Farmácia Noturno 2013 Quimioterápicos: conceito e mecanismo de ação II Fernanda Abreu fernandaaabreu@micro.ufrj.br
Histórico: Agentes Antimicrobianos 1860- Joseph Lister- fenol em instrumentação cirúrgica 1909- Paul Ehrlich- salvarsan (composto arsênico)-sífilis 1929- Alexander Fleming*- penicilina 1932- Gerhard Domagk* -prontosil (sulfonamida) 1939- aparecimento de resistência bacteriana 1940- H. Florey* & E. Chain* -utilização da penicilina 1944- Selman Waksman *e Albert Schatz- estreptomicina 1945- Edward Abrahan- isolamento cefalosporina C 1946- Selman Waksman - isolamento neomicina 1947- Cloranfenicol, o primeiro antibiótico de amplo espectro 1960- Descobre-se as cefalosporinas... *** A partir desse momento todos acreditavam que a cura para todas as doenças infecciosas havia sido encontrada. Staphylococcus aureus X Penicillium notatum
Agentes antimicrobianos Em curto espaço de tempo: aparecimento de estirpes resistentes à droga. S. Aureus MRSA Resultado da pressão natural seletiva ocasionada pelo uso clínico de antibióticos e na agropecuária como promotores de crescimento e agentes profiláticos. Associado à globalização ( diminuição de barreiras geográficas).
Agentes antimicrobianos Relação entre a quantidade utilizada e aparecimento de estirpes resistentes. Aparecimento de resistência: frequência e período de uso, concentração elevada.
Resistência a agentes antimicrobianos Resistência Intrínseca X Resistência Adquirida Definição RI: resistência resultante do estado fisiológico do micro-organismo ou da sua organização estrutural. Ex.: Vancomicina em Gram-negativas. Vancomicina Ampicilina
Resistência a agentes antimicrobianos Resistência Intrínseca X Resistência Adquirida Vancomicina Definição RI: resistência resultante do estado fisiológico do microorganismo ou da sua organização estrutural. Ex.: Vancomicina em Gramnegativas. Ampicilina
Resistência a agentes antimicrobianos Resistência Intrínseca X Resistência Adquirida Definição RA: decorrente de mutações no material genético bacteriano ou da aquisição de material genético codificando genes de resistência. Estará presente em algumas estirpes da espécie bacteriana. Genes de resistência podem estar: - no cromossoso; - em plasmídeos, podendo ser parte integrante ou não de transpósons ou de integrons. Podem ser transferidos horizontalmente entre diferentes estirpes, espécies e gêneros disseminação da resistência.
Resistência a agentes antimicrobianos Resistência adquirida Plasmídeos de resistência: Denominados plasmídeo R; São amplamente distribuídos em Gram-positivas e negativas; Tamanho variado de 2 a 200kb; Pode conter 1 (resistência simples) a vários (resistência múltipla) genes de resistência a drogas; Alguns contêm genes que permitem autotransferência (plasmídeos conjugativos);
Resistência a agentes antimicrobianos Resistência adquirida Plasmídeos de resistência: Tabela página 544
Resistência a agentes antimicrobianos Resistência adquirida Genes de resistência: Os que não possuem genes de autotransferência podem ser mobilizados para transferência por : plasmídeos conjungativos; Ex.: Recombinação entre plasmídeo conjugativo (A) e plasmídeo não conjugativo (B):
Resistência a agentes antimicrobianos Resistência adquirida Genes de resistência: Os que não possuem genes de autotransferência podem ser mobilizados para transferência por : plasmídeos conjungativos; Transdução gereneralizada (fagos: geralmente limitada a única espécie ou espécies relacionadas); Podem estar em transpósons; Ou transpósons conjugativos;
Resistência a agentes antimicrobianos Resistência adquirida Genes de resistência: Os que não possuem genes de autotransferência podem ser mobilizados para transferência por : Podem estar em transpósons; Ou transpósons conjugativos; Transpósons: segmentos de DNA que podem transpor de uma posição para outra na mesma molécula de DNA ou outra diferente. Ex.: Cromossomo X plasmídeo Tn conjugativos possuem genes para autotransferência entre bactérias.
