Construção de biblioteca em vetor fosmídio, baseada no kit EpiFos (Epicentre) As bibliotecas com vetor fosmídio possibilitam a manutenção de uma coleção de fragmentos de 35-45 Kb dos genomas, com estabilidade segura devido a manutenção de clones com um cópia do inserto. O sucesso deste procedimento está vinculado ao sistema de clonagem de fragmentos aleatórios (hydroshear), reparados antes da construção. O controle do tamanho dos fragmentos pode ser feito em gel de agarose. Este tipo de fragmentação possibilita uma boa varredura genômica, quando comparado com outros sistemas de fragmentação. Por exemplo, a fragmentação genômica com enzimas de restrição é baseada em cortes em pontos específicos do genoma, ou seja, não aleatório. Isto limita diversidade da coleção de fragmentos a serem clonados. Lógica do processo: 1- Purificação do DNA desejado 2- Fragmentação do DNA em pedaços com cerca de 40 Kb 3- Reparo das pontas dos fragmentos (terminais 5 fosforilados) 4- Checagem do tamanho do DNA reparado em gel de agarose de baixo ponto de fusão 5- Purificação dos fragmentos com ponta abrupta (reparada) que estão no gel 6- Ligação dos fragmentos purificados ao vetor fosmídio 7- Empacotamento do produto da ligação, infecção e plaqueamento em meio específico Características do vetor: Usaremos como exemplo o vetor pepifos-5 com 7.518 pb, da empresa Epicentre Illumina Company, que já vem preparado para a inserção (linearizado) com apenas um ponto de corte em Eco72 I, desfosforilado e testado. Suas características incluem: 1- Resistência ao antibiótico clorafenicol (marcador de seleção) Página 1 de 1
2- Regulação do número de cópias em E. coli (E. coli F factor-based partitioning) 3- Afinidade para empacotamento em Bacteriófago Lamba (sítio Cos ou clivagem em lambda-terminase) 4- Bacteriofago P1com sítio loxp preparado para clivagem com a Cre-recombinase 5- Bacteriofago T7 com promoter para RNA polimerase flanqueando o sítio de clonagem Cuidados e preparo da construção 1- Após a extração do DNA genômico (livre de DNA de organelas), cheque a qualidade em eletroforese 2- Separe de 20 a 40 μg do DNA genômico de elevado peso molecular (DNA que será a base para a construção), ressuspendendo-o em TE ou água para um volume final de 100 μl. Lembre-se que a exposição do DNA a ser clonado à luz Ultra-violeta pode diminuir bruscamente a eficiência da clonagem, mesmo em tempos muito curtos. 3- EPI100-T1 R Plating Strain é fornecido como estoque em glicerol. Antes de iniciar a construção da biblioteca, acondicione as células EPI100 -T1 R em uma placa com meio de cultivo LB, SEM adicionar antibióticos ao meio de cultivo. Cresça as células a 37 C durante a noite. Após o crescimento, vede bem a placa e coloque a 4 C. 4- No dia anterior ao empacotamento no bacteriófago, inocule uma única colônia das células EPI100 - T1 R em 50 ml de meio de cultivo LB contendo 10 mm de MgSO 4. Coloque para crescer a 37 C durante a noite. 5- O fosmídio de 36 Kb utilizado como controle no kit Epicentre pode ser usado como marcador de tamanho na eletroforese para seleção dos fragmentos a serem clonados. Página 2 de 1
