Criopreservação de sémen ovino: comparação entre dois diluidores

Universidade Lusófona de Humanidades e Tecnologias Licenciatura em Biologia Susana Isabel Soares Valente Criopreservação de sémen ovino: comparação entre dois diluidores Estação Zootécnica Nacional Departamento de Reprodução Animal Doutor João Pedro Barbas Doutora Rosa Lino Neto Mestre Frederico Almada 2007

Criopreservação de sémen ovino: comparação entre dois diluidores Apresentação científica efectuada no âmbito deste trabalho Valente S., Pereira R.M., Baptista M.C., Marques C.C., Vasques M.I., Horta A.E.M., Barbas, J.P. (2007) Avaliação da capacidade fertilizante de sémen de carneiro congelado através da fertilização heteróloga. Resultados preliminares. In: Proceedings of Jornadas de reprodução Animal, VI Simpósio da Sociedade Portuguesa de Reprodução Animal e IV Jornadas da Associação de Estudantes de Medicina Veterinária de Évora, Universidade de Évora, Portugal, pp.78. (Anexo III) I

Susana Valente Agradecimentos Aos orientadores externos, Doutor Pedro Barbas e Doutora Rosa Lino Neto, pela total disponibilidade humana e de recursos, amizade e boa disposição no trabalho, bem como pela inesgotável paciência, sabedoria e dedicação com que me acompanharam durante todo o estágio. Ao orientador interno, Mestre Frederico Almada, pelo apoio constante, colaboração e dedicação e, sobretudo, pela amizade e grandeza de espírito ao aceitar este desafio. À equipa de trabalho do laboratório de embriologia da Estação Zootécnica Nacional, Drª Carla Marques, Drª Irene Vasques, Engª Maria da Conceição Baptista por todo o apoio, ajuda e carinho sem os quais não teria sido possível realizar este trabalho. À pessoa mais meiga que conheço, Drª Carla, sempre calma e com uma palavra amiga para dar. À Isabel Santos pelo companheirismo e ensinamento. Ao Dr Ramiro Mascaranhas e Drª Sandra Cavaco pelas oportunidades de novos conhecimentos. À Engª Marta Vacas de Carvalho pela preciosa ajuda no tratamento estatístico. Ao Doutor António Horta, Director do departamento de Reprodução Animal, por permitir a realização deste estágio, pelo seu espírito cientifico brilhante, pela disponibilidade, ajuda e amizade. Ao Luís Inácio pelas horas passadas no matadouro a recolher ovários, pela ajuda com o maneio dos animais, pela amizade e boa disposição. Ao Carlos, Vítor, Faíca e Paulo pela prestabilidade e ajuda. Ao Miguel Centeno pela inesgotável boa disposição. Ás Sras Perpétua e Maria José pela amizade. Ao Hélder, Mariana, Ingrid, Patrícia e Rosário pela disponibilidade, ajuda, apoio, simpatia e amizade. Ao Doutor Ribeiro, Director da Estação Zootécnica Nacional, pelas facilidades concedidas para a realização deste estágio. A todos os outros funcionários da Estação Zootécnica Nacional que contribuíram para a realização deste trabalho. Ao Luíz Raposo pela preciosa ajuda com as fotografias de microscópia de fluorescência. II

Criopreservação de sémen ovino: comparação entre dois diluidores À família e amigos, em especial ao Daniel e à Isa pela ajuda, compreensão e carinho em todos os momentos. III

