Professora Vera Lúcia dos Santos
Crescimento microbiano
Nutrição microbiana
Nutrição bacteriana Como estudar microrganismos no laboratório? Cultivo in vitro conhecer as exigências nutricionais e ambientais dos microrganismos Composição química de uma célula bacteriana (E. coli) Componentes água proteínas lipídeos LPS peptidioglicano glicogênio DNA RNA metabólitos íons inorgânicos % Massa úmida 70 15 2 1 0,7 1 1 5 3 0,3 Tipos diferentes 1 2000 4 1 1 1 1 500 350 20
Lei do Mínimo de Liebig A biomassa total de um organismo é determinada pelo nutriente presente no meio em menor concentração em relação aos seus requerimentos. Em um dado ecossistema sempre haverá algum fator nutricional limitante. Composição Química Média da Célula (%) Oxigênio... 65 Carbono... 18 Hidrogênio... 10 Nitrogênio... 3 Subtotal... 96 Cálcio (Ca)... 1,8 Fósforo (P)... 1,2 Potássio (K).......0,35 Enxofre (S)...0,25 Sódio (Na)... 0,15 Cloro (Cl)... 0,15 Magnésio (Mg)... 0,05 Flúor (F)... 0,007 Ferro (Fe)... 0,005 Subtotal... 3,962 Outros(Zn,Br,Mn,Cu,I,Co)... 0,038
Lei da Tolerância de Shelford A ocorrência e abundância de um microrganismo em um dado ambiente é determinada não somente pelos nutrientes disponíveis mas pelos fatores físicos e químicos. O microrganismo apresenta um conjunto complexo de condições, dentro de uma faixa de tolerância. Se qualquer condição exceder os limites mínimo ou Máximo= organismo falha e morre.
Principais tipos nutricionais dos microrganismos
Carbono Oxigênio Macronutrientes Hidrogênio Nitrogênio Enxofre Fósforo Potássio (K + ) Cálcio Magnésio (MG 2+ ) Ferro (Fe 2+ /Fe 3+ ) Cultivo de bactérias no laboratório Funções Constituintes de carboidratos, lipídios, proteínas e ácidos nucléicos Atividade enzimática g mg Resistência ao calor do endosporo Cofator de enzimas, complexos com ATP, estabiliza ribossomos e membranas Constituição de citocromos, cofator de enzimas, cofator de proteínas transportadores de elétrons Micronutrientes µg Co, Cu, Ni, Mo, Mn, Se, Zn, Cr cofatores de enzimas geralmente não é preciso adicionar: presentes na água; Água desmineralizada: adicionar solução elementos traço.
Forma de apresentação dos macronutrientes na natureza e em meios de cultura
Fatores de crescimento Compostos orgânicos específicos, necessários em quantidades muito pequenas devido à incapacidade das células de os sintetizarem. Fornecidos como componentes dos meios de cultura (peptonas, extrato de levedura) utilizados para o crescimento in vitro dos microrganismos. 1) Aminoácidos - fundamentais para a síntese protéica 2) Purinas e pirimidinas - fundamentais na composição dos ácidos nucléicos 3) Vitaminas - fazem parte de co-fatores enzimáticos
Cultivo de microrganismos in vitro Meio de Cultura: mistura de compostos nutrientes necessários ao crescimento microbiano. Algumas bactérias crescem em qualquer meio de cultura, outras necessitam de meios especiais e também existem bactérias que não são capazes de crescer em nenhum meio de cultura já desenvolvido. Uso: Permitem o isolamento, crescimento e manutenção de microrganismos no laboratório. Facilitam a identificação dos microrganismos a partir de diferentes ambientes Permitem verificar susceptibilidades a agentes quimioterápicos e outros compostos químicos Uso na indústria: inoculantes, fermentação
Classificação dos meios quanto ao estado físico Podem ser líquidos (sem agar), semisólidos ou sólidos. Líquido: obtenção de biomassa e de metabólitos em reatores Sólido: permite a obtenção de cultura pura - caracterizar um agente infeccioso
Caracterização
Meios sintéticos ou definidos composição química exata é conhecida Classificação quanto à composição Meios Complexos composição química exata não é conhecida Úteis para cultura de microrganismos com requerimentos nutricionais complexos ou desconhecidos. Hidrolisados de proteínas preparadas por digestão proteolítica parcial de carne, caseína, soja ou gelatina), extrato de carne ou extrato de levedura.