Resistência a agentes antimicrobianos Resistência adquirida Genes de resistência: Em transpósons: Tabela página 545
Resistência a agentes antimicrobianos Resistência adquirida Mecanismos de acúmulo de genes de resistência a drogas em uma molécula de DNA: 1. Integração sucessiva de transpósons carreando genes de resistência a drogas ao longo de múltiplas gerações bacterianas; Figura pág 555
Resistência a agentes antimicrobianos Resistência adquirida Mecanismos de acúmulo de genes de resistência a drogas em uma molécula de DNA: 2. Aquisição de integrons; Integrons são elementos genéticos compostos por um sistema de recombinação sítio-específica que reconhece e captura cassetes móveis de genes. Um integron inclui: Um gene que codifica uma integrase (inti) utilizada na reação de recombinação e seu promotor; Um promotor Pc para expressão dos genes componentes do cassete Um ou mais cassetes de genes Figura pág 556
Resistência a agentes antimicrobianos Resistência adquirida Mecanismos de acúmulo de genes de resistência a drogas em uma molécula de DNA: 2. Aquisição de integrons; Cassetes de genes são elementos genéticos móveis que podem existir como moléculas circulares livres incapazes de se duplicar ou integrados no sítio atti de um integron. Contem um sítio attc na extremidade 3.
Resistência a agentes antimicrobianos Resistência adquirida Mecanismos de acúmulo de genes de resistência a drogas em uma molécula de DNA: 2. Aquisição de integrons; - Um integron pode ter mais de um cassete de genes que serão expressos em quantidade diferentes. - No caso de haver diferentes cassetes, a pressão seletiva para determinado determinante genético, selecionará outros genes de resistencia presentes no integron. Figura pág 558 Mobilidade dos integrons está relacionada a sua presença frequente em transpósons, plasmídeos conjugativos ou mobilizáveis.
Resistência a agentes antimicrobianos Origem dos genes de resistência O período entre o início do uso e aparecimento de resistência é pequeno, o que torna improvável que a mutação espontânea seja responsável unicamente pela resistência; Todos os mecanismos identificados até o momento em estirpes relacionadas a infecções são também encontrados em microorganismos do ambiente. Maior probabilidade: genes evoluíram em organismos produtores de antibióticos como forma de proteção e foram subsequentemente transferidos horizontalmente.
Resistência a agentes antimicrobianos Medidas tomadas para conter o espalhamento da resistência (CDC): 1. Utilizar imunização para prevenir doenças; 2. Evitar a introdução desnecessária de dispositivos parenterais, como cateteres; 3. Ter como alvo o patógeno (isolar o agente infeccioso e fazer antibiograma); 4. Realizar o controle antimicrobiano (estar atualizado em relação ao tratamento adequado); 5. Utilizar dados locais; 6. Tratar a infecção, não a contaminação (utilizar técnicas antissépticas para coletar amostra); 7. Tratar com o agente antimicrobiano menos exótico; 8. Monitorar o uso de antimicrobiano (interromper o uso assim que o tratamento terminar ou caso o diagnóstico não seja confirmado; dor de garganta x Streptococcus X vírus) 9. Isolar o patógeno (manter indivíduos infectados em áreas específicas e descontaminar material); 10. Romper a cadeia de contágio (higiene pessoal).
