UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS CDTec GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA DISCIPLINA DE MICROBIOLOGIA MICROBIANA I CONTROLE DO CRESCIMENTO MICROBIANO MÉTODOS FÍSICOS E QUÍMICOS Caroline De Paula Lopes
O controle dos microrganismos iniciou-se há cerca de 100 anos: Estudo de Pasteur; Joseph Lister:
Industrial Laboratorial Hospitalar... A escolha do método depende do objetivo, do tipo de material e do nível de controle que se deseja obter.
Controle de microrganismos = Redução da carga microbiana Microbiologia MORTE Perda da capacidade reprodutiva
Parede Celular Membrana Citoplasmática Enzimas e Proteínas DNA e RNA
Esterilização? Germicida? Você sabe o que é... Limpeza? Sanitização? Desinfecção? Assepsia? Bacteriostase?
ESTERILIZAÇÃO: Processo que visa a destruição total de todas as formas de vida de um material ou ambiente, através de métodos físicos ou químicos.
DESINFECÇÃO: eliminação parcial dos microrganismos, mata as formas vegetativas, mas não necessariamente as esporuladas de microorganismos patogênicos presentes num material inanimado. Métodos: substâncias químicas (desinfetantes), radiação UV, água fervente ou vapor.
SANITIZAÇÃO: Utiliza um agente, normalmente químico, em utensílios e equipamentos, que reduz a população microbiana até níveis compatíveis com às exigências da saúde pública ASSEPSIA: Procedimentos que visam evitar o retorno da contaminação a um objeto, superfície ou local. ANTI-SEPSSIA: Desinfecção de tecidos vivos, como pele e mucosas. LIMPEZA: Remoção de sujidades que indispensavelmente antecede os procedimentos de desinfecção ou esterilização.
BACTERIOSTASE: inibição do crescimento, pela inibição da síntese protéica, entretanto a bactéria não está morta. BACTERICIDA: MORTE CELULAR BACTERIOLÍTICO: morte celular por lise Inibição da síntese de parede celular
Tamanho da população; Intensidade ou concentração do agente microbiocida; Tempo de exposição ao agente; Temperatura; Natureza do material contendo os microrganismos; Características dos microrganismos; Condições ambientais (ph, concentração de carboidratos, presença de matéria orgânica).
PARA OBTER MAIOR EFICIÊNCIA DO CONTROLE MICROBIANO, DEVE-SE LEVAR EM CONSIDERAÇÃO ALGUNS PRINCÍPIOS BÁSICOS, OS MESMOS DEVEM SER APLICÁVEIS A TODOS OS MÉTODOS.
1- Avaliar susceptibilidade das espécies para esse agente 2- O contato do agente com o microrganismo deve ser facilitado 3- O tempo de exposição adequado, entre o agente escolhido e o microrganismo para permitir a ação necessária.
Tempo de redução decimal =VALOR D
1 Físicos: - Calor (úmido, seco, pasteurização) - Filtração; - Baixas temperaturas; - Alta pressão; - Dessecação - Pressão osmótica - Radiação 2 Químicos: Desinfetantes e/ou anti-sépticos: - halogênios (cloro, iodo) - álcoois (etanol 70%, isopropanol) - fenóis e bifenóis (o-fenilfenol, tricosan) - biguanidas (clorexidina) - agentes tensoativos (sabões e detergentes) - Quaternários de amônio - Metais (Ag, Hg, Cu) - Conservantes de alimentos - Antibióticos (nisina) - Esterilizantes gasosos (oxirano) - Aldeídos (glutaraldeído)
CONTROLE FÍSICO
Calor (úmido, seco, pasteurização) - Mecanismos de ação: desnaturação das proteínas (enzimas)
Métodos físicos de controle Microbiano - Fervura: destrói formas vegetativas de bactérias patogênicas, fungos e grandes partes de vírus em 10 minutos( vírus hepatite e endosporos resistem por mais tempo) - Autoclave: maior temperatura devido a pressão (esterilização efetiva)
Métodos físicos de controle Microbiano
Métodos físicos de controle Microbiano Pasteurização: - Objetivo: eliminar microrganismos patogênicos, prolongar a qualidade, utilizado em alimentos perecíveis (leite, iogurte, sorvete, cerveja) - Tempo de pasteurização difere: viscosidade, teor de gorduras...
Métodos físicos de controle Microbiano Pasteurização: Lenta (62-65ºC 30 minutos) Rápida (72-75ºC/15 a 20 segundos) UHT (135-145ºC/2 a 5 segundos) Saída dos tubos Entrada da câmara septos Saída da câmara Entrada dos tubos
Métodos físicos de controle Microbiano
Métodos físicos de controle Microbiano Aplicado principalmente a instrumentos e materiais sólidos (por exemplo vidraria) Requer uma temperatura e um tempo maior (170-180 C/algumas horas) Obtido em fornos de esterilização (Forno de Pasteur)
Métodos físicos de controle Microbiano Testes utilizados para monitorar e validar processos, garantindo a segurança do métodos, podem ser; Químicos fitas termossensíveis Biológicos-consiste numa população padronizada de microrganismos viáveis (usualmente esporulados) conhecidos como resistentes ao modo de esterilização a ser monitorizado.