6- O DNA de controle de ligação do lambda (λci857 Sam7), bem como o controle da cepa (LE392MP) podem ser empregados para testar a eficiência do MaxPlax Packaging Extracts do Kit Epicentro. Fragmentação do DNA genômico e eletroforese 1- Fragmente o DNA genômico (10 a 20 μg) usando o Hydroshear, uma seringa de vidro para HPLC ou outro método, mas cuide para que haja um controle a fim de obter DNA com alto peso molecular (30 a 50 Kb); 2- Submeta a amostra à eletroforese. O ideal é usar gel de agarose LMP 1%, com voltagem baixa (20 a 30 V), durante toda a noite, em um ambiente refrigerado. Se houver uma fonte de Pulse Field disponível, a qualidade dos fragmentos separados será mais precisa. Porém, eletroforese convencional também funciona, com uma qualidade um pouco mais baixa, sobretudo quando os fragmentos forem muito grandes, mais que 30 Kb. Faça uma eletroforese limpa, sem brometo, usando agarose nova e tampão TAE ou TBE recémpreparados. Monte o gel seguindo o modelo abaixo. Como o brometo de etídio diminui a eficiência da ligação e, consequentemente da clonagem, siga o modelo: Controle da fragmentação 1. Esta etapa é importante para assegurar que a eletroforese vai acumular uma fração de fragmentos entre 30 e 50 Kb. Se 10% ou mais do DNA genômico migrar juntamente com o DNA controle, prossiga com o protocolo. Se o DNA genômico migrar mais lentamente que o controle, significa que a fragmentação foi curta e será necessário fragmentar o DNA genômico outra vez. Se o DNA genômico migrar mais rápido que o controle, significa que este foi muito fragmentado e deverá ser isolado novamente. 2. Caso o laboratório não tenha um Hydroshear, é recomendado utilizar uma seringa de HPLC, com poro de 200 μl (furo da ponta da seringa). O DNA deverá ser aspirado e expelido de 50 a 200 vezes, lentamente. Inicialmente é bom testar o tamanho dos fragmentos em gel para assegurar que o procedimento será viável. Para isso, faça uma fragmentação prévia e recolha 10 microlitros do DNA a cada 50 passagens pelo poro e depois aplique todas as amostras simultaneamente em agarose a 1% e corrida de 20 cm, a 30 V, durante a noite. Faça a eletroforese com marcador de peso molecular, pois há a necessidade de verificar o tamanho dos fragmentos gerados. Página 3 de 1
3. O lambda Mono Cut Mix (abaixo) pode ser uma boa alternativa para checar os tamanhos dos fragmentos: Após estabelecidas as condições de fragmentação do genoma alvo, faça a fragmentação de 20 microgramas. Após a fragmentação, repare as pontas dos fragmentos utilizando o componente End-Repair Enzyme Mix and 10X Buffer, dntps e ATP, disponível no Kit da Epicentre. Este passo é extremamente importante, pois ele vai resolver as pontas das fitas tornando-as abruptas com a extremidade 5 fosforilada. Em geral, o tempo da reação de reparo deve ser controlado de acordo com a quantidade de DNA alvo e esta reação pode variar dependendo do fabricante do Kit ou do protocolo caseiro. Para o reparo: 1- Descongele todos os componentes sobre o gelo, evitando choques bruscos de temperatura; 2- Com todos os reagentes ainda no gelo, prepare uma mistura de: 1. L de água estéril b. 8 L de End-Repair 10 Buffer c. 8 L de 2,5 mm dntp Mix d. 8 L de 10 mm ATP 1. L de DNA contendo até 20 g de inserto (0,5 g/ L) e. 4 L de End-Repair Enzyme Mix f. leve o volume final para 80 L com água autoclavada Página 4 de 1