Resistência a agentes antimicrobianos Mecanismos mediadores de resistência a drogas 1. Alterações no sítio-alvo da droga 2. Expressão de altos níveis da enzima cuja ação é bloqueada pela droga 3. Redução da permeabilidade celular em relação à droga 4. Mecanismo de efluxo da droga 5. Presença de segunda enzima que executa a reação metabólica inibida 6. Produção de enzimas modificadoras das drogas
Resistência a agentes antimicrobianos Mecanismos mediadores de resistência a drogas 1. Alterações no sítio-alvo da droga 2. Expressão de altos níveis da enzima cuja ação é bloqueada pela droga 3. Redução da permeabilidade celular em relação à droga 4. Mecanismo de efluxo da droga 5. Presença de segunda enzima que executa a reação metabólica inibida 6. Produção de enzimas modificadoras das drogas
Resistência a agentes antimicrobianos Mecanismos mediadores de resistência a drogas 1. Alterações no sítio-alvo da droga Geralmente ocasionado por mutações espontâneas no cromossomo bacteriano, resultando na síntese de proteína modificada. Não ocorre a ligação ao agente antimicrobiano. Ex.: β-lactâmicos modificação na estrutura das PBPs Vancomicina Em alguns enterococos foi observado que a parede celular era formada sem os resíduos de D-Ala-D-Ala, havendo modificação do sito alvo da vancomicina. Genes presentes em transpóson são responsáveis pela modificação. Figura pagina 548
Resistência a agentes antimicrobianos Mecanismos mediadores de resistência a drogas 2. Expressão de altos níveis da enzima cuja ação é bloqueada pela droga Geralmente ocasionado por mutações espontâneas no cromossomo bacteriano que afetam os elementos reguladores da expressão dos genes. Ex.: β-lactâmicos aumento no nível de PBPs Figura pág 549
Resistência a agentes antimicrobianos Mecanismos mediadores de resistência a drogas 3. Redução da permeabilidade celular em relação à droga Resistência relacionada a presença do operon marrab Sistema MAR Multiple Antibiotic Resistence); Observado em bactérias Gram-negativas; O produto do gene mara inibe a expressão da porina OMPF, o que reduz a permeabilidade da célula e leva a resistência a várias drogas. Ex.: resistência a tetraciclina.
Resistência a agentes antimicrobianos Mecanismos mediadores de resistência a drogas 4. Mecanismo de efluxo da droga Geralmente mediada por plasmídeo (Ex.: resistência a tetraciclina). Novas proteínas de membrana citoplasmática aparecem do envelope celular e bombeiam a droga para fora da célula. Assim, não há o acúmulo de droga dentro da célula. Transporte dependente de ATP ou força proton motiva.
Resistência a agentes antimicrobianos Mecanismos mediadores de resistência a drogas 5. Presença de segunda enzima que executa a reação metabólica inibida Geralmente mediada por plasmídeo; Ex.: Sulfas plasmídeo R que codifica outra diidropteroatosintetase. A eficiente de ligação da droga a nova enzima é 10.000 vezes menor. Mesmo ocorre para trimetoprim
Resistência a agentes antimicrobianos Mecanismos mediadores de resistência a drogas 6. Produção de enzimas modificadoras das drogas Geralmente mediada por plasmídeo; Genes envolvidos na resistência muitas vezes fazem parte de transpósons; As drogas são modificadas e tornam-se inativas; Ex.: Cloranfenicol: acetilação pela enzima CAL (cloranfenicol acetiltransferase), tornando a droga inativa.
Resistência a agentes antimicrobianos Mecanismos mediadores de resistência a drogas 6. Produção de enzimas modificadoras das drogas Ex.: β-lactâmicos: Produção de β-lactamase que quebram anel β-lactâmico; β-lactamases de Gram-positivas são secretadas no meio; β-lactamases de Gram-negativas são secretadas no espaço periplasmático; Figura página 554
Resistência a agentes antimicrobianos Como contornar a resistência? Associação de compostos ao tratamento de forma a inibir a resistência aos antibióticos: Sinergismo. Ex.: ácido clavulânico: produzido por Streptomyces clavuligerus forma complexo irreversível com β- lactamases. Sulbactam: ação semelhante; droga semissintética
Resistência a agentes antimicrobianos A interrupção do uso de determinado antibiótico pode eliminar os genes de resistência? Estudos mostram que esses genes e elementos genéticos envolvidos na HGT tem certa estabilidade; Outros fatores ambientais podem estar envolvidos na persistência da resistência; Ex.: Caso um plasmídeo de R contenha outros genes que codifiquem alguma vantagem seletiva, como fatores que aumente a eficiência de colonização do ambiente ou resistência a metais pesados. Além disso, os mecanismos de transferência de genes em bactérias são contínuos.