Classificação quanto à composição Meios de cultura enriquecidos Meio basal enriquecido com ovo, soro ou sangue, substâncias que permitem o crescimento de bactérias muito exigentes em termos nutricionais e que se encontram em número reduzido. Meios caracterizados por ausência de inibidores. Podem ou não ser diferenciais. Ex: Agar sangue, Brain and Heart Infusion (BHI)
Quanto a finalidade Meios diferenciais permitem a distinção entre diferentes grupos de m.o. Produção de enzimas DNAse - adição substrato e verificação halo hidrólise Agar sangue: Meio complexo, enriquecido, não seletivo Meio diferencial porque permite verificar a existência ou não de hemólise colônias envolvidas por zonas claras devido a lise de células vermelhas. Streptococcus pyogenes.
Meios de enriquecimento São meios líquidos, que favorecem o crescimento de determinadas espécies aumentando a sua quantidade relativamente a outras, facilitando o isolamento de um microrganismo de interesse. Ex: caldo de selenito de sódio- permite enriquecimento de Salmonella e Shigella, agentes causadores de intoxicações alimentares.
Meios de cultura seletivos Permitem apenas o crescimento de certas espécies de bactéria. Ex: Meio de McConkey (peptona, lactose, NaCl, sais biliares e vermelho de metila como indicador de ph). Meio diferencial para fermentação de lactose - Bactérias que fermentam áçúcares produzem ácidos que reagem com vermelho de metila formando colônias rosas, colônias não fermentadoras permanecem incolores. Seletivo para bacilos gram (bactérias de origem intestinal, enterobactérias) - Contém sais biliares e corantes que inibem o crecimento de bactérias gram +.
Meios de transporte Meios que servem para o transporte e conservação de um material biológico a partir do qual se propõe isolar um ou mais microrganismos. O papel principal deste meio é manter os microrganismos vivos, mas impede o crescimento e multiplicação até o subcultivo em meio adequado. Meio de Stuart Glicerol fosfato de sódio...10 g Tioglicolato de sódio...1 g Cloreto de cálcio...0,1 g Azul de metileno...0,002 g Ágar...8 g Água 1 L
Meios de conservação São meios que permitem a manutenção das bactérias num estado de vida latente durante meses, anos ou décadas. Ex: Meio GYMP adicionado de glicerolcrioprotetor
Efeitos ambientais no crescimento microbiano
Fatores físicos que afetam o crescimento de bactérias ph Procariotos que vivem em ph extremos parecem manter um ph interno próximo do neutro bombeando prótons para fora da célula Neutrófilos: crescem na faixa de ph entre 5 a 8 Acidófilos: crescem melhor em valores <5 Alcalófilos: crescem melhor em valores >5
ph
ph Os microrganismos podem alterar o ph do micro habitat Liberação de produtos de degradação ácidos ou básicos. Produção de ácidos orgânicos (lático)- Bactérias do ácido lático Thiobacillus sp. (quimiolitotrófico) -oxida enxofre reduzido a ácido sulfúrico Produção de amônia através da desaminação de aminoácidos Podem impactar o macroambiente
Temperatura Temperatura ótima de crescimento psicrófilas (12 a 17 C) psicrotróficas (20 a 30 C) mesófilas (28 a 37 C) termófilas (50 a 90 C) termófilas extremas (>80 C)
Efeito da temperatura Afeta a taxa de crescimento por afetar a taxa das reações celulares Fator Q10 Mudanças na taxa de crescimento são comparáveis dentro de uma certa faixa às respostas das reações químicas a temperatura. Efeito de altas temperaturas: desnaturação de enzimas e proteínas em geral alteração do dobramento das proteínas reduzindo a sua atividade desintegração das membranas por fusão lipídica perda de água aumentada- evaporação
Adaptações que permitem crescimento a altas temperaturas Proteínas e enzimas: o acúmulo de solutos (2,3 difosfoglicerato cíclico) que estabilizam proteínas; o presença de proteínas específicas que estabilizam outras proteínas por dobramento a temperaturas próximas do limite de crescimento (chaperonina) Aumento da percentagem de G / C (não universal). o Presença de proteínas de união ao DNA que impeçam a sua fusão (aumento da estabilidade térmica) o DNA girase reversa: Superenovelamento (+) no DNA Formação de estruturas de resistência: esporos
Adaptações que permitem crescimento a altas temperaturas Modificação de lipídeos da membrana aumento da percentagem dos ácidos graxos saturados/ insaturados, ramificados e de alto peso molecular. Fosfolipídios com alto ponto de fusão: CL, PE Compensar o aumento da fluidez da membrana
Stress- Baixa temperatura Desestabilização da bicamada-membrana Aumento da concentração de soluto Desidratação Citoplasma se torna altamente viscoso: alteração dos processos de difusão, incluindo osmose Desnaturação de proteínas.