3- Incube à temperatura ambiente por 45 minutos 4- Adicione tampão de carga (tampão da amostra) e incube a 70 C por 10 minutos para inativar a End-Repair Enzyme. Após o reparo será necessário selecionar os fragmentos reparados por tamanho. Para isso, utilize eletroforese em gel de agarose de baixo ponto de fusão. O ideal é utilizar eletroforese de campo pulsado, seguindo as recomendações do fabricante do aparelho, para a separação de fragmentos de DNA com 10-100 Kb de tamanho. Se isso não for possível, faça a eletroforese convencional: 1- Prepare um gel a 1% com tampão TAE ou TBE 1, em uma cuba cuja corrida possa alcançar 20 cm a 20-30 V durante a noite. Não utilize mini-gel, pois ele não oferece resolução para separação de regiões com 20-60 Kb. Não utilize brometo de etídio no gel; 2- Carregue 100 ng de DNA controle de fosmídio nas canaletas externas e carregue as amostras (futuros insertos) nas canaletas internas ou num super poço; 3- Faça a eletroforese e, após o término, remova o gel cuidadosamente da cuba (agarose LMP é muito mole) e mergulhe-o em uma solução contendo TAE 1 e Syber Green ou Gold, seguindo as recomendações do fabricante. Recorte a fração alvo, com cerca de 40 Kb e transfira para um tubo limpo; OBS: Não exponha as amostras à luz ultravioleta ou ao brometo de etídio, pois isto reduz a eficiência da clonagem. Caso o laboratório não tenha o transiluminador com luz negra e Syber, proceda com a eletroforese alternativa, descrita a seguir: Eletroforese alternativa A eletroforese ideal é em gel de agarose LMP 1%, com voltagem baixa (20 a 30 V), durante toda a noite, em um ambiente refrigerado. Se houver uma fonte de pulse Field disponível, a qualidade dos fragmentos separados será mais precisa. Porém, eletroforese convencional também funciona, com uma qualidade um pouco mais baixa, sobretudo quando os fragmentos forem muito grandes, mais que 30 Kb. Faça uma eletroforese limpa, sem brometo, usando agarose nova e tampão TAE ou TBE recém-preparados. Monte o gel seguindo o modelo abaixo. Como o brometo de etídio diminui a eficiência da ligação e, consequentemente da clonagem, seguindo o modelo: 1- Aplique nos poços 1 e 2 o marcador de peso e 5 µl da amostra reparada; Página 5 de 1
2- Deixe um poço vazio (3) e junte três poços com fita adesiva para formar um super poço (4); 3- Aplique o restante da amostra no poço 4; 4- Corra a eletroforese nas condições descritas acima. Ao final, recorte a tira dos poços 1 e 2 e core com brometo de etídio; 5- Verifique o DNA e marque a posição do trecho desejado, comparando com o marcador da canaleta 1; 6- Retire o gel do transiluminador e posicione-o ao lado do gel não corado. Por comparação, recorte o gel não corado no trecho desejado e coloque o recorte em um tubo para purificação com Kit e continue com a clonagem de acordo com o protocolo do vetor desejado. OBS: se o objetivo for corar o DNA com Syber Gold ou Green, não haverá problemas com a eficiência da ligação e clonagem. Assim, a eletroforese poderá ser normal. Mas lembre-se que a observação em ultravioleta do transiluminador também diminui muito a eficiência da clonagem. Recuperação dos fragmentos Os fragmentos devem ser recuperados com Kits apropriados para evitar a perda excessiva de DNA. Mesmo que o experimento tenha partido de 20 g, após a eletroforese, boa parte é pedida. Além disso, também há perda no processe de purificação. Aqui será descrito o método com a enzima Gelase, mas outros podem ser igualmente utilizados. 1- Transfira o gel recortado para um tubo limpo, esterelizado, de 15 ml, com tampa de rosca; 2- Recupere o DNA selecionado utilizando os tampões: GELase 50 Buffer e GELase Enzyme Preparation. Para tal: 3- Prepare dois banhos-maria: 70 C e 45 C; 4- Pese um tubo vazio para estimar o peso do gel, pois 1 mg de gel solidificado renderá 1 ml de agarose derretida após a fusão; 5- Coloque o tampão GELase 50 a 45 C. Derreta a agarose incubando o tubo com o gel+amostras a 70 C por 15 minutos. Cuide para não fazer movimentos muito bruscos com o tubo. Assim que o gel dissolver, transfira o tubo rapidamente para o banho a 45 C; Página 6 de 1
