidade, como o diabetes tipo 2. Palavras-chave: Treinamento Aeróbio Moderado, Suplementação, Estresse Oxidativo. VI
ABSTRACT Nowadays the use of supplements by athletes and gym goers is very common, and the use of glutamine widespread this medium. Thus the investigation of the association of supplementation with glutamine to moderate aerobic training becomes extremely important, because it is not an essential amino acid and must be used in supplement form in special cases, such as disease and exhaustive exercise, as a marathon. Therefore, it is necessary to understand if somehow this supplementation may alter the metabolism, promoting changes in the redox state and therefore the content of HSP70. The objective of this study was to analyze changes in the redox state of renal tissue, liver, adipose epididymal, pancreatic and muscle, and in the latter the content of HSP70 in mice that underwent moderate aerobic training, supplemented with L-glutamine for 6 weeks, and analysis glycemic control these animals. The association of treatments (TG) was shown to improve glucose tolerance in three weeks, staying until the end of the 6th week of treatment, and that supplementation (G) and exercise (T) alone reached the same result, however, only the 6th week of treatment. The muscle tissue showed an increase in MDA concentrations and activity of enzymes SOD and CAT (TG) (p <0.05), and the isolated supplementation (G) increased MDA levels and the activity of SOD activity in pancreatic tissue (p <0.05), indicating a possible increase in the oxidative metabolism of these fabrics. These results demonstrate that there may be an increased glucose uptake by muscle (gastrocnemius) and an increased secretion of insulin by the pancreas in response to exercise and supplementation with glutamine, respectively. Despite these animals are healthy, or normoglycemic, these changes in metabolism did not produce hypoglycaemic effect during the experimental period. Together, these results suggest that glutamine and moderate exercise association can be a useful strategy against obesity related diseases as diabetes type 2. Keywords: Aerobic Training Moderate, supplementation, Oxidative Stress. VII
LISTA DE FIGURAS Figura 1. Avaliação de parâmetros relacionados ao consumo alimentar e hídrico de camundongos durante as seis semanas de suplementação com L-glutamina e treinamento aeróbio moderado...32 Figura 2. Avaliação de parâmetros relacionados as variações de peso de camundongos durante as seis semanas de suplementação com L-glutamina e treinamento aeróbio moderado...33 Figura 3. Avaliação de parâmetros relacionados ao percentual de gordura de camundongos após seis semanas de suplementação com L-glutamina e treinamento aeróbio moderado...37 Figura 4. Avaliação da glicemia durante o GTT de camundongos durante as seis semanas de suplementação com L-glutamina e treinamento aeróbio moderado...38 Figura 5. Área incremental sob a curva da resposta glicêmica ao GTT no período préintervenção, 3 e 6 semanas após a intervenção em camundongos durante as 6 semanas de suplementação com L-glutamina e treinamento aeróbio moderado...39 Figura 6. Avaliação de parâmetros relacionados ao estresse oxidativo tecidual do músculo gastrocnêmio em camundongos após 6 semanas de tratamento de suplementação com l-glutamina e treinamento aeróbio moderado...40 Figura 7. Expressão de HSP70 no músculo gastrocnêmio em camundongos após 6 semanas de tratamento de suplementação com l-glutamina e treinamento aeróbio moderado...41 Figura 8. Avaliação de parâmetros relacionados ao estresse oxidativo tecidual do pâncreas em camundongos após 6 semanas de tratamento de suplementação com l- glutamina e treinamento aeróbio moderado...42 Figura 9. Avaliação de parâmetros relacionados ao estresse oxidativo tecidual do fígado em camundongos após 6 semanas de tratamento de suplementação com l- glutamina e treinamento aeróbio moderado...43 Figura 10. Avaliação de parâmetros relacionados ao estresse oxidativo tecidual do adiposo branco epididimal em camundongos após 6 semanas de tratamento de suplementação com l-glutamina e treinamento aeróbio moderado...44 Figura 11. Avaliação de parâmetros relacionados ao estresse oxidativo tecidual do rim em camundongos após 6 semanas de tratamento de suplementação com l-glutamina e treinamento aeróbio moderado...45 Figura 12. Metodologia de treinamenamento...46 VIII
Figura 13. Metodologia de suplementação...46 Figura 14. Metodologia de aplicação do teste de tolerância a glicose GTT...46 IX
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ACC... Acetil CoA carboxilase ADP... Adenosina difosfato AMP... Adenosina monofosfato AMPK... Adenosina monofostato quinase ATP... Adenosina trifosfato CAC... Ciclo do ácido cítrico CAT... Catalase CTP1... Carnitina palmitoil transferase 1 DNA... Ácido desoxirribonucleico EO... Estresse oxidativo ERO... Espécies reativas de oxigênio GLN... L-glutamina GLUT4... Transportador de glicose tipo4 GSH... Glutationa reduzida GTT... Teste de tolerância a glicose HMGCoA redutase... 3-hidorxi-3-metilglutaril CoA redutase H 2 O... Água H 2 O 2... Peróxido de hidrogênio HSP70... Proteínas de choque térmico de 70 kda IKKβ... IkB quinase subunidade β i.p.... Intraperitoneal IRS-2... Substrato receptor de insulina2 JNK... c-jun amino terminal quinase kda... quilodaltons MDA... malondialdeído NH 4... Amônia NH 2... Grupamento amina O 2... Oxigênio O - 2... Ânion Superóxido OH -... Ânion hidroxila X
PI-3K... Fosfatidilinositol 3-quinase RNA... Ácido ribonucleico SOD... Superóxido dismutase TBARS... Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico V.O... Via oral XI