Susana Valente Resumo A criopreservação induz alterações estruturais e funcionais na membrana dos espermatozóides reduzindo a fertilidade após a inseminação artificial. Vários diluidores foram desenvolvidos para reduzir estes danos e melhorar a sua capacidade fertilizante. A previsão in vitro da fertilidade de ejaculados é vantajosa para a produção ovina. No 1º ensaio, o objectivo foi comparar a acção crioprotectora de dois diluidores (EZN e Aisen) utilizados na congelação de sémen de carneiro, através da avaliação de parâmetros seminais antes e depois da congelação. No sémen fresco, observaram-se diferenças (P = 0,001) entre carneiros para os parâmetros vitalidade e anomalias da peça intermédia. No sémen descongelado, observaram-se apenas diferenças entre diluidores. Com o diluidor EZN obtiveram-se valores superiores de mobilidade individual (MI) após descongelação (46,50 vs 38,89%, P = 0,001) e para o teste de termorresistência (47,86 vs 39,08%, P < 0,0001), e de endosmose positiva (40,57 vs 32,14%, P = 0,025). Pelo contrário, a vitalidade foi superior com o diluidor Aisen (66,54 vs 59,75%, P = 0,017). No 2º ensaio comparou-se a acção crioprotectora dos dois diluidores através da avaliação da capacidade fertilizante do sémen após descongelação, bem como se os resultados do 1º e 2º ensaio se encontram correlacionados com a fertilização in vitro (FIV) heteróloga. Após descongelacão e swim-up, o sémen foi avaliado e utilizado na FIV homóloga e heteróloga (oócitos bovinos). A MI pré (57, 88 vs 42,08%, P = 0,004) e pós (67,92 vs 56,67%, P = 0,003) swim-up, a taxa de clivagem (57,15% vs 33,50%, P = 0,023) e de FIV homóloga (85,27 vs 62,95%, P = 0,04) e heteróloga (64,31 vs 48,36%, P = 0,05) foram superiores com o diluidor EZN. A taxa de oócitos ovinos fertilizados com 2 pronúcleos foi superior (P 0,003) com o diluidor EZN (48,38 vs 28,15%), e a de espermatozóides em descondensação, com o diluidor Aisen (17,20% vs 3,39%). Também, os estadios após FIV heteróloga estavam mais avançados com o diluidor EZN (zigotos com uma célula: 15,13 vs 2,56%, P 0,003). A taxa de polispermia após FIV homóloga foi superior com o diluidor EZN (15,13 vs 2,56%, P 0,003). Foi identificada uma correlação (r = 0,6; P < 0,0001) entre as taxas de FIV heteróloga e de embriões ao dia 7/8. Conclui-se que o diluidor EZN tem uma acção crioprotectora superior ao diluidor Aisen, permitindo uma maior capacidade fertilizante dos espermatozóides após descongelação, confirmada não só pelos presentes resultados mas também pelas fertilidades após inseminação cervical. A FIV heteróloga poderá constituir uma mais valia na previsão da fertilidade do sémen de carneiro congelado IV

Criopreservação de sémen ovino: comparação entre dois diluidores Abstract Cryopreservation induces structural and functional alterations in the membranes of spermatozoa imparing artificial insemination fertility. Several extenders have been developed to reduce freezing damages and improve post-thawing spermatozoa fertilizing ability. Therefore, predicting the in vitro fertility of individual ejaculates is desirable for the ovine production. On the first experiment, the aim of this study was to compare the cryopreservation capacity of two extenders of ram semen (EZN and Aisen) through sperm parameters evaluation before and after freezing. With fresh semen, differences (P= 0,001) between rams were detected for live spermatozoa and middlepiece abnormalities. For frozen/thawed semen traits, no differences between rams were observed. Motility after thawing (46,50% vs 38,89%, P = 0,001) and during termorresistance (47,86% vs 39,08%, P < 0,0001) and positive endosmose (40,57% vs 32,14%, P = 0,025) were higher with EZN extender, whereas Aisen extender showed better post-thawed vitality (66,54% vs 59,75%, P = 0,017). On the second experiment, the aim was to compare the capacitation status and fertilizing capacity of frozen ram semen using the two extenders, and to test if the results (1 st and 2 nd assays) were correlated with heterologous in vitro fertilization. After thawing and swim-up, semen was evaluated and used for homologous and heterologous (bovine oocytes) fertilization. Pre (57, 88% vs 42,08%, P = 0,004) and post (67,92% vs 56,67%, P = 0,003) swim-up motility, cleavage rate (57,15% vs 33,50%, P = 0,023) and homologous (85,27% vs 62,95%, P = 0,04) and heterologous (64,31% vs 48,36%, P = 0,05 ) fertilization rates were higher with EZN extender. Homologous fertilized oocytes reaching 2 pronucleous stage were higher when using EZN extender (48,38% vs 28,15%, P 0,003) but the presence of sperm head decondensation was higher with Aisen extender (17,20% vs 3,39%, P 0,003). Advanced stages of heterologous fertilization were also obtained with EZN extender (zygote: 18,98% vs 8,88%, P 0,003). Polyspermy was higher with EZN extender for homologous fertilization (15,13% vs 2,56%, P 0,003). A correlation (r = 0,6; P < 0,0001) between heterologous fertilization and 7/8 th day embryo rates were identified. It was concluded that the EZN extender has a better cryoprotective action as showned not only by the present seminal and fertilizing results but also by field fertility results. Heterologous fertilization seems to be an useful tool for predicting the fertility of frozen-thawed ram semen. V