6- Adicione a solução de GELase 50, pré-aquecida a 45 C, para alcançar a concentração final de 1 ; 7- Homogeneíze muito CUIDADOSAMENTE e adicione GELase Enzyme Preparation, sendo 1 L (1U) da solução de enzima para cada 100 L de agarose derretida. Note que deveremos usar um tubo graduado; 8- Homogeneíze CUIDADOSAMENTE a solução a mantenha a 45 C, misturando suavemente a cada 10 minutos, por 1 hora; 9- Após este período, transfira a solução para o banho a 70 C por 10 minutos para inativar a enzima GELase; 10- Transfira 500 L dessa solução estéril para tubos de 1,5 ml e coloque-os no gelo por 5 minutos. Centrifugue as amostras com velocidade máxima (10.000-14.000 rpm) por 20 minutos para isolar oligossacarídeos ou outros componentes indesejados. Pellets gelatinosos, escuros ou opacos indicam a presença desses componentes. Após a centrifugação, remova 90% do sobrenadante (onde está o DNA que vai ser inserido), tomando muito cuidado para não se aproximar do pellet (muitas vezes é impossível de ver, mas estará lá) e transfira esse sobrenadante para outro tubo estéril de 1,5 ml; 11- Precipite o DNA adicionando com 1:10 (v:v) de acetato de sódio 3M (ph 7.0) autoclavado. Misture a solução suavemente e adicione 2,5 volumes de etanol P.A., de excelente qualidade, se possível, filtrado. Tampe o tubo e misture por inversão. Mantenha à temperatura ambiente por 10 minutos para a precipitação do DNA. Centrifugue as amostras de 10.000 a 14.000 rpm (capacidade máxima da centrífuga). Retire todo o sobrenadante e lave duas vezes com álcool 70% ultra puro, se possível filtrado, repetindo as centrifugações; 12- Cuide para não perder o pellet; 13- Após a segunda lavagem com álcool 70%, deixe o pellet secar por 10 minutos. Se o pellet secar muito irá dificultar a ressuspensão do DNA. Ressuspenda o pellet em tampão água, Tris HCl ou TE autoclavado (melhor é água). 14- Determine a concentração final em um fluorometro, nanodrop ou método. A quantificação por eletroforese funciona, mas como haverá pouco DNA, será um risco. Reação de ligação Nesta estapa serão utilizados os seguintes componentes do Kit da Epicentre: tampão de ligação Fast-Link 10, Fast-Link DNA Ligase, ATP e o pepifos-5 Cloning-Ready Vector. Antes de iniciar a reação de ligação, é importante calcular e conferir o número de clones fosmídio que serão Página 7 de 1
necessários para o trabalho que irá desenvolver. Uma simples reação de ligação poderá produzir de 10 3 a 10 6 clones, dependendo da qualidade do fragmento (inserto) que será inserido. 1- Calcule o número de reações de ligação que serão realizadas. Em geral, a taxa usada é de 10 partes do vetor para 1 parte de inserto. 0,5 μg de vetor corresponde a 0,1 pmol. Para fragmentos de 40 Kb, 0,25 μg corresponde a 0,01 pmol. Assim sendo, é fundamental conhecer a concentração do DNA fragmentado que conseguiu recuperar; 2- Coloque os reagentes na ordem a seguir e misture bem após a adição de cada um: a. 10:1 molar do vetor pepifos-5 para o inserto é o recomendado, ou seja, 10 molar de vetor para cada 1 molar de inserto. b. 0,5 μg pepifos-5 (Cloning-Ready) Vector, ou seja, 0,1 pmol de vector. c. 0,25 μg of 40 Kb de DNA inserto, ou seja, 0.009 pmol de inserto. i. μl de água destilada ultra-pura (verificar o volume final). ii. 1 μl do tampão Fast-Link Ligation 10. iii. 1 μl de 10 mm