Aula Prática 02/09/2013
Prática 6 Classificação de bactérias: provas bioquímicas II
Provas bioquímicas São utilizadas para auxiliar na identificação e classificação dos micro-organismos. São baseados em métodos bioquímicos para evidenciar características metabólicas e atividades enzimáticas das bactérias. Resultados dados como positivos ou negativos são analisados em tabelas para identificação.
Tabela de Resultados Tubo escolhido: X Coloração de Gram Teste Bioquímico Fermentação da glicose (+ ou -; com gás G; sem gás - SG Fermentação manitol Fermentação lactose VM VP Metabolismo aeróbico X fermentativo Teste do citrato Resultado
Interpretação dos resultados Fermentação da glicose, manitol e lactose Meio com: -único carboidrato fermentável -indicador de ph; Vermelho de fenol ph ácido amarelo ph básico vermelho -Tubo de Durham O que observar no resultado: -Produção de ácido; -Produção de gás. A e B positivo C controle não inoculado D e E negativo
Interpretação dos resultados Fermentação da glicose ácida mista (VM) O Vermelho de Metila é um indicador de ph. ADICIONADO CRESCIMENTO APÓS Vira quando há intensa acidificação do meio (ph 4,4). Esta prova só pode ser feita após 48 horas de incubação. Adicionar 2 a 5 gotas do indicador de ph.
Interpretação dos resultados Fermentação Butileno glicólica Produção de acetoína a partir da glicose Após crescimento: -Adicionar 2-5 gotas de reagente Barrit A; -Adicionar 2-5 gotas de reagente Barrit B; -Agitar levemente; -Esperar 10-15 minutos para ler resultados Barritt B (KOH) arritt A + acetoína ------------------> H 2 O + diacetil + guanidina (cor vermelha) α-naftol O 2
Interpretação dos resultados Metabolismo respiratório x Metabolismo fermentativo O meio de HUGH-LEIFSON. Indicador de ph o azul de bromotimol ácido é amarelo neutro é verde ph básico, azul Facultativos cresceem nos 2 tubos Metabolismo oxidativo cresce apenas na superfície do tubo sem vaselina. Crescimento evidenciado pela produção de ácidos em ambos os metabolismos.
Interpretação dos resultados Prova do citrato Meio contendo indicador de ph Azul de bromotimol Utilização do citrato leva à produção de CO 2 que se complexa com sódio e água do meio gerando carbonato de sódio.
PROVAS BIOQUÍMICAS II ATIVIDADE ENZIMÁTICA Prática 7
Prática 7 No metabolismo celular microbiano, como em outras células animais, a degradação de metabólitos e os processos para obtenção de energia e de biossíntese são regulados por catalisadores biológicos que são as enzimas. Estas enzimas podem ser extracelulares (exoenzimas) ou intracelulares (endoenzimas).
Prática 7 1) Hidrólise do Amido Inóculo em meio de ágar amido Princípios: Após o crescimento, caso o micro-organismo possua as exoenzimas para degradação de amido surgirá um halo incolor em volta do crescimento de bactérias produtoras de amilase devido à ausência de amido naquela região. Execução: Com a alça de platina flambada coletar um pouco da cultura e inocular em 4 pontas da placa de ágar + amido. Incubar 24/48h a 37 o C.;
Prática 7 2) Redução do Nitrato Princípios: No metabolismo oxidativo o oxigênio (O 2 ) é o aceptor final de elétrons na cadeia respiratória dos aeróbios enquanto o nitrato (NO 3 ) é um dos possíveis aceptores finais de elétrons nos anaeróbios facultativos. No meio de cultura é adicionado nitrato em excesso. Se o microorganismo possuir a enzima, mesmo na presença de oxigênio, com o excesso de nitrato ele reduzirá este substrato a nitrito. Execução: Com o auxílio de uma alça coletar um pouco de cultura e inocular no meio de água peptonada nitratada (marca preta);
Prática 7 3) Formação de H 2 S e Indol e Observação de Mobilidade em Meio Sólido Princípios: a) Formação de H 2 S (2 modos) - Cisteína da peptona do meio - Tiosulfato de sódio do meio * Tira de papel embebida em acetato de chumo. Na presença de H2S forma sulfeto de chumbo (precipitado escuro)
Prática 7 3) Formação de H 2 S e Indol e Observação de Mobilidade em Meio Sólido Princípios: b) Produção de Indol Se o micro-organismo produzir a enzima triptofanase, ele será capaz de degradar o aminoácido triptofano produzindo indol. O indol é revelado pelo reativo de Kovak. ** Reativo de Kovac embebido em fita.