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO... 14 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 16 2.1 Glutamina... 16 2.2 Exercício aeróbio e adaptações no estado redox... 17 2.3 HSP70, Glutamina e Exercício Aeróbio... 19 3. OBJETIVOS... 22 3.1 Objetivo geral:... 22 3.1.1 Objetivos específicos:... 22 4. MATERIAIS E MÉTODOS... 23 4.1 Local de Realização... 23 4.2 Cuidados éticos... 23 4.3 Animais... 23 4.4 Adaptação... 24 4.5 Grupos experimentais:... 24 4.6 Treinamento... 24 4.7 Suplementação... 25 4.8 Perfil glicêmico... 25 4.9 Morte dos animais... 25 4.10 Peso Corpóreo e dos Tecidos... 26 4.11 Percentual de Gordura... 26 4.12 Preparação das amostras... 26 4.13 Dosagem de proteína... 27 4.14 Lipoperoxidação (TBARS)... 27 4.15 Atividade enzimática... 27 4.16 Expressão de HSP70... 27 4.17 Cálculo do tamanho amostral... 29 4.18 Análise estatística... 29 5. RESULTADOS... 30 6. DISCUSSÃO... 32 8. FIGURAS... 35
9. REFERÊNCIAS... 47 13
1. INTRODUÇÃO A suplementação com glutamina (GLN) é uma prática comum entre atletas e frequentadores de academias que buscam a melhora do seu desempenho. Fisiologicamente, este aminoácido é utilizado por diversas células como fonte de energia e, pelo sistema imune (linfócitos, monócitos/macrófagos e neutrófilos), para a replicação celular em quadros inflamatórios e infecciosos (BROSSMAN 2000; PHANVIJHITSIRI et al, 2006). A GLN também é um importante precursor na produção de amônia nos rins, para a manutenção do balanço ácido-base e da síntese de ureia hepática (PHANVIJHITSIRI et al, 2006). Além disso, este aminoácido é utilizado por diferentes tecidos na síntese de glutationa reduzida (GSH) (CRUZAT et al, 2009), principal antioxidante celular não enzimático. O músculo esquelético em atividade aumenta a síntese de GLN e sua liberação para a circulação, elevando a glutaminemia, contribuindo para o sistema de defesa antioxidante e imune. De outro lado, o aumento do metabolismo muscular gera elevação da produção e acúmulo de espécie reativa de oxigênio (ERO) (ex. OH -, O - 2, H 2 O 2 ), as quais podem promover danos celulares, por oxidação de moléculas lipídicas e proteicas, causando estresse oxidativo (EO) e consequente geração do resíduo MDA (PEREIRA, 1996). O exercício físico está, portanto, relacionado ao EO de duas maneiras: de um lado, elevando o metabolismo oxidativo gerando uma maior formação de ERO e, de outro, aumentando a disponibilização de defesas antioxidantes (CRUZAT et al, 2007; SANTOS et al, 2013), dessa forma não causaria o desequilíbrio. No entanto, durante a realização de exercício exaustivo, o estresse metabólico intenso é capaz de diminuir a disponibilidade de GLN, pela sua utilização como substrato metabólico intermediário do ciclo do ácido cítrico (CAC), para a síntese de adenosina trifosfato (ATP), o que reduz a disponibilidade de GLN para o sistema de defesa antioxidante e imune (CRUZAT; ROGERO; TIRAPEGUI, 2009). A homeostase metabólica e a prevenção do dano oxidativo podem, portanto, depender da proporcionalidade entre o volume, intensidade e regularidade dos exercícios físicos e 14
do balanço entre a produção de ERO e a disponibilida de GLN para o sistema de defesa antioxidante. Desta forma torna-se clara a necessidade de avaliar marcadores do estado redox nesta condição. Nesse sentido, o conteúdo de HSP70 pode ser utilizado como marcador, uma vez que estas proteínas são expressas em situações de estresse, como alterações na temperatura, no ph e no estado redox. O aumento da expressão destas proteínas pode representar uma falha nas defesas antioxidantes, por falta ou excesso de nutrientes, representando um importante marcador de EO (GRUNWALD et al, 2014). Neste sentido, a necessidade de suplementação com GLN pode ser dependente da intensidade do exercício e do quadro metabólico por ele representado. Em repouso, para manutenção da homeostase o organismo dispõe de uma verdadeira maquinaria no controle de nossas funções, dentre elas a manutenção da normoglicemia. Possuímos vários hormônios reguladores, dentre eles encontram-se o glucagon e a insulina, ambos secretados pelo pâncreas, pelas células α e β respectivamente. A secreção de glucagon é ativada pela hipoglicemia, iniciando o processo de glicogenólise no fígado. Já a secreção de insulina ocorre em situações de hiperglicemia, como no período pós-prandial, ou em indivíduos com diabetes mellitus tipo 2 não controlada. A insulina sinaliza para diferentes tecidos a disponibilidade de glicose para sua captação e utilização como fonte energética ou armazenamento na forma de glicogênio (músculo e fígado), ou de triacilglicerol (adipócitos). Estes dois processos hormonais mantém a normoglicemia. No entanto, podemos estimular a secreção de insulina através da administração de uma carga de GLN, aminoácido que é capaz de desencadear a secreção de insulina semelhantemente a ação da glicose. Além disso, durante a contração muscular, o musculo esquelético é capaz de captar a glicose circulante através da liberação das vesículas de GLUT4 para membrana muscular, sem a sinalização de insulina, mantendo esse processo ativo por até 8 h após o final da sessão de exercício. Desta forma é possível aumentar a captação de glicose com um menor esforço por parte das células β-pancreáticas secretoras de insulina. Portanto a associação de glutamina e exercício pode representar uma importante forma de controle do metabolismo da glicose. 15
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Glutamina A GLN é o aminoácido livre mais abundante do organismo humano. Este é composto por átomos de carbono, hidrogênio, oxigênio e nitrogênio, sendo classificado como neutro e nutricionalmente não essencial (ROGERO et al, 2003; JONES et al, 1998; JAN WERNERMAN 2013). A presença de dois grupos amino em sua estrutura reforçam suas funções características de transportador de nitrogênio e carreador de amônia (ROGERO et al, 2003). Cerca de 50 à 60% do pool de aminoácidos livres nas células musculares é composto por GLN (ROGERO et al, 2003; JONES et al, 1998; GARCIA; CURI, 2000). Este aminoácido é utilizado por diversas células como fonte de energia, tais como enterócitos e das células do sistema imune (linfócitos, monócitos/macrófagos e neutrófilos), neste caso estas por sua rápida replicação em quadros inflamatórios e infecciosos (BROSSMAN 2000; PHANVIJHITSIRI et al, 2006; JONES et al,1998). A GLN também é um importante precursor na produção de amônia nos rins, para a manutenção do equilíbrio ácido-base, e da síntese de ureia hepática (PHANVIJHITSIRI et al, 2006). Além disso, GLN também é utilizada na síntese do tripeptideo GSH, nosso principal antioxidante não enzimático (ROGERO et al, 2003; CRUZAT et al, 2007; PHANVIJHITSIRI et al, 2006). Por possuir em sua estrutura dois grupamentos amina (NH 2) é também um importante doador de nitrogênio na síntese de purinas e pirimidinas, constituintes dos ácidos desoxirribonucleico (DNA) e ribonucleico (RNA), desempenhando assim um importante papel na proliferação celular. 16