Baixas temperaturas-nível celular Cristais de gelo grandes se formam no exterior das células, remove água e concentra o soluto. Aumento dos cristais extracelulares: promovem a saída da água intracelular por osmose. Causa lesões nas membranas e provoca intensa desidratação das células
Microrganismos psicrófilos Modificação da composição das membrana celulares o o Aumento de ácidos graxos insaturados, encurtamento das cadeias e diminuição de ácidos graxos cíclicos Estas alterações mantém as membranas em um estado semi-fluido a baixas temperaturas. Exemplos: Pseudomonas, Listeria e Flavobactérias
Atmosfera gasosa O 2 e CO 2, são os gases principais que afetam o crescimento De acordo com resposta ao O 2, os microrganismos são classificados em: AERÓBIOS Estritos (obrigatórios): necessitam de O 2 (respiração aeróbica) Microaerófilo: necessitam de O 2 em níveis menores que atmosfera (respiração aeróbica) ANAERÓBIOS Aerotolerantes: não necessitam de O 2 mas podem tolerar sua presença (fermentação) Facultativos: não necessitam de O 2 mas crescem melhor na sua presença (fermentação, respiração aeróbica) Estritos (obrigatórios): não toleram O 2 (letal) (fermentação, respiração anaeróbica)
Por que o O 2 é tóxico para os anaeróbios? O 2 é poderoso agente oxidante e excelente aceptor de elétrons na respiração Processos celulares geram formas reativas de O 2 - são oxidantes poderosos que destroem constituintes celulares Formas tóxicas do oxigênio células devem ser capazes de se proteger contra estas espécies reativas para manter sua integridade
Enzimas que inativam o O 2 tóxico
Caracterização de microorganismos quanto ao metabolismo de O 2 (a) Aeróbio obrigatório (catalase e superóxido dismutase) (b) Anaeróbio (catalase e superóxido dismutase ausentes na maioria) (c) Anaeróbio facultativo (catalase e superóxido dismutase) (d) Microaerófilo (necessitam de baixos teores de O2) (pequenas quantidades de catalase e superóxido dismutase) (e) Aerotolerante (suportam a presença de O2, apesar de não o utilizarem) (superóxido dismutase)
Cultivo de anaeróbios Métodos de produção de ambiente anaeróbio uso de agentes redutores nos meios de cultura Ex: tioglicolato de sódio, que reage com oxigênio, formando água remoção mecânica do oxigênio, sendo substituído por nitrogênio e CO 2 ;
Cultivo de anaeróbios Métodos de produção de ambiente anaeróbio Uso de sistemas geradores de anaerobiose (GasPak) -Jarra de anaerobiose: adicionadas de bicarbonato de sódio e boroidreto de sódio que reagem com a água liberando hidrogênio e CO 2 com um catalisador de paládio usada para anaeróbios aerotolerantes
Câmara de anaerobiose
Transporte de anaeróbios Embalagem formadora de anaerobiose Inserção de amostra no interior do meio de cultura pré-reduzido
Pressão osmótica Pressão Osmótica - força com a qual a água se move através da membrana citoplasmática a partir de uma solução de baixa concentração de soluto para uma contendo alta concentração de soluto (osmose).