ATP. iv. 1 μl do vetor pepifos-5 (0,5 μg/μl). v. μl de DNA (inserto) concentrado (0,25 μg of 40 kb DNA) vi. 1 μl de Fast-Link DNA Ligase. vii. Ajuste para um volume final de 10 μl. O tempo de incubação pode variar de 1 a 24 horas à temperatura ambiente. Tempos muito curtos diminuem a chance de ligação vetor-vetor, inserto-inserto, ou composições indesejadas, mas diminui também o número de insertos ligados. É recomendado usar um tempo intermediário (overnight), contudo, bons resultados são obtidos com 3 horas de incubação. Preparo de meios e placas Esta etapa é importante ser cumprida antes da infecção, no dia da ligação. Preparo de meio líquido Prepare 50 ml de meio LB-Broth (50 ml de água, 1,25 g de meio, 500 μl de MgSO 4 1M {10 mm na solução final}) e autoclave. Quanto o meio esfriar, adicione 1 ml de uma solução de Maltose a 10% {0,2% na solução final}, previamente filtrada em Millipore 0,2 μm. Prepare 400 ml de meio LB-Ágar (400 ml de água e 14 g de meio) e autoclave. Assim que o meio atingir entre 50 C, adicione clorafenicol (12,5 μg por ml) e homogeneíze o meio; Página 8 de 1
Distribua o meio em placas de Petri limpas e autoclavadas. Isolamento de colônia para a infecção É nesta etapa que será produzida a colônia que receberá o vetor contendo o inserto. Em geral, as bactérias vêm no kit, e são bactérias específicas e com excelente tolerância para a manutenção de um vetor por bactéria. E elas precisam ser cultivadas para isolamento de uma única colônia para que toda a biblioteca seja produzida sob os efeitos de um genoma. 1- Separe 10 μl de bactérias competentes fornecida no Kit (EPI 100) e dilua em 1 ml de solução salina ou meio LB-Broth, autoclavados. Pipete 100 μl da solução e faça uma nova diluição; 2- Prepare duas placas com meio LB-Agar e aplique em cada uma 20 μl da segunda diluição. Espalhe as bactérias com uma alça ou esperas de vidro; 3- Faça o crescimento das colônias a 37 C durante a noite; 4- Dentre as colônias, escolha uma claramente isolada, marque-a com uma caneta. Cresça esta colônia em 10 ml de meio LB-Broth (condições descritas anteiormente) durante a noite. Coloque as placas na geladeira. Estas ainda poderão ser usadas nas etapas seguintes. Preparo da infecção 1- Retire um tubo de MaxPlax Lambda Packging Extracts (fornecido no kit) do freezer a -80 C e coloque no gelo. Em geral, cada tudo vem com 50 μl. 2- Depois de descongelado, transfira 25 μl de Max Plax extract para um microtubo de 1,5 ml autoclavado. A outra metade será usada posteriormente; 3- Adicione 10 μl do produto de ligação para cada 25 μl do extrato e misture a solução por pipetagem, tomando o cuidado para não formar bolhas; 4- Centrifugue brevemente (spin) e incube a 30 C por 90 minutos; 5- Adiocione os 25 μl de Max Plax extract restantes e incube novamente nas mesmas condições; 6- Ao final, adicione 940 μl de PDB PDB = Phage Dilution Buffer. 10 mm de MgCl 2 6H 2 O; 100 mm de NaCl; 10 mm de Tris. Prepare 50 ml e autoclave. 7- Homogeneíze a solução e adicione 25 μl de clorofórmio PA. Homogeneíze a solução com cuidado e estoque-a a 4 C em geladeira. Esta solução com vírus reconstruídos pode ficar viscosa ou com um precipitado branco. Isto não interfere na construção da biblioteca. Esta solução é suficiente para produzir e testar inúmeras vezes as infecção. Se for bem Página 9 de 1