Susana Valente Índice geral Apresentação científica efectuada no âmbito deste trabalho...i Agradecimentos...II Resumo...IV Abstract...V Índice de tabelas...x Índice de figuras...xii Abreviaturas...XIII 1. Introdução... 1 1.1. Inseminação Artificial... 1 1.1.1. Vantagens da inseminação artificial... 2 1.1.1.1. Melhoramento genético e diminuição de efectivo... 2 1.1.1.2. Aumento da eficácia reprodutora... 2 1.1.1.3. Facilidade de transporte do material genético, prevenção e controlo de doenças... 3 1.1.1.4. Uso de outras tecnologias... 3 1.1.2. Desvantagens da inseminação artificial... 3 1.2. Sémen... 4 1.2.1. Plasma seminal... 4 1.2.2. Espermatozóides... 5 1.2.2.1. Espermatogénese... 5 1.2.2.2. Espermiogénese... 6 1.2.2.3. Espermiação... 7 1.2.2.4. Morfologia espermática... 7 1.3. Preparação do espermatozóide para a fertilização... 8 1.3.1. Maturação e adição de factores decapacitantes... 8 1.3.2. Capacitação e hiperactivação... 9 1.3.3. Reconhecimento e ligação ao oócito... 10 1.3.4. Reacção acrossómica e digestão da zona pelúcida... 11 1.3.5. Fusão dos gâmetas... 12 1.4. Criopreservação de espermatozóides... 12 1.4.1. Como proteger os espermatozóides durante a criopreservação... 15 1.4.1.1. Glicerol... 16 1.4.1.2. Trealose... 17 1.4.1.3. Lípidos... 20 1.4.1.4. Antioxidantes... 23 VI

Criopreservação de sémen ovino: comparação entre dois diluidores 1.4.1.5. Outros... 24 1.5. Avaliação laboratorial dos parâmetros seminais... 24 1.5.1. Volume e concentração... 25 1.5.2. Mobilidade... 26 1.5.3. Vitalidade... 26 1.5.4. Morfologia... 26 1.5.5. Funcionalidade do transporte espermático... 27 1.5.6. Integridade da membrana celular... 27 1.5.7. Capacidade de ligação e fertilização... 28 1.5.7.1. Testes de ligação do espermatozóide às células do oviducto... 29 1.5.7.2. Testes de ligação e penetração da zona pelúcida... 29 1.5.7.3. Fertilização in vitro... 31 1.6. Objectivos... 32 2. Material e métodos... 33 2.1. Delineamento experimental... 33 2.1.1. Ensaio 1... 33 2.1.2. Ensaio 2... 34 2.1.2.1. Capacitação dos espermatozóides após descongelação... 34 2.1.2.2. Fertilização in vitro homóloga... 34 2.1.2.3. Fertilização in vitro heteróloga... 35 2.2. Recolha de ovários... 36 2.3. Recolha de complexos cumulus-oócitos... 36 2.3.1. Bovinos... 36 2.3.2. Ovinos... 36 2.4. Maturação dos complexos cumulus-oócitos... 37 2.4.1. Bovinos... 37 2.4.2. Ovinos... 37 2.5. Recolha de sémen... 38 2.6. Diluição e acondicionamento de sémen... 38 2.7. Arrefecimento e congelação de sémen... 38 2.8. Descongelação de sémen... 38 2.9. Avaliação do sémen... 39 2.9.1. Mobilidade... 39 2.9.1.1. Mobilidade Massal... 39 2.9.1.2. Mobilidade Individual... 39 2.9.2. Vitalidade... 40 2.9.3. Morfologia... 40 VII