Na síntese proteica muscular este aminoácido desempenha um importante papel, visto que está associado à um aumento na captação de água (H 2 O) e das concentrações de nitrogênio, promove o anabolismo muscular (BROSSMAN 2000; PHANVIJHITSIRI et al, 2006; JONES et al,1998; ARAUJO et al, 2010). E durante a contração muscular no exercício, a síntese e exportação de GLN para a circulação estão aumentadas (CRUZAT et al, 2007). 2.2 Exercício aeróbio e adaptações no estado redox Durante a atividade muscular, a demanda energética pode superar a de repouso em até 35 vezes, enquanto o consumo de oxigênio (O 2 ) pode aumentar de 10 a 15 vezes. No metabolismo energético celular ocorre a redução completa de aproximadamente 95% de O 2 no sistema de transporte de elétrons mitocondrial, enquanto que o restante pode ser reduzido pelo metabolismo celular formando ERO (HECK, 2007; CRUZAT, 2007). O aumento nas concentrações de ERO e adenosina monofosfato (AMP), sinalizam a ativação da enzima adenosina monofosfato quinase (AMPK) para estimular o catabolismo de substratos na produção de novo ATP (SANTOMAURO JR et al., 2008). Logo o exercício físico regular, de caráter aeróbio, possui um importante papel sobre o metabolismo de glicose e ácidos graxos. Durante uma sessão de exercício aeróbio moderado o músculo esquelético é capaz de captar glicose sem a sinalização da insulina. Pertencente à família das enzimas ativadas através do estresse celular ocasionado principalmente pela depleção de ATP, a AMPK é responsável pela regeneração dos níveis de ATP através da oxidação de ácidos graxos e glicose (LENZ e SEYER, 2013). Quando a AMPK é ativada, é capaz de inibir duas enzimas, a 3- hidroxi-3-metilglutaril CoA redutase (HMGCoA redutase) e a acetil CoA carboxilase (ACC) (SANTOMAURO JR. et al, 2008). No fígado com a inativação da ACC as 17
concentrações de malonil CoA são insuficientes para inibir a carnitina palmitoil transferase 1 (CPT1). Desta forma há uma predominância na β-oxidação sobre a síntese de ácidos graxos. Assim a produção de energia prevalece sobre o gasto (SANTOMAURO JR. et al., 2008; COELHO et al., 2011; BRUCE et al, 2009). Na musculatura esquelética a AMPK contribui para manutenção da normoglicemia por dois mecanismos. A maior captação da glicose ocorre pelo aumento da translocação do transportador de glicose tipo 4 (GLUT4) e pela redução da resistência periférica a insulina (SANTOMAURO JR. et al., 2008). Além disso, esta enzima atua nas funções hipotalâmicas, modulando os eventos relacionados com a fome e a saciedade. Desta forma desempenha um papel chave na regulação do metabolismo celular e na manutenção da homeostase energética (FUJII; JESSEN; GOODYEAR, 2006). Neste processo o tecido muscular também utiliza o catabolismo de ácidos graxos no CAC como fonte energética para a manutenção de um tempo mais extenso de atividade aeróbia. A relação de oxidação de glicose é 2,3 vezes maior que a de ácidos graxos, demostrando que o catabolismo dos lipídios depende da utilização de carboidratos pelo CAC (SILVEIRA et al, 2011). Isso explica a eficiência do controle glicêmico durante exercícios de intensidade moderada, diminuindo a resistência periférica a insulina. Durante este processo de oxidação de substratos as ERO (ex. OH -, O - 2, H 2 O 2 ) são produzidas naturalmente. Entretanto, quando em excesso podem promover oxidações/danos celulares causando EO através da lipoperoxidação tecidual (PEREIRA, 1996). Sendo assim o exercício físico está relacionado ao EO de duas maneiras: Primeiro ele acelera o metabolismo oxidativo gerando uma maior formação de ERO, e em seguida através do efeito protetor antioxidante gerado através de sessões regulares, aumenta a disponibilização de antioxidantes que podem prevenir o dano oxidativo e consequentemente, o EO (CRUZAT et al, 2007; SANTOS et al, 2013), mantendo o equilíbrio do estado redox. 18
Dentre as defesas antioxidantes de nosso organismo encontramos a GSH. A síntese deste importante antioxidante não enzimático depende das concentrações plasmáticas de GLN. Aminoácido este que possui 80% de suas concentrações no músculo esquelético, o que supera em 30 vezes a concentração plasmática. Logo o tecido muscular esquelético é o maior produtor de GLN do nosso organismo (CRUZAT et al, 2007; GARCIA; CURI, 2000), sendo o aminoácido livre mais abundante do organismo humano. Segundo Opara e cols. (1995):... a suplementação com glutamina atenua o desenvolvimento do ganho excessivo de peso e previne a hiperglicemia em camundongos B/6J alimentados com dieta hiperlipídica. Por que a GLN, em altas doses, tem mostrado ser segura em humanos, nossos dados sugerem a possibilidade deste amino ácido ser utilizado como agente antiobesidade e antidiabético em sujeitos pré-diabéticos e diabéticos. Em animais obesos por ingestão de dieta hiperlipídica suplementados com glutamina, houve um aumento da resistência a insulina no tecido adiposo e diminuição da mesma no músculo esquelético. Desta forma houve uma diminuição da massa de gordura, que atenuou a resistência a insulina e a ativação de c-jun amino terminal quinase (JNK) e IkB quinase subunidade β (IKKβ), aumentando a captação e utilização de glicose pelo músculo e pelo fígado (PRADA et al., 2007). 2.3 HSP70, Glutamina e Exercício Aeróbio Para que um organismo seja capaz de sobreviver, é necessário possuir a capacidade de responder a diversas formas de estresse fisiológico e ambiental, de acordo com o prejuízo ocasionado (GUISBERG; MORIMOTO, 2013). Neste sentido, uma das formas de resposta ao estresse celular é desencadear a expressão de proteínas de choque térmico, as quais atuam como chaperonas moleculares, estabilizando ou auxiliando no dobramento de proteínas, garantindo sua conformação tridimensional. Assim, evita-se que ocorra a agregação proteica, garantindo a manutenção da proteostase intracelular (HARTL; BRACHER; HAYER-HARTL, 2011). 19
