Estágios no processo produtivo Aula 2 - Prof a Dr a Ilana L. B. C. Camargo Ciências Físicas e Biomoleculares IFSC - USP Estágios no processo produtivo 1- Os três estágios do bioprocesso 2- Biorreatores 3- Upstream 3.1 Escolha do Biocatalisador 3.2 Obtenção do Biocatalisador 3.3 Conservação do Biocatalisador 1
1. Os três Estágios do bioprocesso Biotecnologia do bioprocesso tem três estágios: Biorreatores e biorreação Processo Downstream 2
Upstream Biorreação /Biorreator Downstream Estágios do processo produtivo Bioprocesso aplicação industrial de reações ou vias biológicas mediadas por células vivas inteiras de animais, plantas, microrganismos ou enzimas sobre condições controladas para a biotransformação de matérias primas em produtos Bioprocesso também pode ocorrer sem resultar em um produto direto biorremediação, desintoxicação de resíduos ou de efluentes com ou sem subproduto ou derivados Produto alimento, medicamento ou composto industrial Escala laboratorial Escala industrial 3
2. Biorreatores Biorreator ou fermentador Biorreatores, reatores bioquímicos, reatores biológicos são os reatores químicos nos quais ocorrem uma série de reações químicas catalisadas por biocatalisadores 4
Biorreator ou fermentador Biorreator de bancada Biorreator de 90L http://en.wikipedia.org/wiki/bioreactor http://www.faperj.br/boletim_interna.phtml?obj_id=3930 3- Processo Upstream 5
Escolha do biocatalisador Preparo da matéria prima ou substrato a ser processado Preparação de meio e sua esterilização Alimentação do biorreator Regulação de temperatura, ph e pressão Inoculação da cultura no meio assepticamente Biorreação Características gerais desejáveis de microrganismos para aplicação industrial: 1. Apresentar elevada eficiência na conversão do substrato em produto; 2. Permitir o acúmulo do produto no meio, de forma a se ter elevada concentração do produto no caldo fermentado; 3. Não produzir substâncias incompatíveis com o produto; 4. Apresentar constância quanto ao comportamento fisiológico; 5. Não ser patogênico 6. Não exigir condições de processo muito complexas; 7. Não exigir meios de cultura dispendiosos; 8. Permitir a rápida liberação do produto para o meio. 6
1 - Apresentar elevada eficiência na conversão do substrato em produto; Matérias-primas incidem pesadamente no custo do produto final (38 a 73% do custo total de produção) C 6 H 12 O 6 2 C 2 H 5 OH + 2CO 2 1 g glicose 0,511g de etanol S. cerevisiae rendimento de 90% da reação de fermentação anaeróbia Destilação - perda Quando o produto é produzido em menor quantidade em relação ao açúcar consumido (enzimas ou antibiótico) o custo com a recuperação do produtos são mais onerosas 2 - Permitir o acúmulo do produto no meio, de forma a se ter elevada concentração do produto no caldo fermentado; Sem sofrer inibição mais acentuada em virtude deste acúmulo 3 -Não produzir substâncias incompatíveis com o produto; Sem produzir proteases extracelulares Linhagens que crescem relativamente menos, ou que acumulem menos compostos intermediários incrementam a síntese do produto 7
3 -Não produzir substâncias incompatíveis com o produto; Exemplo: Aspergillus produz glicoamilase glicoamilase Amido Glicose Várias aplicações (xaropes de glicose na indústria de alimentos) Alguns microrganismos também sintetizam transglicosidase que polimeriza a glicose novamente, porém de uma forma que não são mais hidrolisadas pela glicoamilase 4. Apresentar constância quanto ao comportamento fisiológico Característica importante: Estabilidade fisiológica da linhagem Não basta uma linhagem hiperprodutora de uma substância, mas que se conheça as técnicas mais adequadas para sua conservação e, mais ainda, que ela se mantenha como excelente produtora da substância de interesse ao longo de todas as etapas envolvidas desde sua proliferação no laboratório, germinadores e biorreator principal 8
Para a célula há sempre a tendência de otimizar o crescimento, em detrimento da síntese do produto, motivo pelo qual não basta verificar se a célula cresce, mas se ela continua a acumular o produto de maneira eficaz!! Durante a proliferação da célula há sempre chances de mutações naturais!! Massa pequena de células no inóculo Biorreatores de dezenas de milhares de litros 10g de matéria seca de células/ L 5. Não ser patogênico!! Sem riscos ambientais, particularmente nas etapas seguintes ao término da fermentação (downstream) Se manuseasse microrganismos patogênicos em reatores de dezenas de milhares de litros, os cuidados teriam de ser bastante aumentados, o que incidiria em custos adicionais São utilizados patógenos para produção de vacinas em reatores de pequeno porte (poucos milhares de litros), porém confinados em câmaras assépticas, tomando-se precauções necessárias para a não contaminação do meio ambiente 9
