Resistência bacteriana as drogas antimicrobianas
Variação permanente resultante de Mutação tempo 1. População de uma bactéria em processo de multiplicação minutos, horas, dias, meses 5. Os mutantes continuam com o crescimento na presença do antimicrobiano e iniciam dispersão pelo ambiente 2. Processo de crescimento e divisão produzem naturalmente células mutantes Pressão seletiva 4. Células são mortas ou impedidas de multiplicação pela antimicrobiano com exceção dos mutantes resistentes ao antimicrobiano específico. Células são expostas a um composto antimicrobiano 3. População continua multiplicação, e originando ocasionalmente, mais células mutantes
Variação permanente resultante de Recombinação Genética 1. Duas populações bacterianas A e B crescem em um mesmo ambiente. A espécie B é resistente a droga X. 2. Troca de DNA (elementos genéticos móveis) ocorre entre células em baixa frequência. Pressão seletiva 4. Na presença da droga X, as células da espécie A que receberam gen da resistência da espécie B são capazes de multiplicar-se enquanto que as células originalmente sensíveis não multiplicam-se. Bactérias são expostas a droga X. 3. Células da espécie A recebem o gen de resistência a droga X, presente no elemento genético móvel da espécie B.
Sítios de ação de drogas antibacterianas Azitromicina Claritromicina Estreptograminas (Quinopristina/ Dalfopristina) Tigeciclina Síntese de lipídeos Platensimicina Streptomyces platensis
DEFINIÇÕES Resistente: É aquela capaz de crescer in vitro em presença da concentração média que a droga atinge no sangue do hospedeiro durante o tratamento, quando administrada por via oral Sensível: Quando não cresce nestas condições
TIPOS DE RESISTÊNCIA Natural: Todos os indivíduos da espécie são resistentes Ex. Ausência do sítio de ação (Drogas que atuam na parede; Macrolídeos e ausência de receptores nos ribossomos de Gram negativas)
Adquirida: Linhagens resistentes e sensíveis na mesma espécie Mecanismos genéticos - Mutações e Recombinação Genética Resistência é vantajosa só na presença da droga (não provoca inibição ou morte de possíveis competidores da bactéria resistente)
Natural ou intrínseca: Bactéria está fora do espectro de ação da droga Resistência EXEMPLOS: Penicilina G Bactérias Gram negativas Penicilinas Micoplasma Vancomicina Bactérias Gram negativas Aminoglicosídeos Bactérias anaeróbias Adquirida: Por mecanismos genéticos diversos, surgem numa população bacteriana amostras que não sofrem mais a ação da droga, que é eficaz contra o resto da população
Resistência Cromossômica (Mutação) Resistência Simples (uma única droga) É possível a transferência desta resistência
Tipos de Resistência Cromossômica
Resistência Extra-Cromossômica Plasmídeos Plasmídeo R (possuir o segmento FTR Plamídeo F) Perda do fator de resistência ( Cura ) (Repiques frequentes, uso de substâncias químicas)
Expressão Bioquímica da Resistência
Drogas que inibem a RNA Polimerase: Rifampicina Mecanismos de ação Drogas que inibem a síntese do DNA: Fluoroquinolonas. Mecanismos de resistência Redução na permeabilidade para a droga. Bomba de Efluxo Parede bacteriana Drogas que inibem a formação da parede bacteriana: Penicilinas, Cefalosporinas, Manobactâmicos, Carbapenem, Vancomicina, Drogas que agem sobre os ribossomos e síntese protéica: Aminoglicosídeos, Tetraciclinas, Macrolídeos, Clindamicina, Cloranfenicol, Linezolida. Drogas que agem sobre a membrana plasmatica alterando sua estrutura :Polimixinas, Daptomicina. Alteração ou destruição da droga por enzimas (ex. β-lactamase, fosfotransferases, adenilase, acetilase, acetiltransferase) Modificação no sítio de ação da droga. (PBP, DNA girase, ribossomos)
-lactamases do Grupo 1 (AmpC( AmpC) Testes de sensibilidade aos antimicrobianos Kirby&Bauer E Teste
Determinação de sensibilidade bacteriana aos antimicrobianos Prof. Ary Fernandes Junior Departamento de Microbiologia e Imunologia Instituto de Biociências - UNESP Distrito de Rubião Júnior s/n CEP 18618-000/ Botucatu/ SP /Brasil Tel. 14 3880.0412/0413 ary@ibb.unesp.br
Diagnóstico microbiológico O diagnóstico laboratorial das doenças infecciosas começa com a indicação clínica adequada do exame microbiológico, o que requer conhecimento da epidemiologia e da fisiopatologia do processo infeccioso. requer o conhecimento e a colaboração de vários profissionais
A suspeita clínica do processo infeccioso determinará o tipo de amostra clínica que deve ser enviada ao laboratório para confirmar, estabelecer ou complementar o diagnóstico clínico A coleta e o transporte da amostra são etapas críticas na execução do exame microbiológico.