Controle do processo de esterilização em autoclave Recipiente de plástico flexível Ampola quebrável (de vidro) com meio de cultura estéril Papel de filtro com esporos
Métodos físicos de controle Microbiano Cor inalterada ph inalterado Esporos mortos Não há germinação Funcionamento da autoclave normal Cor alterada ph alterado Esporos vivos Há germinação Funcionamento da autoclave comprometido
Métodos físicos de controle Microbiano Mecanismo de ação: remoção mecânica Soluções sensíveis ao calor, ar; Filtros de membrana: ésteres de celulose, polímeros plásticos 0,22μm e 0,45μm para bactérias. Bactéria retida num filtro tipo Isopore
Métodos físicos de controle Microbiano
Métodos físicos de controle Microbiano Capelas de fluxo laminar Filtros de ar de alta eficiencia (90%) Membranas de acetato de celulose
Métodos físicos de controle Microbiano Mecanismo de ação: interrupção do metabolismo bacteriano. Liofilização: água sublimada do interior da célula. Os MO permanecem viáveis, porem latentes com a ausência de água.
Métodos físicos de controle Microbiano Refrigeração comum: bacteriostático 0-7ºC; (exceção bactérias psicrotróficas) Congelamento -20ºC; Lento: bactérias em estado latente Rápido: mais letal, ciclos de congelamento e descongelamento são utilizados Nitrogênio líquido -179ºC.
Métodos físicos de controle Microbiano Comprimento de onda Intensidade Distância da fonte Duração
Métodos físicos de controle Microbiano Ionizantes: Raios gama, raios X e feixes de elétrons de alta energia. Mecanismo de ação: os raios ionizam a água, formando radicais hidroxila altamente reativos.
Métodos físicos de controle Microbiano Não-ionizantes: radiação não muito penetrante: UV (260nm) Mecanismo de ação: alteram o DNA pela formação de dímeros. C A T C A
Métodos físicos de controle Microbiano Fortes e curtos pulsos elétricos; Ação sobre bactérias: ruptura da membrana celular, formação de poros na membrana.
Métodos físicos de controle Microbiano Aumento da concentração de sais ou açúcares; Mecanismo de ação: provoca a saída de água condensando o citoplasma e retraindo a membrana. Ex???????
CONTROLE QUÍMICO
Métodos químicos de controle Microbiano Desinfetantes: Capacidade de penetração na matéria orgânica sem perder sua ação germicida e ausência de ação corrosiva. Anti-sépticos: Não ser irritante, não interferir no processo de cicatrização e não ser absorvido pela pele
Métodos químicos de controle Microbiano 1- Possuir alta eficiência germicida, 2- Ser de efeito rápido, ter amplo espectro antimicrobiano e ação prolongada. 3- Apresentar estabilidade química, devendo ser solúvel em água e nos líquidos orgânicos; 4- Ser inodoro ou ter odor agradável; 5- Incolor; 6- Não produzir manchas.
Alvo/Efeito de alguns agentes químicos Parede celular Membrana plasmática Ligação cruzada entre macromoléculas Intercalação de DNA Interação com grupos tióis (sulfidrilas) SH Oxidação
Métodos químicos de controle Microbiano Mecanismo de ação: desnaturação de proteínas e dissolução de lipídios de membranas. Bactericida; Não age sobre endósporos e vírus não envelopados. Álcool etílico: 70% Álcool isopropílico: puro é superior ao etílico.
Mecanismo de ação: liberação de O nascente ; oxida os sistemas enzimáticos Exemplos: Peróxidos: H 2 O 2 3% age sobre organismos anaeróbios; Ácido peracético: efetivo contra bactérias, fungos, endosporos e vírus. Ozônio: empregado na desinfecção de água.
Mecanismo de ação: alquilação dos grupos funcionais das proteínas (aminas, carboxilas, hidroxilas), inativando-as. Aldeído fórmico : solução em água de 3 a 8 % Aldeído glutárico: soluções alcalinas a 2% Formalina: solução aquosa de formol, associada a um sabão ou detergente 40% OBS: Alquilação é a transferência de um grupo alquila de uma molécula para outra.