Logo, as proteínas de choque térmico auxiliam nos processos celulares de síntese, dobramento, transporte e translocação de proteínas, garantindo sua funcionalidade. Dentre as famílias das proteínas de choque térmico, nosso estudo evidencia as proteínas da família HSP70, pois se apresentam mais conservadas e em maior concentração nos seres eucariontes. Estas possuem um papel essencial na proteostase (HU; MAYER; TOMITA, 2006), uma vez que sua ação chaperona molecular assiste ao dobramento proteico em todas as células. Além disso, possuem um importante papel anti-inflamatório e antioapoptótico (RICHTER-LANDSBERG, 2007). Estas proteínas possuem várias isoformas dependendo do compartimento celular no qual se encontram, desempenhando diferentes funções. Dentre elas destaca-se a forma induzível HSP72, aumentando sua expressão sob processos de estresse celular (MAYER e BUKAU, 2005; HECK et al, 2011). Situações de estresse celular como sessões de exercício aeróbio provocam alterações no estado redox, pelo aumento no consumo de oxigênio durante o processo de oxidação de substratos na produção energética, e consequentemente diminuição de ph intracelular e aumento da temperatura corporal. Estes processos podem ser extremamente prejudiciais ao organismo, levando em consideração que nossas enzimas possuem sua funcionalidade ligada a um ph e temperatura ótimos, fora dos quais podem ser desnaturadas com perda total de suas funções. Porém nosso organismo possui meios de manter a homeostasia celular nestas alterações fisiológicas. Desta forma a HSP70 possui função citoprotetora, ou seja, esta proteína possui a capacidade de estabilizar proteínas evitando sua desnaturação em situações de estresse celular como as provocadas por sessões de exercício, processos inflamatórios, alterações no estado redox, endotoxinas e infecções. Desta forma a expressão de HSP70 evita que estes processos ocasionem prejuízos irreversíveis que podem desencadear mutações e/ou apoptose celular (GRUNWALD et al, 2014). Além disso o aumento da expressão de HSP70 inibe a fosforilação de JNK, diminuindo a resistência a insulina no tecido muscular. Em camundongos modificados geneticamente para uma super-expressão de HSP72 no trabalho de Henstridge e cols. (2014), os animais 20
alimentados com dieta hiperlipídica apresentaram aumento do número de mitocôndrias musculares, diminuição de triacilglicerol muscular, da massa corporal, principalmente de tecido adiposo epididimal, e da glicemia e insulinemia de jejum, além de uma melhor resposta ao teste de tolerância à glicose (do inglês, glucose tolerance test - GTT). Estas alterações metabólicas permitiram a estes camundongos também um tempo maior de exposição a testes de esforço incrementais, e uma maior tolerância ao exercício de exaustão. Desta forma pode-se notar que a expressão de HSP72 está fortemente vinculada as adaptações ocasionadas pelo treinamento aeróbio de intensidade moderada em fibras oxidativas. Além disso a suplementação com GLN pode potencializar a expressão de HSP70 cerca de 3,7 vezes em pacientes com sepse após 7 dias de administração (ZIEGLER et al, 2005) na dose de 1g/kg. Estas duas pesquisas evidenciam que a expressão das proteínas de choque térmico da família HSP70, não possuem apenas um papel de proteção, mas também de adaptação celular a situações de estresse ambientais. Desta forma o aumento do conteúdo destas proteínas no meio intracelular muscular levam a resposta adaptativa necessária ao treinamento físico. Sendo assim, e sabendo-se que a expressão de HSP70 pode ser potencializada através da suplementação com L-glutamina, estudar a associação destes é de suma relevância. 21
3. OBJETIVOS 3.1 Objetivo geral: Avaliar os efeitos do treinamento aeróbio moderado associado à suplementação com glutamina na tolerância a glicose e no estresse oxidativo de camundongos. 3.1.1 Objetivos específicos: Avaliar a tolerância a glicose em camundongos treinados e suplementados com L-glutamina. Avaliar a lipoperoxidação tecidual nos tecidos metabólicos gastrocnêmio, fígado, pâncreas, rins e adiposo branco epididimal em camundongos treinados e suplementados com L-glutamina. Avaliar a atividade enzimática da catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD) nos tecidos metabólicos gastrocnêmio, fígado, pâncreas, rins e adiposo branco epididimal em camundongos treinados e suplementados com L-glutamina. Avaliar a expressão de HSP70 no tecido muscular em camundongos treinados e suplementados com L-glutamina. 22
4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 Local de Realização Laboratório de Ensaios Biológicos Departamento de Ciências da Vida Universidade Regional do Noroeste do Estado do Rio Grande do Sul UNIJUÍ. Rua do Comércio nº3000, Bairro Universitário, Ijuí/RS. 4.2 Cuidados éticos Este trabalho foi submetido e aprovado pela Comissão no Uso de Animais Universidade Regional do Noroeste do Estado do Rio Grande do Sul pelo parecer consubstanciado nº 017/2013. 4.3 Animais Foram utilizados 28 camundongos Swiss, com idade de 3 meses, pesando em média 35 + 3g, provenientes do Biotério da UNIJUI Universidade Regional do Noroeste do Estado do Rio Grande do Sul. Estes animais foram mantidos em gaiolas semi-metabólicas forradas com maravalha, quatro animais por gaiola, em ambiente com temperatura controlada (22 +3 ºC), umidade relativa do ar entre 50% e 60% e iluminação artificial, com ciclos de 12 horas claro/escuro. Os grupos receberam ração padronizada para animais de laboratório (Nuvilab CR-1) e água potável ad libidum. As quantidades de água e ração ingeridas pelos animais foram controladas durante o período do estudo. Os animais permaneceram durante todo o período de tratamento no biotério da UNIJUI. 23