Susana Valente 2.9.3.1. Formas normais/anormais... 40 2.9.3.2. Integridade do acrossoma... 40 2.9.3.3. Permeabilidade da membrana... 40 2.9.4. Osmolaridade... 41 2.9.5. Termorresistência... 41 2.9.6. Testes de fertilidade... 41 2.9.6.1. Capacitação dos espermatozóides após descongelação... 41 2.9.6.1.1. Swim-up... 41 2.9.6.1.2. Teste da clorotetraciclina... 42 2.9.6.2. Fertilização in vitro homóloga... 43 2.9.6.3. Fertilização in vitro heteróloga... 45 2.10. Análise estatística... 46 2.10.1. Ensaio 1... 46 2.10.2. Ensaio 2... 46 3. Resultados... 48 3.1. Ensaio 1... 48 3.1.1. Sémen fresco... 48 3.1.2. Sémen descongelado... 50 3.1.3. Diferenças entre sémen descongelado e sémen fresco... 51 3.1.4. Correlações... 53 3.1.4.1. Sémen fresco vs sémen fresco... 53 3.1.4.2. Sémen descongelado vs sémen descongelado... 54 3.1.4.3. Sémen EZN fresco vs sémen EZN descongelado... 54 3.1.4.4. Sémen Aisen fresco vs sémen Aisen descongelado... 55 3.1.5. Osmolaridade... 59 3.1.6. Termorresistência... 60 3.2. Ensaio 2... 62 3.2.1. Avaliação dos espermatozóides após descongelação e swim-up... 62 3.2.2. Fertilização in vitro homóloga... 62 3.2.3. Fertilização in vitro heteróloga... 64 3.2.4. Correlações... 64 4. Discussão e conclusão... 66 4.1. Ensaio 1... 66 4.1.1. Sémen fresco... 66 4.1.2. Sémen descongelado... 66 4.1.3. Sémen fresco vs sémen descongelado... 68 4.1.4. Correlações... 68 VIII

Criopreservação de sémen ovino: comparação entre dois diluidores 4.1.5. Osmolaridade e Termorresistência... 69 4.2. Ensaio 2... 71 4.2.1. Avaliação dos espermatozóides submetidos à técnica swim-up... 71 4.2.2. Fertilização in vitro... 72 4.2.3. Correlações... 74 4.3. Conclusão... 77 5. Perspectivas futuras... 78 6. Bibliografia... 79 Anexos IX

Susana Valente Índice de tabelas Tabela 1.1: Composição do sémen de algumas espécies domésticas (mg/100 ml excepto quando indicada outra unidade).... 4 Tabela 2.1: Classificação da Mobilidade Massal.... 39 Tabela 3.1: Análise dos efeitos Carneiro (factores: SE1; SE4) e Diluidor (factores: EZN; Aisen) para os parâmetros mobilidade individual (MI) e espermatozóides (spz) vivos no sémen fresco.... 48 Tabela 3.2: Análise dos efeitos Carneiro (factores: SE1; SE4) e Diluidor (factores: EZN; Aisen) para a percentagem (%) de espermatozóides normais e de anomalias (cabeça, PI:peça intermédia e cauda) no sémen fresco.... 49 Tabela 3.3: Análise dos efeitos Carneiro (factores: SE1; SE4) e Diluidor (factores: EZN; Aisen) para a percentagem (%) de espermatozóides com endosmose positiva (endosmose +) e acrossoma intacto no sémen fresco.... 49 Tabela 3.4: Análise dos efeitos Carneiro (factores: SE1; SE4) e Diluidor (factores: EZN; Aisen) para a mobilidade individual (MI) e espermatozóides (spz) vivos no sémen descongelado... 50 Tabela 3.5: Análise dos efeitos Carneiro (factores: SE1; SE4) e Diluidor (factores: EZN; Aisen) para a percentagem (%) de espermatozóides normais e de anomalias (cabeça, PI: peça intermédia e cauda) no sémen descongelado.... 50 Tabela 3.6: Análise dos efeitos Carneiro (factores: SE1; SE4) e Diluidor (factores: EZN; Aisen) para a percentagem (%) de espermatozóides com endosmose positiva (endosmose +) e acrossoma intacto no sémen descongelado.... 51 Tabela 3.7: Análise dos efeitos Carneiro (factores: SE1; SE4) e Diluidor (factores: EZN; Aisen) para as diferenças (Dif.: SD SF) entre o sémen descongelado (SD) e o sémen fresco (SF) para os parâmetros mobilidade individual (Dif. MI) e espermatozóides vivos (Dif. vivos)... 51 Tabela 3.8: Análise dos efeitos Carneiro (factores: SE1; SE4) e Diluidor (factores: EZN; Aisen) para as diferenças (Dif: SD SF) entre o sémen descongelado (SD) e o sémen fresco (SF) para os parâmetros espermatozóides normais (Dif. Normais) e de anomalias da cabeça (Dif. anomalias da cabeça), da peça intermédia (Dif. anomalias da PI) e da cauda (Dif. anomalias da cauda).... 52 Tabela 3.9: Análise dos efeitos Carneiro (factores: SE1; SE4) e Diluidor (factores: EZN; Aisen) para as diferenças entre o sémen descongelado e o sémen fresco (SD SF) para os parâmetros espermatozóides com endosmoses positivas (Dif. Endosmose +) e acrossomas intactos (Dif. Acrossoma intacto)... 52 Tabela 3.10: Correlação de Pearson entre os diferentes parâmetros avaliados no sémen fresco.53 Tabela 3.11: Correlação de Pearson entre os diferentes parâmetros avaliados no sémen descongelado.... 54 Tabela 3.12: Correlação de Pearson entre os diferentes parâmetros avaliados no sémen EZN fresco e descongelado... 57 Tabela 3.13: Correlação de Pearson entre os diferentes parâmetros avaliados no sémen Aisen fresco e descongelado... 58 X