Técnicos do Instituto Butantan trabalham na área de fermentação da linha de produção de vacinas http://planetasustentavel.abril.com.br/album/albumfotos_301191.shtml?foto=3 Fort Dodge (Pfizer) http://www.leptospirosenobrasil.com.br/index.php 10
6. Não exigir condições de processo muito complexas ph e Temperatura: em reatores de grande porte não há controle preciso, por isso o ideal é que o microrganismo tenha uma faixa de valores ótimos dessas grandezas e não valores pontuais, particularmente no que se refere ao acúmulo do produto Reatores de grandes portes (dezenas de milhares de L) ph e oxigênio Heterogeneidade ao longo da altura do reator Importante: células devem manter seu desempenho dentro de uma faixa de valores ótimos!! 11
Biotecnologia do bioprocesso 6. Não exigir condições de processo muito complexas Tensão de oxigênio: os microrganismos que conseguem manter um bom desempenho quando cultivados em baixas concentrações de oxigênio são muito interessantes Há maior gasto de energia para a agitação e aeração do meio! Biotecnologia do bioprocesso Tensão de oxigênio: Microrganismos que crescem de forma aglomerada (forma miceliar, por exemplo) são evitados, pois a concentração de oxigênio no meio de cultivo terá de ser mais elevada, a fim de que as células mais internas destes aglomerados tenham acesso a este oxigênio, quando comparadas às células que crescem isoladamente 12
Biotecnologia do bioprocesso 6. Não exigir condições de processo muito complexas Não é conveniente trabalhar com linhagens que excretam uma quantidade exagerada de proteínas para o meio Geração de espuma. Isso torna complexo os processos aeróbios devido à necessidade de aerar e agitar o conteúdo do biorreator Biotecnologia do bioprocesso 7. Não exigir meio de cultura dispendioso 1. Ser o mais barato possível; 2. Atender às necessidades nutricionais do microrganismo; 3. Auxiliar no controle do processo, como é o caso de ser ligeiramente tamponado, o que evita variações drásticas do ph, ou evitar uma excessiva formação de espuma; 4. Não provocar problemas na recuperação do produto; 5. Os componentes devem permitir algum tempo de armazenagem, a fim de estarem disponíveis o tempo todo; 6. Ter composição razoavelmente fixa; 7. Não causar dificuldades no tratamento final do efluente. 13
Biotecnologia do bioprocesso 7. Não exigir meio de cultura dispendioso Meios sintéticos ou definidos podem ser onerosos, mas tem composição conhecida e podem ser reproduzidos a qualquer instante. Para células que apresentam bom desempenho em meios desse tipo, espera-se a ocorrência de um sistema produtivo muito estável, além de não apresentarem problemas quanto à recuperação e purificação do produto final. Meios definidos ou sintéticos podem ser preferidos se permitirem uma maior economia nas etapas de recuperação do produto Biotecnologia do bioprocesso 7. Não exigir meio de cultura dispendioso Algumas linhagens precisam de fatores de crescimento como aminoácidos ou vitaminas (biotina, timina, riboflavina etc) Adiciona-se as substâncias puras para manter o meio em sua forma mais definida No entanto... Isso pode se tornar inviável financeiramente quando as instalações são de grande porte. Alternativa: adicionar materiais complexos como extrato de levedura (autolisado de levedura), extrato de carne, extrato de malte, peptona (hidrolisado de proteínas) etc Problema: substâncias caras, composição variável (ao longo do tempo de armazenagem e na dependência do fabricante e do lote empregado) oscilação no processo fermentativo!!! 14
Biotecnologia do bioprocesso 7. Não exigir meio de cultura dispendioso Meios mais complexos e menos caros empregados na maioria dos processos fermentativos em grande escala: Matérias-primas naturais: caldo de cana-de-açúcar, melaços, farinhas diversas (farinha de trigo, milho, soja, cevada), água de maceração de milho (Corn Steep Liquor) etc Composição química desconhecida Pode-se conhecer os teores de açucares disponíveis, nitrogênio, fósforo, mas não se conhecem os teores dos sais minerais Sempre são completados com alguns sais (contento nitrogênio e fósforo) Variação conforme: solo, variedade do vegetal, safra, clima, processamento durante colheita e estocagem etc oscilações no processo fermentativo!! Biotecnologia do bioprocesso 7. Não exigir meio de cultura dispendioso Empresas que produzem antibióticos ou enzimas e que utilizam essas matérias primas naturais, principalmente a água de maceração de milho, devem manter uma planta piloto para o ajuste da composição do meio a cada novo lote de matéria-prima recebida para evitar surpresas nos biorreatores de grande porte Por serem as mais baratas são as mais utilizadas Porém podem causar problemas adicionais na recuperação e purificação do produto final, bem como problemas nos tratamentos das águas residuárias 15