4.4 Adaptação Por 3 dias consecutivos os animais receberão 100µl de PBS ph 7,4 via oral (V.O.) (para simular a intervenção da suplementação) e 1 hora depois foram submetidos a natação, sem adição de carga durante 10 minutos em tanque específico, para a adaptação ao meio líquido no qual realizaram o treinamento. Os animais não foram manipulados por 72 horas e depois iniciaram o protocolo de treinamento aeróbio e/ou suplementação com glutamina. 4.5 Grupos experimentais: Após o período de adaptação os animais foram divididos em quatro grupos: Controle Sedentário (C, N=8): estes animais não realizaram exercício e receberam por gavagem PBS ph 7,4. Treinado (T, N=8): estes animais realizaram exercício e receberam por gavagem PBS ph 7,4. Glutamina Sedentário (G, N=8): estes animais não realizaram exercício e receberam por gavagem Glutamina diluída em PBS ph 7,4, na dose de 1g/kg. Treinado Glutamina (TG, N=8): estes animais realizaram exercício e receberam por gavagem Glutamina diluída em PBS ph 7,4, na dose de 1g/kg. 4.6 Treinamento Os animais dos grupos T e TG foram submetidos a treinamento aeróbico de intensidade moderada, 5 dias por semana, com carga inicial de 2% de seu peso corporal na primeira semana e de 4% a partir da segunda semana acopladas na base da cauda do animal. A duração da sessão de natação foi progressiva, iniciando em 20 minutos (1ª e 2ª semanas), e aumentando 10 minutos por semana até alcançar 60 minutos de natação na sexta semana de treinamento. A natação foi realizada em 24
tanque especial para natação de camundongos (39x59x30cm), dividido em 12 partes (13x14,7x30cm) preenchido com água a 20 cm de altura numa temperatura de 30 ºC + 1 ºC. Os grupos controles foram mantidos sem adição de carga durante o mesmo tempo em outro tanque com 2 cm de água em mesma temperatura (adaptado de HECK, 2011). 4.7 Suplementação Os grupos T e TG receberam suplementação com L-glutamina (1.0g/Kg) foi realizada através de gavagem V.O. (1mL/100g de peso corporal) na dose de 1g/kg de peso corporal 5 vezes por semana, 1 hora antes da sessão de exercício, os grupos C e T receberam PBS ph 7,4 nas mesmas proporções. 4.8 Perfil glicêmico Os animais foram submetidos ao teste de tolerância a glicose (do inglês glucose tolerance test GTT) antes do início da intervenção, na terceira e na sexta semana após a intervenção. Após jejum de 12 horas foi verificada a glicemia no tempo zero (t=0 ). Posteriormente foi administrada solução de glicose via intraperitoneal (i.p.), na dose de 1g/Kg e realizado monitoramento da glicemia nos tempos 30 e 120 minutos. A resposta glicêmica durante o GTT foi avaliada pelo cálculo da área incremental sob a curva (AISC) de glicose pelo método do trapézio (MATTHEWS et al, 1990). A concentração de glicose sanguínea foi verificada com Glicosímetro Optium Xceed da Abbott, por meio de punção venosa na parte distal da cauda dos animais. 4.9 Morte dos animais Após o último GTT os animais permaneceram sem manipulação por 48 horas, período após o qual foram mortos por decaptação, sendo coletados o sangue e tecidos 25
muscular (gastrocnêmio), hepático, renal, adiposo epididimal e pancreático para análises bioquímicas e moleculares. 4.10 Peso Corpóreo e dos Tecidos O peso corporal dos animais foi aferido semanalmente a partir do início do protocolo experimental até o último dia de intervenção. Após a morte dos animais, o tecido adiposo epididimal foi imediatamente coletado, pesado e congelado para posterior análise. Todas as pesagens foram realizadas em balança semi-analítica Marte. 4.11 Percentual de Gordura O percentual de gordura foi calculado através da divisão do peso do tecido adiposo coletado pelo valor do peso total do animal no dia do sacrifício. 4.12 Preparação das amostras Os tecidos adiposo branco epididimal, muscular (gastrocnêmio), pancreático, renal e hepático foram dissecados e homogeneizado: em tampão KPi com inibidores de protease para as análises enzimáticas (CAT, SOD) e análise da lipoperoxidação tecidual por TBARS; e em SDS 0,01% com inibidores de protease para análise do conteúdo de HSP70. Estes procedimentos foram realizados no Laboratório de Ensaios Biológicos/UNIJUÍ. 26
4.13 Dosagem de proteína A concentração de proteína foi determinada pelo método espectrofotométrico de Bradford, a 595nm, utilizando curva padrão de albumina (1mg/ml) (BRADFORD, 1976). 4.14 Lipoperoxidação (TBARS) A determinação da lipoperoxidação foi realizada no Laboratório de Ensaios Biológicos/UNIJUÍ, utilizando o método de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) (BUEGE & AUST, 1978), como medida dos parâmetros de estresse oxidativo, por espectrofotometria em 535 nm (ZANCHI et al., 2008). 4.15 Atividade enzimática A atividade da Superóxido Dismutase (SOD) foi avaliada pelo método Marklund & Marklund (1974), a 420nm. A reação consiste na inibição da auto oxidação do pirogalol pela atividade da enzima SOD. A atividade da Catalase (CAT) foi determinada através da decomposição do peróxido de hidrogênio a 25ºC, em 240nm de absorbância (AEBI, 1984). Os resultados foram expressos em USOD e pmol/mg de proteínas respectivamente. Este procedimento foi realizado no Laboratório de Ensaios Biológicos/UNIJUÍ. 4.16 Expressão de HSP70 O conteúdo celular de HSP70 foi verificado por meio da separação por eletroforese desnaturante de quantidades idênticas de proteínas carregadas em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). De cada homogeneizado celular 27