Criopreservação de sémen ovino: comparação entre dois diluidores Tabela 3.14: Valores médios (χ) e desvios padrão (σ) correspondentes das osmolaridades (mosm/l) de vários parâmetros em fresco.... 59 Tabela 3.15: Valores médios (χ), desvios padrão (σ) e Vosm [(SD + S/A) SD)] correspondentes da osmolaridade (mosm/l) de várias soluções após descongelação (D). (S: soro; A: fracção A)... 60 Tabela 3.16: Avaliação da mobilidade individual (MI) após descongelação dos espermatozóides (spz) e da MI, vigor e concentração após swim-up (SW)... 62 Tabela 3.17: Determinação do estado acrossómico dos espermatozóides (spz) pelo teste de clorotetraciclina após descongelação e swim-up... 62 Tabela 3.18: Taxa de clivagem e produção de embriões em vários estadios de desenvolvimento (clivagem, embriões D7/8 e embriões eclodidos) pós-inseminação com espermatozóides congelados nos diluidores EZN e Aisen.... 63 XI

Susana Valente Índice de figuras Figura 1.1: Esquema ilustrativo dos processos de formação do espermatozóide (Adaptado de www.profmarcosbio.hpg.ig.com.br/gameto.htm).... 6 Figura 2.1: Diferentes estadios dos oócitos/embriões fixados.... 44 Figura 2.2: Diferentes estadios de desenvolvimento dos embriões ovinos produzidos in vitro.. 45 Figura 3.1: Variação da mobilidade individual (MI, %) em função do tempo (minutos), do sémen (EZN, Aisen) e do meio de descongelação (A: fracção A; S: soro)... 61 Figura 3.2: Estadios dos oócitos/zigotos fixados em aceto-lacmóide 1% 18 horas após fertilização homóloga com o sémen EZN e sémen Aisen... 63 Figura 3.3: Estadios dos oócitos/zigotos fixados obtidos por fertilização heteróloga com o sémen EZN e sémen Aisen... 64 Figura 3.4: Regressão linear entre os parâmetros taxa de fertilização heteróloga (taxa fert H) e de embriões ao dia 7/8 (D7/8)... 65 XII

Criopreservação de sémen ovino: comparação entre dois diluidores Abreviaturas %: percentagem µl: microlitros 2 pro: dois pronúcleos A: fracção A do diluidor Aisen Acro int: acrossoma intacto Atm: atmosferas BL: blastócito BLexp: blastócito expandido BSA: albumina sérica bovina (do inglês bovine serum albumine) Ca 2+ : cálcio Cab: anomalias da cabeça CAP: meio de capacitação in vitro CASA: computer assisted sperm analysis CM oócitos: meio de cultura de oócitos CO 2 : dióxido de carbono COC`s: complexos cúmulos-oócitos (do inglês cumulus-oocyte complexes) CTC: clorotetraciclina D: descongelado D7/8: dia 7/8 DABCO: 1,4 Diazabicyclo [2.2.2] octan Desc: descondensação da cabeça do espermatozóide Dif: diferença entre o sémen descongelado e o sémen fresco DRA: Departamento de Reprodução AnimalDMSO: dimetil sufoxido EDTA: ácido etileno-diamino-tetracético EGF: epidermal growth factor End +: endosmose positiva EZN: Estação Zootécnica Nacional F: fresco FCS: soro fetal bovino (do inglês fetal calf serum) FIV: fertilização in vitro HOST: teste de endosmose (do inglês hipoosmotic swelling test) IA: inseminação artificial IVP: produção in vitro (do inglês in vitro production) XIII