estocada, poderá durar um bom tempo e repetir a construção da biblioteca a partir deste produto de empacotamento viral. Crescimento da colônia para a infecção Esta fase é crítica para a produção da biblioteca em vetor fosmídio. Há um momento ideal de crescimento da colônia em que as bactérias estão mais susceptíveis à infecção. Este momento pode ser monitorado pela taxa de crescimento da cultura de células. Nós utilizamos um biofotômetro para o monitoramento. A cada meia hora a taxa foi medida em OD 600. O Kit indica que a taxa ideal está entre 0,8 a 1,0. Em nossa experiência tivemos bons resultados com 0,95 a 1,1. Para esta etapa: 1- Aplique 5 ml de bactérias competentes (obtidas no passo de isolamento da colônia para a infecção) em 50 ml meio LB-Broth (contendo 500 μl de MgSO4 a 1M e 1 ml de maltose 10%); 2- Coloque para crescer em agitação intensa a 37 C; 3- Depois da primeira hora, monitore a taxa de crescimento a cada meia hora, até obter um valor de OD 600 entre 0,9 e 1,1; Exemplo de Teste de crescimento 1 ml de Epi300, recém crescidas em 50 ml de meio 1 hora OD 600 = 100 1 hora e 30 minutos OD 600 = 200 2 horas e 30 minutos OD 600 = cerca de 500 3 horas OD 600 = cerca de 900 Diluição do produto de infecção (empacotamento) Nesta fase é importante testar diluições do produto de empacotamento para obter uma condição ótima de infecção: tubo 1 - não diluído tubo 2-10 μl de phago em 990 μl de PDB tubo 3-100 μl do tubo 2 em 900 μl de PDB tubo 4-100 μl do tubo 3 em 900 μl de PDB Página 10 de 1
Note que após a infecção e produção da biblioteca (itens mais a frente), o produto da infecção poderá ser utilizado para produzir novas bibliotecas. Assim, a melhor condição de diluição poderá ser adotada. Infecção, crescimento e seleção de colônias 1- Aplique 20 μl de cada tubo (com e sem diluição) a 100 μl de células hospedeiras selecionadas com taxa de crescimento entre de OD 600 0,9 a 1,5 e homogeneíze a solução suavemente; 2- Coloque para crescer em tubos Falcon de 5-10 ml a 37 C em banho-maria (sem agitar) por 20 a 40 minutos, sendo que a cada 10 minutos depois dos 20, remova 40 μl da solução e aplique placa com LB-Agar-clorafenicol (placas preparadas como descrito anteriormente); 3- Deixe crescer em estufa bacteriológica a 37 C durante a noite; 4- Se tudo correr bem, haverá muitas colônias. Selecione as colônias com um bom crescimento e com tamanhos similares. Em geral, colônias menores, de crescimento mais lento ou com as bordas estriadas, não possuem o inserto, mas por mutações e recombinações possuem resistência. Organização e controle da qualidade da biblioteca 1- Prepare 200 ml de meio LB-Broth e autoclave. Após esfriar, adicione 200 μl de solução de indução de fosmídios (Epicentre) e 1 ml de clorafenicol (12,5 μg/ml). Distribua em placas de crescimento 1 ml por poço ou então em microtubos; 2- Colete uma pequena porção de cada colônia recém-crescida, utilizando um palito de dentes autoclavado e leve até o poço com meio. Faça de modo organizado para marque as colônias. Tome um super cuidado para colher apenas a parte central de cada colônia, com um leve toque da ponta do palito na mesma. Evite coletar de colônias muito próximas, sobrepostas ou com crescimento muito diferente (tamanho); 3- Após a coleta, deixe crescer durante a noite, a 37 C sob agitação intensa; 4- No outro dia proceda com a Mini Prep para isolamento de vetor + inserto com elevado peso molecular. Mini Prep Página 11 de 1