Biotecnologia do bioprocesso 8. Permitir a rápida liberação do produto para o meio Se o produto é liberado no meio, ele poderá ser recuperado nas etapas seguintes de uma forma mais simples, sem a necessidade de lise celular e outras reações que elevam o custo Se algum produto permanecer dentro das células ele poderá ser perdido após a separação das células do meio após a fermentação Pode haver uma eventual inibição do próprio microrganismo pela retenção de um dado produto do metabolismo Retenção de certos produtos nas células depende entre outros fatores de: linhagem empregada, da composição do meio de cultura e das condições impostas (ph, temperatura, etc) 3.2. Obtenção de Biocatalisadores 16
3.2. Obtenção de Biocatalisadores Biocatalisadores que possam ter interesse industrial podem ser obtidos basicamente das seguintes formas: Isolamento a partir de recursos naturais Compra em coleções de culturas (ATCC, NCTC...) Manipulações genéticas: 1. Obtenção de mutantes induzidos por métodos convencionais 2. Fusão de protoplastos 3. Obtenção de microrganismos recombinantes por técnicas de engenharia genética Biotecnologia do bioprocesso Isolamento de microrganismos a partir de fontes naturais Solo Água Plantas Muito trabalho experimental Custo relativamente elevado Atividade de grande importância para obtenção de novas linhagens de interesse industrial como linhagens melhor produtoras de um dado produto. Além disso, pode conduzir à descoberta de novos produtos, o que confere a esta prática uma relevância inequestionável 17
Isolamento de microrganismos a partir de fontes naturais Compra em coleções de culturas Disponíveis em vários países Compra bastante viável Facilidade através dos recursos da Internet Agricultural Research Service Culture Collection - (EUA) American Type Culture Collection (ATCC) - (EUA) http://www.atcc.org/ Coleção de Culturas Tropical (Campinas-SP) http://www.cct.org.br National Collection of Type Cultures (NCTC) - (Reino Unido) http://www.hpacultures.org.uk/aboutus/nctc.jsp German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Alemanha) Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde - INCQS Lab. de Microrganismos de Referência - Fundação Oswaldo Cruz - FIOCRUZ Microrganismos produtores de antibióticos, em geral, não estão disponíveis em uma coleção de culturas Oriundos de programas de melhoramento genético 18
Biotecnologia do bioprocesso Manipulações genéticas 1. Obtenção de mutantes induzidos por métodos convencionais 2. Fusão de protoplastos 3. Obtenção de microrganismos recombinantes por técnicas de engenharia genética Obtenção de mutantes induzidos por métodos convencionais Proliferação celular mutação natural Mutação deleção ou adição de uma ou mais partes químicas da molécula do DNA Isolados - Mutantes naturais muito tempo Potencialidade de produção - Métodos que forçam a mutação: radiações ultra-violeta, substâncias químicas (nitrosoguanidina) Destrói-se a maioria das células e recuperam-se as mutadas Verifica-se se a mutação ocorreu na direção desejada 19
Mutação pode levar à perda da função de características indesejadas ou aumento da produção por perda das funções de controle Raramente leva ao aparecimento de novas funções ou propriedades Utilizar em microrganismo com a característica desejada para melhoramento Penicillium chrysogenum NRRL 1951 Modificada por mutações Produção de penicilina aumentou de 120 UI para 2658 UI (~20x) Fusão de protoplastos Protoplastos Frágeis sem parede celular Sem capacidade reprodutiva Sem parede celular, a probabilidade de fusão celular entre diferentes espécies aumenta 20
Protoplasto Protoplasto de fusão da célula da folha com a da pétala Digestão da parede celular Protoplastos de células das folhas de petúnias Meio isotônico http://en.wikipedia.org/wiki/file:protoplast_fusion.jpg Fusão de protoplastos Muito utilizados com leveduras, fungos filamentosos e plantas 1. Protoplastos são preparados cultivando as células em meios isotônicos enquanto tratam-nas com enzimas; 2. Os protoplastos são regenerados usando estabilizadores osmóticos como a sacarose; 3. Se a fusão ocorre para formar híbridos, os recombinantes desejados são identificados através de meios seletivos; 4. Após a regeneração da parede celular, o microrganismo pode ser utilizado para futuros estudos. 21