As células podem estar em um meio: Isotônico - Não há movimento de água para dentro ou para fora da célula Hipertônico - concentração de solutos fora da célula é maior que no interior. A água flui para fora da célula - plasmólise Hipotônico - a concentração de soluto no interior da célula é maior que fora dela. A água flui para dentro da célula: pode inchar e se romper
Como os microrganismos conseguem crescer em um meio com baixa atividade de água? Bombeamento de íons inorgânicos (KCl) para o interior da célula Síntese de solutos orgânicos acumulados no interior da célula para o ajuste da atividade de água citoplasmática (BS) Prolina (G(+) Staphylococcus aureus); Glicina betaina (bacterias halófilas) Ectoina (Ectothiorhodospira) Glutamato Sacarose, Trehalose, Glucose, Frutose (Cianobacterias de aguas continentais, fotossintéticas anoxigênicas)
Solutos compatíveis Glicerol, Manitol, Sorbitol, Ribitol (Cianobacterias e algas marinhas, Dunaliella, leveduras osmofílicas, fungos xerófilos) (Algas marinas) KCl: Arqueobacterias halófilas extremas
Efeito da concentração do íon sódio no crescimento de microrganismos Os efeitos osmóticos são de maior importância em ambientes salinos. Em relação a necessidade de sal (NaCl) m.o. podem ser Não Halófilos: não necessitam de sal e não toleram a presença no meio. Halotolerantes: não necessitam de sal mas toleram a presença no meio Halófilos: necessitam de sal em uma concentração moderada Halófilos extremos: necessitam de sal em altas concentrações. 1-15% de NaCl 15ª 30% de NaCl
Adaptações aos períodos de dessecação Formação de esporos: Sobrevivência em estado dormente e crescimento ativo em condições favoráveis Formação polissacarídeos extracelulares (cápsulas, camada mucosa) com trehalose Síntese de açúcares (sacarose, trehalose) que se liga a proteínas impedindo a desnaturação Trehalose forma ligações de H com lipídios (substituindo moléculas de água) mantendo a membrama celular funcional Mecanismos de reparo de DNA (fragmentação em condições de dessecação)
Crescimento microbiano Para microrganismos que se dividem por fissão ou por gemulação, o termo crescimento refere-se a um aumento do número e não ao tamanho das células. Os microrganismos em crescimento estão, na verdade, aumentando o seu número e se acumulando em colônias COLÔNIAS => grupos de células => visualização sem utilização de microscópio. Taxa de crescimento: é a variação no número ou massa de microrganismos por unidade de tempo.
Crescimento celular e fissão binária As bactérias dividem-se em duas por fissão binária e aumentam o seu número de forma geométrica em que a sua população duplica a cada tempo de geração (Crescimento exponencial) Tempo de geração: é o intervalo de tempo necessário para que uma célula se duplique.
Tempo de geração varia de acordo com sua constituição genética e condições do meio Escherichia coli se divide a cada 20 minutos em caldo em laboratório e a cada 2-3 dias no colon.
Curva de crescimento bacteriano Quando uma bactéria é semeada em um meio apropriado, nas condições apropriadas, o seu crescimento segue uma curva definida e característica: A Fase LAG: pouca divisão celular, os microrganismos estão se adaptando ao meio em que estão crescendo. As células aumentam de volume, mas não se dividem. B Fase exponencial (log): crescimento exponencial, divisões celulares sucessivas, grande atividade metabólica. C Fase estacionária: decréscimo na taxa de divisão celular, onde a velocidade de crescimento = velocidade de morte D Fase de declínio ou morte: condições impróprias para o crescimento, meio deficiente em nutrientes e rico em toxinas, onde as células mortas excedem o número de células vivas
MÉTODOS PARA QUANTIFICAÇÃO DO CRESCIMENTO MICROBIANO
Métodos para medida de crescimento microbiano Contagem do número de microrganismos - Direta: ao microscópio ótico - Indireta: contagem em placa, membrana filtrante e incubação.
Contagem do número de células Contagem direta das células, usando uma câmara de contagem (câmara de Neubauer ). - Vantagens: é o processo mais direto, econômico e rápido de contagem de microrganismos. - Dá também informação sobre o tamanho e morfologia dos microrganismos. CÂMARA DE NEUBAUER - Desvantagem: não permite distinguir as células vivas das células mortas. Ao microscópio aumento de 400X
Contagem em placas O número original de microrganismos na amostra (UFC/mL) pode ser calculado a partir do número de colônias formado e da diluição feita. SUCESSIVAS MËTODO DE DILUIÇÕES
CONTAGEM DE BACTÉRIAS PELO MÉTODO DE FILTRAÇÃO Sistema de filtragem Células bacterianas na superfície da membrana (poros) A membrana filtrante foi colocada sobre o meio de cultura e a placa foi incubada.
Determinação da massa celular Direto: pesagem Indireto: determinação do contéudo de N, P e C e turbidimetria Determinação do peso seco - Método que inclui centrifugação, lavagem, secagem num forno e pesagem. - Desvantagens: baixa sensibilidade e necessidade de grandes quantidades de massa orgânica.
Medição da massa celular Turbidimetria - Baseia-se no fato de as células microbianas dispersarem a luz. A quantidade de luz detectada é proporcional à concentração de células presentes. - Quando a concentração bacteriana atinge 10 milhões de células por ml o meio aparece ligeiramente turvo. O aumento da concentração celular conduz ao aumento da turvação e menos luz é transmitida através do meio. A luz detectada pode ser medida num espectofotómetro. - Vantagens: é um método rápido e sensível. - Desvantagem: não permite descriminar entre as células vivas e mortas
Determinação da atividade celular Atividade enzimática Concentração de um metabólito Medida da respiração
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