foi realizado a dosagem de proteína pelo método de Bradford (BRADFORD, 1976), homogeneizadas novamente (a uma razão mínima de 1:1) com tampão para eletroforese (50 mm Tris ph 6,8, SDS 10% (w/v), glicerol 10% (v/v), 2-mercaptoetanol 10% (v/v) e 2 mg/ml azul de bromofenol) e fervidas por 5minutos para desnaturação completa das proteínas. Quantidades iguais de proteína (~40μg por poço) foram aplicadas no gel, para separação durante 4 h utilizando corrente elétrica constante a 15 ma por gel. Foi utilizado o sistema vertical Slab Gel BIO-RAD Mini-Protean TetraCell (BIO-RAD Laboratories, Richmond, CA, USA) preenchido com tampão contendo Tris a 25 mm e SDS a 1% (m/v), ph 8,3. Foi usado gel de entrada (empilhamento) a 4% e gel de separação a 10% (em termos de monômeros de acrilamida). Foi usado como marcador de peso molecular 5 μl de mistura de proteínas recombinantes pré-coloridas (RPN800E, GE Health Care) por gel. A escolha por este padrão de peso molecular deve-se a presença de marcação em 76 kda (próximo a proteína de interesse, HSP70, com ~70kDa) além da marcação em 43kDa (peso aproximado ao da proteína actina, utilizado como normalizador). Depois da separação pela corrida em gel de poliacrilamida, a porção referente ao gel de entrada foi descartada e a porção referente ao gel de separação foi submetida a eletrotranferência. Neste procedimento foi utilizado o sistema refrigerado BIO-RAD Blot Cell a 100V constantes por 2 h para promover a transferências das proteínas e padrões coloridos do gel para uma membrana de nitrocelulose (GE Health Care-Amersham). A confirmação do sucesso dos procedimentos descritos acima foi confirmada pela coloração da membrana de nitrocelulose com Vermelho Ponceau S (Red Ponceau S, sal de sódio 0,3%, Sigma, em solução de ácido tricloroacético a 3%). Após este procedimento, as membranas foram descoradas com solução TBS (Tris- Glicina-Metanol a respectivamente 25mM-192nM-10%)-Tween 0,1% (v/v). Os procedimentos de imunoblotting (Western blots) foram realizados por meio de incubação da membrana de PVDF em tampão de bloqueio (leite em pó desnatado a 1% em TBS-Tween 0,1%) por 30 minutos, seguido de incubação em anticorpo anti- HSP70 (Sigma H5147) diluído 1:1000 por 6 horas (4-8 ºC). Após a membrana foi 28
submetida a 3 lavagens com solução de TBS-Tween 0,1%, e então incubada com anticorpo anti-mouse contendo peroxidase (Sigma A9044) diluído 1:15000 por 1 hora a temperatura ambiente. A membrana foi lavada novamente por 3 vezes em solução de TBS-Tween 0,1% para imunodetecção. A imunodetecção foi realizada pelo método de quimiluminescência (ECL Plus RPN2132, GE). As bandas de proteína (HSP70 e Actina) foram reveladas em filme (Amersham Hyperfilm ECL, GE Health Care), fotodocumentadas e quantificadas no programa ImageJ (http://imagej.nih.gov/). O conteúdo de actina tecidual foi mensurada por meio da coloração do gel de poliacrilamida com corante Azul de Coomassie [Coomassie Blue R 250 (0.1% w/v), ácido acético glacial (10% v/v) e metanol (40% (v/v)], fotodocumentado e quantificado no programa ImageJ para normalização do conteúdo de HSP70. 4.17 Cálculo do tamanho amostral O cálculo do tamanho da amostra foi realizado para utilização do menor número possível de animais em cada experimento. O tamanho da amostra foi calculado para detectar a menor diferença esperada entre os grupos na principal variável dependente do estudo, a glicemia de jejum. De acordo com projeto piloto realizado previamente pelo nosso grupo de pesquisa, a diferença esperada é de 20mg/dl na glicemia de jejum, sendo o maior desvio-padrão esperado de ±15 mg/dl). Foi utilizado para o cálculo um poder estatístico de 80% para um nível de significância de 0,05%. 4.18 Análise estatística Os resultados foram expressos como médias +DP e analisados por ANOVA de uma via, e para analisar a associação ANOVA de duas vias, seguido de teste post-hoc de Tukey, considerando nível de significância estatística o limite de 5% (p<0,05). 29
5. RESULTADOS A suplementação com glutamina (G), o treinamento aeróbio moderado (T) ou a associação destes (TG) não alterou o consumo semanal de ração dos camundongos (fig.1-a), porém o treinamento de forma isolada (T) foi capaz de aumentar o consumo semanal de água (fig.1-b). O treinamento aeróbio moderado foi capaz de diminuir a massa corporal dos animais (fig.2-a) diminuindo até 8% da massa corporal nos grupos T e TG (fig.2-b) e também propiciou a diminuição do percentual de gordura (fig.3) nestes mesmos grupos, chegando a valores inferiores a 1% de gordura corporal quando comparado ao grupo C. Já a suplementação com glutamina (G) não foi capaz de alterar estes parâmetros, mantendo a massa e adiposidade corporal dos animais iguais as do grupo controle (C). Durante a realização dos GTTs (fig. 4), nos tempos 0, 3ª e 6ª semanas, não houve diferença entre os grupos quanto a glicemia de jejum (T=0 ), no pico glicêmico (T=30 ) e no final do teste. (T=120 ). Para melhor avaliar a resposta dos animais ao GTT, calculamos a área incremental sob a curva (AISC), pois através dela pode-se mensurar diferenças na tolerância a carga de glicose imposta a estes animais. A tolerância a glicose melhorou com a associação dos tratamentos (TG) já na 3ª semana de intervenção, mantendo-se estável até a 6ª semana, enquanto os tratamentos isolados levam o dobro do tempo para obter os mesmos resultados, ou seja, apenas na 6ª semana de intervenção (fig. 5). A associação dos tratamentos (TG) demonstrou se capaz de aumentar a lipoperoxidação (fig.6-a), a atividade enzimática da CAT (fig. 6-C) e da SOD (fig. 6-B), sem promover alterações na ração SOD/CAT (fig. 6-D) no músculo gastrocnêmio. Desta forma podemos perceber que o treinamento aeróbio associado à suplementação com L- glutamina não ocasiona quebra na homeostase entre estas enzimas. Todavia, mesmo 30
na presença de uma atividade enzimática aumentada, o dano às membranas lipídicas não foi atenuado. As alterações dos parâmetros de estresse oxidativo visualizados na fig. 6 não foram suficientes para desencadear uma resposta das proteínas de estresse, HSP70 (fig. 7). Todos os tratamentos mantiveram seus níveis de expressão desta proteína iguais aos do grupo controle (C). Esta resposta demonstra que não houveram alterações no estado redox do tecido muscular. No pâncreas a suplementação com GLN aumentou as concentrações de MDA (fig.8-a) e a atividade da SOD (fig.8-b). Já a associação dos tratamentos aumentou a atividade da CAT (fig.8-c) sem ocasionar alterações na ração SOD/CAT (fig.8-d). Já no fígado não houve alteração nas concentrações de MDA (fig.9-a) e na atividade da SOD (fig.9-b). Porém houve uma diminuição na atividade da CAT (fig.9-c), ocasionando um aumento na razão SOD/CAT (fig.9-d), o que demonstra que o exercício aeróbio moderado promoveu um desequilíbrio enzimático neste tecido. No tecido adiposo branco epididimal as concentrações de MDA (fig.10-a), ou na atividade das enzimas SOD (fig.10-b) e CAT (fig.10-c) mantiveram-se inalteradas. Mesmo assim a associação dos tratamentos apresentou um aumento na razão SOD/CAT (fig.10-d), demonstrando um desequilíbrio na atividade enzimática neste tecido. No rim não foram observadas alterações em nenhuma das variáveis de estresse oxidativo aqui avaliadas (concentração de MDA, atividade de CAT e SOD) (fig. 11). 31
