PURIFICAÇÃO PARCIAL E ESTUDO CINÉTICO DA ENZIMA CATALASE DE BATATA DOCE (Ipomoea batatas) Matheus Felipe Rocha Ferraz BELO 1 ; André Luis Fachini de SOUZA 2 1 Bolsista PIBIC-EM/CNPq/IFC; 2 Orientador IFC-Câmpus Araquari Introdução A catalase foi descoberta em 1818 pela observação de que em alguns tecidos de plantas e animais, o peróxido de hidrogênio (H2O2) era prontamente degradado. Então, foi estabelecido pela primeira vez, que a degradação do peróxido de hidrogênio havia sido ocasionada por uma enzima, a qual ficou conhecida como catalase. (AEBI e SUTTER, 1971; LOEW, 191). A catalase encontra-se amplamente distribuída entre animais, vegetais e microrganismos. Estruturalmente, o tipo mais comum desta enzima é um tetrâmero (aproximadamente 5 aminoácidos por tetrâmero), contendo quatro grupos heme (WHITTAKER, 212, CHELIKANI, FITA, LOEWEN, 24). Quando o peróxido de hidrogênio é produzido em um organismo aeróbico, devido ao metabolismo celular, o H2O2 torna-se altamente tóxico. A catalase tem como função proteger a célula contra a oxidação, assim ela irá catalisar rapidamente a decomposição do H2O2 em H2O e O2. Esta enzima tem a capacidade de decompor milhões de moléculas de peróxido de hidrogênio por segundo (SCANDALIOS, GUAN e POLIDOROS, 1997). Além de sua importância celular, a catalase é aplicada em diversos setores produtivos, como na indústria de queijos, indústria têxtil, desinfecção de lentes de contatos, exames laboratoriais, cosméticos e embalagens alimentícias, onde previnem a oxidação dos alimentos. O objetivo deste trabalho foi estudar alguns parâmetros cinéticos (ph, temperatura, concentração de enzima e concentração de substrato) da enzima catalase, obtida a partir do extrato bruto de batata doce. Material e Métodos Foi preparado um extrato da enzima catalase a partir de 146,82 g de batata doce (Ipomoea batatas) sem cascas. Estas batatas foram batidas em liquidificador com 1 ml de tampão fosfato de sódio,1 mol/l ph 7, estéril. Todos os reagentes líquidos foram previamente esterilizados em autoclave a 121 C, 1atm por 2 minutos e resfriados antes da utilização para evitar a ação de proteases e manter a estabilidade da catalase. A mistura foi
filtrada em gaze e o filtrado foi centrifugado a 1. g por 1 minutos e 5 C. Ao sobrenadante (extrato bruto de catalase) foi adicionado glicerol para uma concentração final de 5% (v/v) e armazenado a -7 C. A quantidade de proteína no extrato de enzima foi dosado pelo método descrito por BRADFORD (1976), utilizando albumina de soro bovino como padrão. Os ensaios de atividade de catalase foram efetuados em tubos de ensaio de 15 ml contendo o sistema de reação composto por tampão fosfato de sódio,1 mol/l ph 7,, peróxido de hidrogênio (H2O2) e extrato bruto de catalase, totalizando um volume final de 3,2 ml. Estes sistemas foram incubados por 15 minutos na temperatura apropriada para a condição testada. A atividade da enzima foi determinada a partir da quantificação de H2O2 remanescente nos sistemas de reação por titulometria de oxirredução (permanganometria) (OHLWEILER, 1974), utilizando permanganato de potássio,2 mol/l previamente padronizado com oxalato de sódio,5 mol/l. Imediatamente após a incubação das reações enzimáticas, foram adicionados 2 ml de H2SO4 1:5 (v/v) aos sistemas de reação, seguido pela titulação. Foi estudado o efeito dos parâmetros cinéticos temperatura, ph, concentração de enzima e concentração de substrato sobre a atividade da catalase. Para o estudo do efeito da temperatura, sistemas de reação contendo H2O2,27 mol/l e 2 µl de extrato bruto de catalase (188 µg de proteína total) foram incubados em temperaturas entre 8 C a 45 C. Para o estudo do efeito do ph, foram preparadas soluções na faixa de ph 3-1 contendo H2O2,27 mol/l e 2 µl de extrato bruto de catalase, seguido de incubação a 3 C. Para o estudo do efeito da concentração de enzima, foram testados sistemas de reação contendo H2O2,27 mol/l e concentrações crescentes de extrato de catalase (47, 94, 141, 188, 235 e 282 µg de proteína total). Os sistemas foram incubados a 3 C. Para os ensaios do efeito da variação da concentração de substrato, foram preparados sistemas reacionais contendo 2 µl de extrato bruto de enzima em tampão fosfato,1 mol/l ph 7, contendo H2O2 nas concentrações,7,,14,,21,,27,,55 e 1,38 mol/l e incubados a 3 C. A partir destes ensaios foi possível estimar os valores de velocidade máxima (Vmáx) e constante de Michaelis-Menten (km). Resultados e discussão Catalases (hidroperoxidases, E.C.1.11.1.6) são enzimas que catalisam a degradação de duas moléculas de peróxido de hidrogênio em duas moléculas de água e uma de oxigênio. Elas
Concentração de H 2 O 2 (mol/l) Concentração de H 2 O 2 (mol/l) estão presentes virtualmente em todos organismos aeróbicos e em muitos anaeróbicos (SWITALA e LOEWEN, 22; CHELIKANI, FITA e LOEWEN, 24). Para a determinação da atividade da catalase de batata doce (Ipomoea batatas) nos experimentos executados, foi quantificada a concentração de H2O2 remanescente nos sistemas de reação após 15 minutos de incubação nas condições ensaiadas. Assim, para os ensaios do efeito da temperatura e ph, quanto menor a concentração de H2O2 determinada, maior a atividade enzimática observada. Nos experimentos do efeito da concentração de substrato, determinou-se a diminuição na concentração de H2O2 (-d[s]/dt) como estimativa da atividade enzimática. Para o estudo do efeito do ph, foram testados sistemas de reação em uma faixa de ph de 3, a 1, (Figura 1A). Os resultados mostraram que a enzima apresenta atividade máxima na faixa de ph entre 6, e 8,, com o valor médio de atividade máxima em ph 7,. Para o estudo do efeito da temperatura na atividade da catalase de batata doce, foram testados sistemas de reação incubados em temperaturas entre 8 C a 45 C (Figura 1B). A atividade máxima foi observada na faixa de temperatura entre 25 C e 3 C. Baseado nos resultados apresentados, todos os demais experimentos foram realizados preparando-se sistemas de reação em tampão fosfato de sódio,1 mol/l ph 7, e incubados a 3 C. (A) (B),5,6,4,5,3,2,1,4,3,2,1 2 4 6 8 1 12 ph 1 2 3 4 5 Temperatura ( C) Figura 1 Efeito da variação do ph (A) e da temperatura (B) sobre a atividade da catalase de extrato bruto de batata doce (Ipomoea batatas). Em ambos os experimentos, os sistemas de reação foram incubados por 15 minutos. Os dados apresentados referem-se a um experimento representativo de três realizados em triplicada e independentemente.