Susana Valente JBL: jovem blastócito Mat ñ fert: oócito maturado não fertilizado MI: mobilidade individual ml: mililitros MM: mobilidade massal N 2 : azoto Norm: espermatozóides normais NS: não significativo O 2 : oxigénio ºC: graus centigrados p.e.: por exemplo PBS: solução fosfatada salina (do inglês Phosphate Buffered Saline) PI: peça intermédia Polis: polispérmico ROS: espécies reactivas de oxigénio (do inglês reactive oxygene species) Rpm: rotações por minuto S: soro SD: sémen descongelado SE1: carneiro nº1 de raça Serra da Estrela SE4: carneiro nº4 de raça Serra da Estrela Sémen Aisen: sémen diluido com o diluidor Aisen Sémen EZN: sémen diluido com o diluidor EZN SF: sémen fresco SOC: soro de ovelha em cio SOF: fluido sintético do oviducto Spz: espermatozóide SW: swim-up VI: espermatozóides vivos Vosm: variação de osmolaridade W 1 : meio para recolha e selecção de oócitos primários W 2 : meio para selecção de oócitos ovinos primários ZP: zona pelúcida XIV

Criopreservação de sémen ovino: comparação entre dois diluidores 1. Introdução Desde o início do século XX, a criopreservação de sémen tem sido amplamente utilizada para a produção animal de interesse zootécnico tal como para a conservação de espécies em perigo (Pesch e Bergmann, 2006). A raça ovina Serra da Estrela, uma das principais raças leiteiras nacionais, é explorada pela transformação do leite em queijo na região da Serra da Estrela. O uso de programas de inseminação artificial (IA) que melhorem a fertilidade podem contribuir consideravelmente para promover e rentabilizar esta raça autóctone de grande impacto sócio-económico nesta região. A difusão da IA na espécie ovina e a realização do seu total potencial depende do uso de sémen congelado e assim das técnicas disponíveis para a obtenção de uma fertilidade aceitável (Papadopoulos et al., 2005). Em ovinos, a taxa de fertilidade após inseminação cervical com sémen congelado/descongelado é geralmente baixa (8-30%) (Aisen, 2001). Dentro da problemática da IA ovina com sémen congelado encontra-se o facto do sémen de carneiro não possuir uma capacidade antioxidante adequada (diferença em relação a outras espécies) (Aisen et al., 2000) e também diferenças na composição da membrana do espermatozóide, nomeadamente nos lípidos (Bucak et al., 2007), dificultando o sucesso da sua criopreservação. Associada encontra-se a complexa e particular anatomia do cérvix nesta espécie (Holt, 2000). A sua abertura e anéis restringem a penetração do pistolet de inseminação o que limita a realização de inseminações intra-uterinas por via cervico-vaginal (menos invasivas que as intrauterinas realizadas por laparoscopia) (Halbert et al., 1990; Watson, 2000). 1.1. Inseminação Artificial A IA foi a primeira grande biotecnologia aplicada para promover a reprodução e a genética nos animais domésticos (Foote, 2002). Esta consiste num método de reprodução onde se obtém o sémen de um macho para posteriormente ser introduzido no aparelho genital da fêmea, por meio de instrumentos especiais. Neste tipo de sistema não existe contacto directo entre macho e fêmea (Evans e Maxwell, 1990). Nenhuma outra técnica foi tão bem aceite, sendo utilizada mundialmente há mais de meio século. No final do século XX, o avanço no seu desenvolvimento deveuse à descoberta de métodos de colheita de sémen e, posteriormente, com o 1