6. DISCUSSÃO Nosso estudo demonstrou que a suplementação com GLN na forma livre não alterou o percentual de gordura dos animais. A associação dos tratamentos de exercício aeróbio e suplementação com glutamina apresentou melhora na tolerância a glicose já na terceira semana de tratamento. Já os grupos T e G, apresentaram melhora semelhante na tolerância a glicose na sexta semana de intervenção. Estes dados corroboram com o trabalho de Prada e cols. (2007) com camundongos alimentados com dieta hiperlipídica e suplementados com GLN que apresentaram diminuição da fosforilação de tirosina no IRS2 e a associação IRS2/PI-3K no tecido adiposo, produzindo neste tecido um efeito de resistência a insulina, o que diminui a captação de glicose e o acúmulo de gordura nos adipócitos. Nossos animais, por efeito já esperado do exercício, apresentaram uma diminuição do percentual de gordura. No mesmo estudo a suplementação com GLN demonstrou manter a fosforilação de tirosina nos mesmos níveis dos animais controles na musculatura esquelética e no fígado, inibindo a ação da dieta hiperlipídica como estopim para a resistência a insulina. Neste contexto pode-se esperar a suplementação com L-glutamina possa auxiliar como normoglicemiante de duas formas: aumentando a captação de glicose pela musculatura e pelo fígado, e evitando um maior acúmulo de gordura corporal, evitando o desenvolvimento de processos inflamatórios decorrentes da obesidade. Alguns estudos como o de Odegaard e cols. (2010) demonstram que a GLN é capaz de estimular a secreção de insulina no pâncreas. Para tanto há uma necessidade de que haja nas células β-pancreáticas um aumento na razão ATP/ADP, que estimula o fechamento dos canais de K + ATP despolarizando a membrana celular, e abrindo os canais de Ca ++ voltagem dependentes. Neste momento o aumento das concentrações de Ca ++ no citosol promove a exocitose das vesículas de insulina das células beta. Este processo normalmente é promovido por um aumento nas concentrações de glicose, porém, um aumento nas concentrações de GLN também podem desempenhar o mesmo papel (ODEGAARD et al 2010; McCLENAGHAN & FLATT, 1999; WOLLHEIN & MAECHLER, 2002). 32
De acordo com estes autores e sabendo-se que o exercício aeróbio promove adaptações como o aumentando do número de mitocôndrias e a reserva lipídica intramiocelular (BELMONTE & AOKI, 2005) e é capaz de ativar a enzima AMPK (SANTOMAURO JR et al., 2008) acelerando a oxidação de nutrientes como ácidos graxos, diminuindo a resistência à insulina periférica e aumentado a capacidade de produção energética, a associação do exercício aeróbio a suplementação com GLN foi eficiente no controle glicêmico de nossos animais. Estas evidências nos levam a entender as alterações de EO encontradas no tecido pancreático com aumento das concentrações de MDA, da atividade da SOD penas com a suplementação de GLN (G) (secretor de insulina) e nos tecidos muscular esquelético com a associação dos tratamentos (TG) ocasionando um aumento da lipoperoxidação tecidual (captador de glicose). Uma proteína de papel chave em situações de estado redox alterado para a proteção e manutenção da homeostasia celular são as HSP70. Conhecidas com chaperonas são expressas em grandes quantidades no interior das células quando suas enzimas ou suas estruturas correm riscos de danos irreversíveis por mudanças de ph e/ou temperatura. Desta forma nosso protocolo de tratamento não demonstrou qualquer tipo de alteração na expressão destas proteínas, sendo considerado não danoso ao organismo. Diferente do trabalho de Petry e cols. (2014), no qual animais que realizaram treinamento de alta intensidade e suplementados com GLN mostraram um aumento no conteúdo de HSF1 e de HSP70, além uma diminuição na produção de MDA e um aumento nas defesas enzimáticas nos músculos sóleo e gastrocnêmio. Nossos resultados comparados aos de Petry e cols. (2014) demonstram que o treinamento aeróbio de intensidade moderada não representou um desafio capaz de alterar a expressão de HSP70 muscular mesmo no grupo TG, sabendo-se que a GLN é um potencializador da expressão de HSP70. 33
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS A partir dos resultados deste estudo, a suplementação com GLN associada ou não ao exercício aeróbio moderado demonstrou melhorar a tolerância à glicose, atuando de forma relevante no controle glicêmico, sem ocasionar hipoglicemia em animais normoglicêmicos. Ainda, a GLN de forma isolada não alterou o percentual de gordura corporal, pois como demonstrado em outros estudos possui uma capacidade de produzir resistência a insulina no tecido adiposo. Sendo assim temos como perspectivas utilizar este tratamento em animais previamente obesos pela administração de dietas ricas em gorduras saturadas e carboidratos simples, para testar sua capacidade normoglicemiante frente a um organismo com alterações metabólicas. 34
8. FIGURAS Figura 1. Avaliação de parâmetros relacionados ao consumo alimentar e hídrico de camundongos durante as 6 semanas de suplementação com L-glutamina e treinamento aeróbio moderado Consumo de ração (A), Consumo de água (B). Os valores foram expressos em média + DP. C, sedentário (n=7), T, treinado (n=8), G, sedentário suplementado com L-glutamina (n=7), TG, treinado suplementado com l-glutamina (n=6). Análise estatística por Anova de uma via, seguida do teste post hoc de Tukey. (A) p=0,3735, (B)* p<0,05 em comparação com o grupo G. 35