v (mol/l/min.) 1/v (L.min./mol) Ensaios do efeito da concentração de enzima mostraram que a atividade máxima foi atingida quando utilizou-se extrato de enzima contendo entre 188 e 235 µg de proteína total (dados não mostrados). Para o estudo do efeito da concentração de substrato, considera-se o seguinte mecanismo: E + H 2O 2 E-H 2O 2 E + H 2O + O 2. Neste mecanismo a enzima forma um complexo intermediário com o substrato (H2O2) e esse complexo dá origem aos produtos, regenerando a enzima na sequência. A velocidade da reação é proporcional à concentração deste complexo. Se a concentração de substrato é muito alta em relação à concentração de enzima, a enzima pode estar saturada de substrato e neste ponto o aumento da concentração de substrato não aumenta a concentração do complexo enzima-substrato, atingindo-se a velocidade máxima (Vmáx). A velocidade da reação enzimática pode ser observada pela formação de produto (P) ou pela diminuição da concentração de substrato, no início da mistura de enzima (E) e substrato (S). Assim, evita-se a interferência da variação da concentração de substrato [S], considerandose que sua concentração é muito próxima do valor inicial. Desta forma, determina-se a velocidade inicial (v ) em que [S] é geralmente muito maior que [E]. O estudo do efeito da variação da [S] na v, quando [E] e tempo de incubação são constantes, fornece um gráfico com perfil de hipérbole retangular (Figura 2A). Neste gráfico, a determinação do valor de Vmáx (velocidade máxima) e Km ([S] correspondente a metade da Vmáx) tornam-se imprecisos, necessitando-se linearizar este gráfico (Figura 2B). Este método de linearização é chamado de Lineweaver-Burk, onde plota-se o inverso da v e o inverso da [S]. (A) (B),3,25,2,15 2 15 1 1/v =,587(1/[S]) +,472 R² =,9995,1,5 1 2 3 4 5 Concentração de substrato - H 2 O 2 (mol/l) 5-5 5 1 15 2 25 3-5 1/[H 2 O 2 ] (L/mol) Figura 2 Gráfico de Michaelis-Menten (A) e linearização de Lineweaver-Burk (B). Os gráficos representam um experimento de três realizados em triplicata e independentemente.
No gráfico linear de Lineweaver-Burk, a interseção da reta no eixo y (1/[S]=) equivale a 1/Vmáx, determinando-se o valor aproximado de 2 mol/l/min. A interseção da reta no eixo x (1/v =) equivale a -1/Km, encontrando-se o valor aproximado de,8 mol/l. O valor de K m é uma constante particular de cada enzima para um determinado substrato. Uma variação no valor de K m induzida por um ligante é uma maneira de regular a atividade enzimática. Pode-se ajustar as condições para se obter [S] >>>K m e se determinar a V máx. da reação. Conclusão A enzima catalase, obtida a partir do extrato bruto de batata doce, apresentou atividade máxima em ph 7, e temperatura de 3 C. Também, a enzima se ajustou à cinética de Michaelis-Menten, apresentando Vmáx de 2 mol/l/min e Km de,8 mol/l. Referências BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72:248-254, 1976. CHELIKANIA, P.; FITA, I.; LOEWENA, P.C. Diversity of structures and properties among catalases. Cell. Mol. Life Sci., 61:192 28, 24. SCANDALIOS, J.G.; GUAN, L.; POLIDOROS, A.N. Catalases in Plants: Gene Structure, Properties, Regulation, and Expression. Oxidative Stress and the Molecular Biology of Antioxidant Defenses. Cold Spring Harbor Liboratory Press: New York, 1997. SWITALA, J.; LOEWEN, P.C. Diversity of properties among catalases. Arch. Biochem. Biophys. 41:145 154, 22. WHITTAKER, J.W. Non-heme manganese catalase The other catalase. Arch. Biochem. Biophys., 525(2):111-12, 212. OWLWEILER, O.A. Química analítica quantitativa. Rio de Janeiro: Livros Técnicos e Científicos, 1974.