Susana Valente desenvolvimento de diluidores apropriados de sémen (King, 1993). Em bovinos, a IA obteve uma expansão excepcional com a produção leiteira. Nos pequenos ruminantes tal não aconteceu, principalmente porque os custos para implementar um programa de IA ultrapassavam os benefícios económicos e os resultados obtidos com sémen congelado/descongelado terem um sucesso limitado (Evans e Maxwell, 1990). Actualmente, com os sucessivos avanços tecnológicos na área, a IA é uma técnica de baixo custo e de uso massivo, que garante uma fertilidade razoável do ponto de vista produtivo (Aisen, 2001). 1.1.1. Vantagens da inseminação artificial 1.1.1.1. Melhoramento genético e diminuição de efectivo O melhoramento genético é o principal interesse da IA (Papadopoulos et al., 2005). A sua utilização permite avaliar e escolher bons reprodutores por mérito genético em programas de selecção e, posteriormente, disseminá-los geneticamente, aumentando-se a eficiência de cruzamentos planeados utilizando os melhores machos com as melhores fêmeas. Alguns genótipos podem ser intensiva e rapidamente multiplicados (Chemineau e Cagnié, 1991). Desta forma a IA permite a multiplicação de genótipos sem multiplicar o número de reprodutores no rebanho ou mesmo eliminando-os, reduzindo os custos com a sua manutenção (Evans e Maxwell, 1990). A IA permite também o crossbreeding, de forma a mudar o tipo de produção, como mudar de produção leiteira para carne (Hafez, 1993). 1.1.1.2. Aumento da eficácia reprodutora A IA permite a reprodução mesmo quando os machos não estão disponíveis para a cobrição natural. Fora da época de reprodução, a libido e a qualidade do sémen tende a ser baixa. Nos centros de inseminação, os machos são sujeitos a um fotoperíodo artificial produzindo sémen de boa qualidade mesmo fora da época de reprodução (Evans e Maxwell, 1990). Através desta técnica, o sémen de machos de elevado potencial genético com traumatismos ou idade avançada pode ser utilizado (Hafez, 1993). Em comparação com a cobrição natural, a IA permite um aumento no número de crias por reprodutor e uma dissociação temporal e espacial (no caso do sémen 2

Criopreservação de sémen ovino: comparação entre dois diluidores criopreservado) entre a colheita e a utilização do sémen. A descendência de cada macho é espalhada por vários rebanhos e o seu sémen pode ser utilizado muitos anos depois da sua colheita ou mesmo após a sua morte, preservando-se deste modo linhas seleccionadas e assegurando o controlo da paternidade (Bailey et al., 2000). 1.1.1.3. Facilidade de transporte do material genético, prevenção e controlo de doenças Do ponto de vista económico e sanitário, a importação de sémen de um determinado reprodutor é mais viável do que o animal em si. Desta forma, a IA contribui para o desenvolvimento de um comércio internacional de sémen, especialmente de sémen congelado, através de bancos de sémen, onde o material genético de reprodutores valiosos é conservado (Bucak et al., 2007). Esta técnica reprodutiva evita a transmissão de doenças, uma vez que os machos utilizados para a inseminação são mantidos em programas de controlo sanitário e não circulam de um rebanho para outro (Evans e Maxwell, 1990; Bailey et al., 2000). 1.1.1.4. Uso de outras tecnologias A aceitação mundial da IA proporcionou o ímpeto para o desenvolvimento de outras tecnologias, tais como: bioquímica inerente à composição dos diluidores de sémen, criopreservação e sexagem dos espermatozóides; sincronização de cios; colheita, congelação, cultura, transferência ou clonagem de embriões (Bailey et al., 2000; Foote, 2002). Através destas tecnologias é possível também recuperar espécies em vias de extinção (Pérez-Garnelo et al., 2006). 1.1.2. Desvantagens da inseminação artificial Apesar desta técnica ser claramente uma ferramenta poderosa para a detecção e gestão de características genéticas, a sua eficácia é contrabalançada com o elevado poder de difusão de um macho, o que por sua vez pode diminuir a variabilidade genética (risco mais comum), aumentar a taxa de inbreeding, bem como a disseminação de 3