Figura 2. Avaliação de parâmetros relacionados as variações de peso de camundongos durante as 6 semanas de suplementação com L-glutamina e treinamento aeróbio moderado Representação do peso nos períodos pré e pós tratamento (A), representação do peso relativo ao final do tratamento (B). Os valores foram expressos em média + DP. C, sedentário (n=7), T, treinado (n=8), G, sedentário suplementado com L-glutamina (n=7), TG, treinado suplementado com l-glutamina (n=6). Análise estatística por Anova de uma via, seguida do teste post hoc de Tukey. (A) *p<0,01 em comparação com o grupo C, p<0,05 em comparação com o grupo G. (B) **p=0,0057 em comparação com os grupos C e G. 36
Figura 3. Avaliação de parâmetros relacionados ao percentual de gordura de camundongos após 6 semanas de suplementação com L-glutamina e treinamento aeróbio moderado. Os valores foram expressos em média + DP. C, sedentário (n=7), T, treinado (n=8), G, sedentário suplementado com L- glutamina (n=7), TG, treinado suplementado com l-glutamina (n=6). Análise estatística por Anova de uma via, seguida do teste post hoc de Tukey. *p<0,05 em comparação com o grupo C. 37
Figura 4. Avaliação da glicemia durante o GTT de camundongos durante as 6 semanas de suplementação com L-glutamina e treinamento aeróbio moderado. Período pré-tratamento (A), após três semanas de tratamento (B) e após seis semanas de tratamento (C). Os valores foram expressos em média + DP. C, sedentário (n=7), T, treinado (n=8), G, sedentário suplementado com L-glutamina (n=7), TG, treinado suplementado com l-glutamina (n=6). Análise estatística por Anova de uma via, seguida do teste post hoc de Tukey. (A) (B) e (C) p>0,05. 38
Figura 5. Área incremental sob a curva da resposta glicêmica ao GTT no período pré intervenção, 3 e 6 semanas após a intervenção em camundongos durante as 6 semanas de suplementação com L-glutamina e treinamento aeróbio moderado. Área incremental sob a curva nos três GTTs IAUC (A), IAUC pré e pós tratamento (B). Os valores foram expressos em média + DP. C, sedentário (n=7), T, treinado (n=8), G, sedentário suplementado com L-glutamina (n=7), TG, treinado suplementado com l-glutamina (n=6). Análise estatística por Anova de duas via, seguida do teste post hoc de Tukey. (A) *p=0,0119 em comparação com os demais grupos, p<0,05 em comparação com o grupo C. 39
Figura 6. Avaliação de parâmetros relacionados ao estresse oxidativo tecidual do músculo gastrocnêmio em camundongos após 6 semanas de tratamento de suplementação com l- glutamina e treinamento aeróbio moderado. Concentrações de MDA (A), atividade enzimática das enzimas SOD (B) e CAT (C), razão SOD/CAT (D). Os valores foram expressos em média + DP, relativo ao grupo Controle. C, sedentário (n=7), T, treinado (n=8), G, sedentário suplementado com l-glutamina (n=7), TG, treinado suplementado com l-glutamina (n=6). Análise estatística por Anova de uma via, seguida do teste post hoc de Tukey. (A) *p<0,05 vs o grupo C e G. (B) * p<0,05 vs o grupo C e T. (C) * p<0,05 em comparação com o grupo C. (D) p=0,0761 40
Figura 7. Expressão de HSP70 no músculo gastrocnêmio em camundongos após 6 semanas de tratamento de suplementação com l-glutamina e treinamento aeróbio moderado. Os valores foram expressos em média + DP. n=5 em todos os grupos. Análise estatística por Anova de uma via, seguida do teste post hoc de Tukey. p = 0,4317. 41
Figura 8. Avaliação de parâmetros relacionados ao estresse oxidativo tecidual do pâncreas em camundongos após 6 semanas de tratamento de suplementação com l-glutamina e treinamento aeróbio moderado. Concentrações de MDA (A), atividade enzimática das enzimas SOD (B) e CAT (C), razão SOD/CAT (D). Os valores foram expressos em média + DP, relativo ao grupo Controle. C, sedentário (n=7), T, treinado (n=8), G, sedentário suplementado com l-glutamina (n=7), TG, treinado suplementado com l-glutamina (n=6). Análise estatística por Anova de uma via, seguida do teste post hoc de Tukey. (A) *p<0,05 vs grupo C (B)* P<0,05 vs grupos C e T. (C) * p<0,05 vs grupos C, T e G. (D) p=0,2845. 42
Figura 9. Avaliação de parâmetros relacionados ao estresse oxidativo tecidual do fígado em camundongos após 6 semanas de tratamento de suplementação com l-glutamina e treinamento aeróbio moderado. Concentrações de MDA (A), atividade enzimática das enzimas SOD (B) e CAT (C), razão SOD/CAT (D). Os valores foram expressos em média + DP, relativo ao grupo Controle. C, sedentário (n=7), T, treinado (n=8), G, sedentário suplementado com l-glutamina (n=7), TG, treinado suplementado com l-glutamina (n=6). Análise estatística por Anova de uma via, seguida do teste post hoc de Tukey. (A) p=0,6970. (B) p=0,0715. (C ) *p<0,05 vs os grupos C e G. (D) *p<0,05 vs os demais grupos. 43
Figura 10. Avaliação de parâmetros relacionados ao estresse oxidativo tecidual do adiposo branco epididimal em camundongos após 6 semanas de tratamento de suplementação com l-glutamina e treinamento aeróbio moderado. Concentrações de MDA (A), atividade enzimática das enzimas SOD (B) e CAT (C), razão SOD/CAT (D). Os valores foram expressos em média + DP, relativo ao grupo Controle. C, sedentário (n=7), T, treinado (n=8), G, sedentário suplementado com l-glutamina (n=7), TG, treinado suplementado com l-glutamina (n=6). Análise estatística por Anova de uma via, seguida do teste post hoc de Tukey. (A) p=0,0874. (B) p=0,6238. (C) p=0,0504. (D) * p<0,05 vs grupo C. 44
Figura 11. Avaliação de parâmetros relacionados ao estresse oxidativo tecidual do rim em camundongos após 6 semanas de tratamento de suplementação com l-glutamina e treinamento aeróbio moderado. Concentrações de MDA (A), atividade enzimática das enzimas SOD (B) e CAT (C), razão SOD/CAT (D). Os valores foram expressos em média + DP, relativo ao grupo Controle. C, sedentário (n=7), T, treinado (n=8), G, sedentário suplementado com l-glutamina (n=7), TG, treinado suplementado com l-glutamina (n=6). Análise estatística por Anova de uma via, seguida do teste post hoc de Tukey. (A) p=0,7928. (B) p=0,0504. (C) p=0,5560. (D) p=0,1694. 45
Figura 12. Metodologia de treinamento. A) Animais em repouso, grupos C e G. B) Animais em treinamento, grupos T e TG. C) Delineamento experimental, intensidade (carga) e volume (tempo) de treinamento semanal. Figura 13. Metodologia de suplementação. Figura 14. Metodologia de aplicação do teste de tolerância a glicose GTT. 46