Representação esquemática do fluxograma da amostra clínica enviada para o exame microbiológico
Identificação laboratorial de patógenos clínicos (Fase analítica) Antibiograma
Antibiograma (Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI), Auxiliar o clínico com a escolha do antimicrobiano a prescrever para o paciente pois verifica se a bactéria pesquisada é sensível ou resistente aos antimicrobianos testados. Princípio da Diluição Princípio da Difusão
1.Métodos baseados na diluição da droga Diluição em caldo Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM) Diluição em meio de cultura sólido CIM
Macrodiluição em tubos (1 a 2 ml de meio) Primeira a ser utilizada na avaliação da sensibilidade aos agentes antimicrobianos e envolve a preparação de diluições seriadas e logarítmicas de antimicrobianos (por exemplo, 1, 2, 4 e 8 μg/ml) em um meio de cultura líquido, o qual permitirá o crescimento bacteriano.
Determinação da CIM pelo método da diluição em caldo. A CIM no exemplo abaixo é de 16µg/ml.
Microdiluição em Placas de Elisa (100 a 200µ l)
Apresentação de uma placa utilizada no teste de microdiluição, após sua inoculação e incubação. 1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 µg/ml Controles positivos
2.Métodos baseados na difusão da droga Princípio do método de Kirby - Bauer Parâmetros a serem padronizados: meio de cultura, discos, inoculação do germe no meio, incubação das placas, leitura e interpretação a.controle de qualidade
Método de Kirby-Bauer Meio de Cultura (Mueller-Hinton Meio Padrão) Permite crescimento satisfatório da maioria dos germes não fastidiosos; Não interfere com a atividade da droga (Ex.: peptonas sulfas; Mg ++ - gentamicina; Ca ++, Fe ++, Mg ++ - tetraciclinas) São utilizadas placas de Petri (vidro ou plástico) com camada do meio de 6 mm de espessura
Inóculo (Padronizado) Preparo: Transferir para um tubo com BHI (Brain Heart Infusion) 5 colônias da bactéria em estudo; incubar a 37 o C; obter densidade equivalente ao padrão de Mc Farland 0,5 (1,5 x 10 8 UFC/mL) Obs. O padrão 0,5 de Mc Farland é o correspondente a turvação mostrada em solução contendo 0,5 ml de BaCl 2 a 1% em 99,5 ml de solução de ácido sulfúrico a 1%)
0,5 1,0 2,0 3,0 Tubos da escala de McFarland posicionados em frente do cartão de Wickerham. Comparação da escala 0,5 de McFarland com suspensão bacteriana (E. coli ATCC 25922)
Semeadura: Swab estéril; retirar excesso de caldo e semear na superfície do meio uniformemente; secar em temperatura ambiente por 3 a 5 minutos. Importante: número de colônias utilizadas (várias); material contaminado com flora normal (não usar colônias provenientes de meios de enriquecimento); variações na densidade do inóculo possibilitam variações também no tamanho do halo de inibição
Discos Aplicação: pressionar levemente contra a superfície do meio e pelo menos 2 cm da borda da placa e a pelo menos 3 cm um do outro (evitar halos de inibição em fusão); usar apenas um disco de cada grupo de drogas (concentração única) Características: papel de filtro adequado; concentração de droga suficiente; prazo de validade; controle de eficiência
Incubação das Placas Em temperatura (37 o C) e atmosfera adequada para o crescimento da bactéria (aerobiose, anaerobiose, 10% de CO 2 ) Atmosfera influi na atividade das drogas: tetraciclina, meticilina e novobiocina CO 2 ; estreptomicina e canamicina - anaerobiose
Leitura das Placas Após 18-24 horas de incubação; usar compasso ou régua para determinar o diâmetro do halo de inibição; colônias dentro do halo sugerem mutantes resistentes ou contaminantes.
Halo de leitura em mm
Interpretação resistente, moderadamente resistente ou sensível, de acordo com o halo de inibição; há correlação inversa entre concentração inibitória mínima e diâmetro do halo de inibição.
Curva de regressão linear da correlação entre a CIM e o halo de inibição.
Kirby e Bauer Método dos discos CIM (µg/ml) Resistente Intermediário Sensível Halo de inibição (mm)
Etest ( teste da elipse = Episilometer test)
Área de Crescimento bacteriano Fita graduada de material impermeável Elipse de inibição Concentração Inibitória Mínima (CIM) Apresentação do Etest para avaliação da CIM após incubação
Muito obrigado!!!!