Susana Valente características hereditárias negativas ou doenças desconhecidas daquele reprodutor (Evans e Maxwell, 1990). A IA depende de outras técnicas como a sincronização de cios e o processamento do sémen (que necessita de equipamento e de mão-de-obra especializada), o que encarece o seu uso. Associado a este factor está também a fertilidade inferior à obtida aquando da cobrição natural, devido à má execução da técnica ou baixa propensão do animal para a IA (Chemineau e Cognié, 1991). 1.2. Sémen O sémen é uma suspensão celular semi-gelatinosa que contem os gâmetas masculinos e o meio líquido em que estes se encontram suspensos, o plasma seminal (Hafez, 1993). Tabela 1.1: Composição do sémen de algumas espécies domésticas (mg/100 ml excepto quando indicada outra unidade). Touro Carneiro Varrasco Garanhão Sémen Volume (ml) 5-8 0,8-1,2 150-200 60-100 Concentração espermatozóides (10 9 /ml) 0,8-2 2-3 0,2-0,3 0,15-0,3 ph 6,4-7,8 5,9-7,3 7,3-7,8 7,2-7,8 Plasma seminal Frutose 460-600 250 9 2 Sorbitol 10-140 26-170 6-18 20-60 Ácido citrico 620-806 110-260 173 8-53 Inositol 25-46 7-14 380-630 20-47 Glicerofosforilcolina 100-500 1100-2100 110-240 40-100 Ergotioneína 0 0 17 40-100 Sódio 225 178 587 257 Potássio 155 89 197 103 Cálcio 40 6 6 26 Magnésio 8 6 5-14 9 Cloreto 174-320 86 260-430 448 Proteína (g/100 ml) 6,8 5 3,7 1 (Adaptado de Hafez, 1993) 1.2.1. Plasma seminal O plasma seminal é composto por uma mistura de secreções produzidas pelas glândulas vesiculares, epidídimo, ducto deferente e outras glândulas sexuais acessórias (Junqueira e Carneiro, 2004). 4

Criopreservação de sémen ovino: comparação entre dois diluidores A contribuição das diferentes glândulas varia largamente não só entre espécies, mas também entre indivíduos da mesma espécie e, dependendo da ocasião, entre ejaculados do mesmo indivíduo (King, 1993). Independentemente de variações individuais existem outros factores como a idade, as condições climáticas, o estado nutricional e a frequência de ejaculação que afectam, notavelmente, a quantidade e a qualidade do sémen (Evans e Maxwell, 1990). O plasma seminal é normalmente um líquido isotónico, com um ph perto da neutralidade, sendo o seu principal componente a água (Alberts et al., 2002). Este possui três funções principais (Evans e Maxwell, 1990): - veículo de transporte dos espermatozóides do sistema reprodutor do macho para o da fêmea, durante a ejaculação; - activador dos espermatozóides, previamente imóveis; e - proporciona a sobrevivência dos espermatozóides por ser um meio tamponado e rico em nutrientes. 1.2.2. Espermatozóides Os espermatozóides férteis resultam de uma série de complexas modificações morfológicas e de superfície (Gatti et al., 2004) (figura 1.1). A maioria das alterações morfológicas decorre durante a espermatogénese. 1.2.2.1. Espermatogénese Os gâmetas masculinos são formados dentro dos tubos seminíferos, nos testículos, por um processo denominado espermatogénese. Em todos os embriões de vertebrados, algumas células são escolhidas no início do desenvolvimento como precursoras dos gâmetas. Estas células germinais primordiais (espermatogónias) migram da base da alantoíde até à gónada em desenvolvimento (King, 1993; Alberts et al., 2002). Atingida a puberdade e após um período de proliferação mitótica, as espermatogónias dão origem a espermatogónias de tipo A. Estas podem manter-se indiferenciadas funcionando como células mãe ou continuar a divisão mitótica e, por diferenciação, originar as espermatogónias de tipo B e, posteriormente, os espermatócitos primários (Aberts et al., 2002; Junqueira e Carneiro, 2004). 5

Susana Valente Por divisão meiótica, os espermatócitos primários (2n) passam a espermatócitos secundários (n), e estes a espermatídios (n) (Aberts et al., 2002; Junqueira e Carneiro, 2004). Figura 1.1: Esquema ilustrativo dos processos de formação do espermatozóide (Adaptado de www.profmarcosbio.hpg.ig.com.br/gameto.htm). 1.2.2.2. Espermiogénese A espermiogénese é o processo pelo qual os espermatídios se diferenciam em espermatozóides. A espantosa evolução de uma célula redonda sem núcleo distinto para um espermatozóide altamente organizado deve-se ao alongamento e achatamento do núcleo condensado, dando forma à cabeça do espermatozóide; à eliminação de grande parte do citoplasma; à organização da superfície da célula em domínios específicos, constituídos por grupos distintos de lípidos e proteínas, desprovidos de mobilidade; e à reorganização dos organelos citoplasmáticos: fusão das vesículas do complexo de Golgi para a formação do acrossoma, reorganização dos centríolos para formação do flagelo e repartição das mitocôndrias em torno da base da cauda (Junqueira e Carneiro, 2004; Gatti et al., 2004). 6