Nesta etapa os vetores carregados serão isolados no DNA genômico. Há vários cuidados a serem tomados, como a qualidade das soluções de lise e separação, bem como os procedimentos relacionados ao manuseio e homogeneização das soluções. Se a coleta de colônias foi adequada, podemos esperar ao final de cada minipreparação, milhares de cópias de apenas um conjunto vetor/inserto. Caso contrário, mesmo que a mini-preparação seja boa, a contaminação atrapalhará no sequenciamento e reconhecimento do conteúdo do inserto. Para a Mini Prep descreveremos um extração com ki (Qiagen) em placas e uma segunda por método caseiro. O uso de Kit é o mais adequado pois estes usam filtros e membranas ajustados para reter as construções de elevado peso molecular (FOS e BACs, por exemplo). No método caseiro isso fica mais complicado e a chance de contaminação com DNA genômico é bem maior. Mini Prep com Kit para colônias crescidas em placas de cultivo com 96 poços Soluções da Qiagen 1- Após o crescimento das colônias, leve a placa até um fluxo laminar, e estoque as colônias em placas de estoque (96 poços) organizadas exatamente na mesma posição da placa de crescimento (cultivo). Note que essas placas possuem letras e números que servem como orientação. Por exemplo: p1frta1 = placa 1, fosmídio de R. tenuis, poço na posição a1. Essa será a designação daquela exata colônia.para o estoque prepare uma solução de glicerol a 80% em solução salina ou água, e autoclave. Coloque em cada poço da placa de estoque 100 μl de Glicerol e 100 μl da cultura, homogeneíze por pipetagem (5 vezes). Para agilizar, é melhor utilizar uma micropipeta multicanal. Estoque a - 80 C; 2- Centrifugue a placa de cultivo a 4000 rpm por 10 minutos; 3- Descarte o sobrenadante e deixe-a virada de boca para baixo para esgotar o máximo possível de meio. Cuide para não escorrer o pellet de bactérias; 4- Adicione 90 μl do tampão de ressuspensão e estabilização (Tampão 1 da Qiagen N. 1014875). Ressuspenda o pellet por agitação vigorosa (Vortex). Cuide para que todos os pellets tenham sido totalmente dissolvidos; 5- Adicione 150 μl do tampão de lise (Tampão 2 da Qiagen N. 1014948). Neste ponto a pipetagem e a homogeneização devem ser muito suaves, lentas, para não fragmentar nem o vetor (muito grande) nem o genoma bacteriano. Deixe parado na bancada po 1 minuto; 6- Adicione 150 μl do tampão de neutralização (Tampão 3 da Qiagen N. 1014964). Neste ponto a pipetagem e a homogeneização devem ser também muito suaves, lentas, para não fragmentar nem o vetor (muito grande) nem o genoma bacteriano; 7- Centrifuge a 4000 rpm por 5 minutos. Após a adição do tampão de neutralização, é formado um precipitado branco. Cuide para não coletá-lo ao remover o sobrenadante; Página 12 de 1
8- Prepare uma placa de coleta com 270 μl de isopropanol em cada poço e posicione uma placa com filtro acima da placa de coleta. Remova 380 a 390 μl do sobrenadante e dispense na placa de filtro; 9- Centrifugue o conjunto placa de filtro (contendo a amostra) e placa de coleta (contendo isopropanol) a 2100 giros por 30 minutos. Neste ponto, o uso de rotor móvel (swing-rotor) específico para placas é requerido. Caso não haja, será necessário utilizar o conjunto filtro+microtubos; 10- Descarte o filtro e o isopropanol; e adicione 300 μl de etanol 70% (PA) em cada poço da placa de coleta. Lá estará a amostra com vetor+inserto. Cetrifugue a 4000 por 10 minutos; 11- Descarte o etanol 70% e deixe a placa aberta, de boca para cima, em um fluxo laminar ligado para haver fluxo de ar (NÃO LIGUE A UV); 12- Quando as amostras estiverem secas; ressuspenda em 100n μl de água MillQ autoclavada durante toda a noite em geladeira; 