Mecanismo de ação antimicrobiana do glutaraldeído Alvo Ação Esporos bacterianos Inibe germinação ( concentrações); É esporocida ( concentrações) Micobactérias Provavelmente a parede celular Outras bactérias que não formam esporos Fungo Associação forte com camadas mais externas da parede celular; Ligação ente aminoácidos de proteínas; Inibição de transporte na célula Parede celular Vírus Ligação proteína-dna e mudanças no capsídio
Mecanismo de ação: desnaturam proteínas e rompem membranas plasmáticas lipídicas. Exemplos: fenol; cresol hexaclorofeno;
Fenol: desinfetante fraco, atividade bactericida em [0,2 a 1%] Cresóis: creolina superfícies; Triclosano (bifenol): uso em superfícies; Hexaclorofeno (bifenol): em desuso por causar alterações neurológicas.
anti-sepsia da pele e bucal
IODO Solução alcoólica a 2%, bactericida, fungicida, virucida, [ ] esporocida Mecanismo de ação: presume-se que há a combinação irreversível a proteínas, interação com os aminoácidos aromáticos, fenilalanina e tirosina, inibindo suas funções.
CLORO cloro + água = ácido hipocloroso Cl 2 + H 2 O H + + Cl - + HOCl Mecanismo de ação do 2HOCl: oxida grupos SH e NH 2 de enzimas bacterianas, inibindo-as.
CLORO Hipoclorito de sódio; Dióxido de cloro; Cloraminas (cloro + amônia);
Agentes de superfície Mecanismo de ação: alteram a permeabilidade da membrana, inibem enzimas, desnaturação de proteínas; Ativas contra G+ e pouco menos ativas contra G- EXEMPLOS: Cloreto de benzalcônio Cloreto de cetilpiridínio Cepacol
Mecanismo de ação: desnaturação de proteínas combinam-se com proteínas, geralmente nos grupos SH (sulfidrilas); ação bacteriostática; Mercurocromo e mertiolate
Mecanismo de ação: alquilação direta dos grupos carboxilas, hidroxilas e sulfidrilas, inativando certas enzimas; Óxido de etileno: atua pela interação com proteínas, alta capacidade de penetração, é explosivo; Betapropiolactona: baixa capacidade de penetração, carcinogênico. OBS: Alquilação é a transferência de um grupo alquila de uma molécula para outra.
Agente Químico Concentração (%) Aplicações Nível de Atividade Compostos Fenólicos 0.5-3.0 Desinfecção de objeto inanimado Intermediário Álcoois 70-90 Anti-sepsia da pele, desinfecção de instrumentos cirúrgicos Iodo 1 Anti-sepsia da pele, pequenos cortes, desinfecção da água Compostos Clorados 0.5-5.0 Desinfecção da água, superfícies não metálicas, equipamentos de laticínios, materiais domésticos Intermediário Intermediário Baixo Mercúrio 1 Anti-sepsia da pele, desinfecção de instrumentos Baixo Alta Mata todas as formas de vida microbiana Intermediário Mata o bacilo da Tuberculose, Fungos e vírus, mas não os esporos Baixo Não mata o bacilo da tuberculose, nem os esporos e vírus em um tempo aceitável
Fatores importantes associados ao uso de agentes químicos Potência Espectro de ação
Determinação do Coeficiente fenólico 1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 Fenol Substância a ser testada 2 Banho maria (20 C/5 min)
Determinação do Coeficiente fenólico 3 Acrescentar 0,5 ml de cultura padrão Salmonella typhi Staphylococcus aureus Fenol Substância a ser testada 4 Depois de 5, 10 e 15 minutos, semear em placas estéreis 1 amostra de cada diluição
Determinação do Coeficiente fenólico 5 Após 48h, observar as culturas e identificar a maior diluição onde não se observa crescimento (turbidez), após 10 min. Coeficiente fenólico = Diluição da substância, em que há crescimento Diluição do fenol em que há crescimento Exemplo: 1/64 1/8 = 8
Coeficiente fenólico de alguns agentes químicos Agente Staphylococcus aureus Salmonella typhi Fenol Cloramina Cresols Etanol Formalina Água oxigenada Lisol Cloreto de mercúrio Tintura de iodo 1,0 133,0 2,3 6,3 0,3 ------- 5,0 100,0 6,3 1,0 100,0 2,3 6,3 0,7 0,01 3,2 143,0 5,8
Determinando o espectro de ação de um desinfetante Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa
Determinando o espectro de ação de um desinfetante 1 1 1 4 2 4 2 4 2 3 3 3 Staphylococcus aureus Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa = Disco impregnado com desinfetante Incubar
Determinando o espectro de ação de um desinfetante
Ácidos orgânicos: acético, láctico, sórbico... ph ácido inibe o crescimento microbiano Nitritos e Nitratos Formam ác. nitroso e óxido nítrico que são substâncias oxidantes Gás Sulfeto, metabissulfito e SO 2 Redução das pontes dissulfeto em proteínas Adição de sal e açúcar
VERMELHO, A.L., PEREIRA, A.F., COELHO, R.R.R., SOUTO-PADRÓN, T. Práticas de Microbiologia,Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 2006. FRANCO, B.G.M.F; LANDGRAF, M. Microbiologia dos alimentos. Atheneu, São Paulo, 2005. TORTORA, G. J.;FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia, Artmed, Porto Alegre, 2005.