Prática 7 3) Formação de H 2 S e Indol e Observação de Mobilidade em Meio Sólido Princípios: b) Produção de Indol Se o micro-organismo produzir a enzima triptofanase, ele será capaz de degradar o aminoácido triptofano produzindo indol. O indol é revelado pelo reativo de Kovak. ** Reativo de Kovac embebido em fita.
Prática 7 3) Formação de H 2 S e Indol e Observação de Mobilidade em Meio Sólido Princípios: c) Observação de Mobilidade em Meio Sólido Observação da turvação do meio após inóculo e incubação Inocular o meio SIM com a agulha de inoculação, dando uma picada de 1cm abaixo da superfície
Prática 7 4) Prova da Uréia Princípios: Caso o micro-organismo possua a enzima urease, ele produzirá amônia/carbonato de amônia, produto básico que alcalinizará o meio que possui como indicador de ph o vermelho de fenol que em ph básico fica rosa/vermelho e em ph ácido e neutro fica amarelo.
5) Prova da Catalase Prática 7 Princípios: Caso o micro-organismo possua a enzima catalase haverá o desprendimento de bolhas dentro do tubo de cultura.
PROVAS BIOQUÍMICAS II ATIVIDADE ENZIMÁTICA OBJETIVOS GERAIS DA PRÁTICA Justificar a importância das provas bioquímicas na classificação bacteriana. Interpretar os resultados dos testes bioquímicos realizados.
PROVAS BIOQUÍMICAS II ATIVIDADE OBJETIVOS ESPECÍFICOS DA PRÁTICA 1) Hidrólise do Amido ENZIMÁTICA Verificar se o microrganismo possui a enzima amilase. 2) Redução do Nitrato Verificar a capacidade do microrganismo produzir a enzima nitrato redutase respiratória, responsável pela redução do nitrato a nitrito. 3) Formação de H 2 S e Indol e Observação de Mobilidade em Meio Sólido Verificar a capacidade do microrganismo produzir gás sulfídrico (ou sulfeto de hidrogênio); Verificar a capacidade do degradar o aminoácido triptofano; Verificar se o microrganismo é móvel ou não. 4) Prova da Uréia Verificar a capacidade do microrganismo produzir a enzima urease. 5) Prova da Catalase Verificar se o microrganismo possui a enzima catalase.
PROVAS BIOQUÍMICAS II ATIVIDADE EXECUÇÃO DA PRÁTICA ENZIMÁTICA Provas Bioquímicas II Atividade Enzimática Escolher o tubo com cultivo do microrganismo desconhecido repicado na aula anterior; Preparar e observar uma lâmina do microrganismo desconhecido corado por coloração de Gram; Hidrólise do amido Com a alça de platina flambada coletar um pouco da cultura e inocular em 4 pontas da placa de ágar + amido. Incubar 24/48h a 37 o C.; Redução do nitrato Com o auxílio de uma alça coletar um pouco de cultura e inocular no meio de água peptonada nitratada (marca preta);
PROVAS BIOQUÍMICAS II ATIVIDADE EXECUÇÃO DA PRÁTICA ENZIMÁTICA Provas Bioquímicas II Atividade Enzimática Formação de H 2 S e Indol e Observação de Mobilidade em Meio Sólido Inocular o meio SIM com a agulha de inoculação, dando uma picada de 1cm abaixo da superfície. Colocar uma tira embebida com o reativo de Kovac (para a prova do indol) Colocar uma tira embebida em acetato de chumbo (para a prova do H 2 S); Prova da Uréia Com o auxílio de uma alça de inoculação coletar uma porção da cultura e inocular no meio com uréia; Prova da Catalase É feita vertendo água oxigenada (H 2 O 2 ) no próprio tubo de ágar inclinado contendo a bactéria crescida; Incubar a estante com os tubos na estufa para leitura e interpretação na aula seguinte.