Fusão de protoplastos - Fusão pode ser realçada usando polietileno glicol e tratamento das preparações com irradiação ultravioleta - Fusão de células humanas ou de animais -Usado para o melhoramento da produção de antibióticos por combinar mutações de diferentes linhagens ou até mesmo espécies -Facilita a transferência de DNA recombinante -Método de associar grupos inteiros de genes entre diferentes linhagens de macro- e microrganismos Fusão de protoplastos Fusão de células de mamíferos que levam à produção de anticorpos monoclonais. Anticorpos são a principal defesa dos mamíferos. Uma célula de linfócito B produz um único tipo de anticorpo A produção de linfócitos B em meios de cultura não teve sucesso pois eles ou morriam ou paravam de produzir anticorpos 1975 Georges Köhler e Cesar Milstein demonstraram a produção de anticorpos monoclonais de um hibridoma (produto de fusão) de Linfócitos B (células produtoras de anticorpos) e células tumorais de mieloma 1984 Prêmio Nobel 1990 s o valor comercial de terapias por anticorpos sozinha valia US$ 6 bilhões!!! 22
Fusão de protoplastos Mudança: Células secretoras de anticorpos com tempo de vida limitado Células com capacidade contínua de crescimento (imortais) que mantém o potencial de secretar anticorpos Fusão de protoplastos Hibridomas podem ser congelados e re-utilizados mais tarde Aplicações do anticorpo monoclonal: -Diagnóstico in vitro em saúde humana, plantas e agricultura animal -Futuro: terapia com anticorpos para carregar uma droga citotóxica para o sítio de células cancerígenas -Biotecnologia industrial: usados como ligantes de alta afinidade para ligar e purificar produtos caros 23
Aplicações do anticorpo monoclonal Diagnóstico imunológico Obtenção de microrganismos recombinantes por técnicas de engenharia genética 24
Obtenção de microrganismos recombinantes por técnicas de engenharia genética Linhagens instáveis limitam o emprego de sistemas de fermentação mais eficientes, como processos contínuos, pois poderá acontecer, ao longo do tempo, a seleção de células que privilegiem o crescimento em detrimento do acúmulo do produto Linhagens naturais Linhagens mutantes Células recombinantes por introdução de plasmídeos podem ser instáveis 25
3.3 - Conservação do Biocatalisador Uma vez encontrada a linhagem a ser utilizada no bioprocesso, ela deve ser conservada Técnicas de conservação: 1) Transferência ou sub-cultura periódica em tubos ou placas de Petri com meio de cultura sólido (viabilidade: semanas) 2) Congelamento em freezers -20 C ou -70 C (anos) 3) Ultracongelamento: -196 C, N líquido (anos) 4) Liofilização: desidratação por sublimação da água, sob vácuo (anos ou décadas) 26
Uma vez encontrada a linhagem a ser utilizada no bioprocesso, elas devem ser conservadas... 100... 100 Walsh G., Pharmaceutical Biotechnology, Willey ed., 2007 27
Criotubos Congelamento Bactérias Lento Desequilíbrio osmótico Células de mamíferos Rápido Fromação de cristais intracelulares lise 28
Congelamento Congelamento rápido minimiza os efeitos de concentração do soluto pois o gelo forma uniformemente Congelamento lento, por outro lado, resulta em grandes perdas de água da célula e menos gelo intraceclular, mas aumenta os efeitos da solução Manual de Criopreservação Nunc 29
Congelamento Agente de criopreservação agente químico que protege as células durante o congelamento. Pode minimizar os efeitos prejudiciais do aumento da concentração do soluto e formação de cristal Mais comuns: Dimetilsulfóxido (DMSO) e glicerol (menos tóxico que DMSO). Escolha depende da célula!! Agentes de criopreservação podem penetrar na célula e causar um congelamento lento intracelular e diminuir os efeitos de solução. DMSO - Diminui a temperatura de congelamento e permite melhor desitradação da célula antes do congelamento intracelular. DMSO penetra melhor nas células e geralmente mais usado para células maiores, mais complexas como os protistas. 4 - Produção de etanol 30
Upstream Biorreação /Biorreator Downstream Exemplo prático: Produção de etanol Upstream Obtenção da matéria prima; Tratamento/preparo Escolha do microrganismo Preparo do pré-inóculo e inóculo Downstream Resíduos dos grãos 31
Biotecnologia do bioprocesso Pré-inóculo Biorreação Biorreatores Inóculo Smith J E, Biotechnology, ed. Cambridge, 2004 32
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Biotecnologia do bioprocesso Próximas aulas!! - Obtenção de microrganismos recombinantes por técnicas de engenharia genética - Biorreatores - Biorreação -Processo Downstream Referências Manual de criopreservação Nunc ver site da disciplina Capítulo 3 - Genetics and biotecnology (John Smith Biotechnology) ver site da disciplina Prescott, Harley and Klein. 2002 Microbiology, 5th edition, The McGraw- Hill (Chapter 42- Biochemistry - Industrial Microbiology And Biotechnology) ver site da disciplina Schmidell W, Lima UA, Aquarone E, Borzani W. Biotecnologia Industrial: Engenharia Bioquímica. Volume 2. Ed Edgard Blücher LTDA, São Paulo, 2001. Cap. 2. 34