13- Quantifique as amostras em NanoDrop, fluorímetro ou outro; 14- Proceda com o controle de qualidade da biblioteca por corte com enzima de restrição e eletroforese em agarose. Mini Prep método caseiro 1- Distribua as amostras em tubos de 1,5 ml, devidamente marcados com as indicações de cada colônia; 2- Centrifugue a 12000 rpm por 3 minutos. Descarte o sobrenadante e deixe os tubos de boca para baixo para escorrer o máximo possível de meio; 3- Adicione o pellet em 100 μl de GTE e ressuspenda o pellet agitando vigorosamente (em Vortex); 4- Adicione 200 μl de tampão de lise, preparado no momento do uso e agite suavemente por inversão do tubo; 5- Coloque o tubo no gelo por 10 minutos; 6- Adicione 150 μl de acetato de potássio 3M ph = 5,0 (ou acetato de sódio) e misture por inversão suavemente; 7- Coloque os tubos no gelo por 20 minutos; 8- Centrifugue a 10000 rpm por 5 minutos e transfira o sobrenadante (onde está a construção) para um novo tubo; 9- Adicione 500 μl de fenol:clorofórmio (1:1, v:v) e misture por inversão, suavemente, até obter uma solução homogênea; 10- Centrifugue a 10000 rpm por 5 minutos e transfira o sobrenadante para um novo tubo; Página 13 de 1
11- Adicione 1 ml de etanol absoluto gelado e deixar a 20 o C por 15-20 horas, OU acrescente 0,6 1mL de isopropanol de deixe por 2 horas (escolha uma das duas precipitações). Centrifugue a 12000 rpm por 10 minutos; 12- Descarte o sobrenadante e adicione 500 μl de etanol 70%. Misture a solução e centrifugue a 12000 rpm por 10 minutos; 13- Descarte o sobrenadante e repita o passo 12. Descarte o etanol e deixe o tubo de boca para baixo secando; 14- Elua o DNA em 100 μl de água ou Tris durante noite. Quantifique as amostras em NanoDrop, fluorímetro ou outro; 15- Proceda com o controle de qualidade da biblioteca por corte com enzima de restrição e eletroforese em agarose. Soluções: GTE Esta solução é utilizada para romper as bactérias na Mini Prep. Pode ser preparada, autoclavada e estocada em geladeira. Alguns protocolos adicionam lisozima 4 mg/ml ao GTE, pouco antes do uso. Esta enzima geralmente é empregada para degradar parede celular densa, que não é o caso da E. coli, porém, aumenta muito a eficiência da lise. Para preparar 100 ml de GTE, dissolva 0,9 g de glicose (50 mm), 25 ml de Tris HCl, ph 8,0, 1M (25 mm na solução final), 2 ml de EDTA, ph 8,0, 0,5M (10 mm na solução final) em 50 ml de água destilada. Misture bem a solução, alcance o volume de 100 ml em um balão volumétrico e autoclave. Tampão de lise Como esta solução é preparada no momento do uso, calcule o volume que será utilizado para todos os microtubos (número de colônias). Por exemplo: 200 µl/microtubo para 40 microtubos, dissolva em 7,04 ml água, 160 µl de NaOH 10M (0,2 mm na solução final) e 800 µl de SDS 10% (1% na solução final). Homogeneíze e use imediatamente. Tampão de neutralização Esta solução é a responsável pela separação do DNA vetor do DNA genômico. O acetato em ph baixo precipita tudo, exceto o DNA circular do vetor, por ser menor que o genômico. Por isso, não pode haver fragmentação do DNA nos passos iniciais, senão haverá contaminação. Calcule o volume que será utilizado, de acordo com o número de microtubos. Por exemplo: 150 µl/microtubo para 40 microtubos, dissolva acetato de potássio 6M (para obter 5 M na solução Página 14 de 1
final) e ácido acético glacial (para obter 5 M na solução final) em água. Prepare a solução no momento do uso. Note que o acético é muito volátil. Página 15 de 1