Construção de Bibliotecas de cdna Claudia Teixeira Guimarães Antônio A.C. Purcino Eliane A. Gomes Jurandir V. Magalhães Newton P. Carneiro Elto E.G. Gama Robert E. Schaffert Sidney N. Parentoni Vera M.C. Alves
Biblioteca de cdna É um arranjo de cópias de DNA que representa uma população de mrnas. Objetivo é gerar ESTs (Expressed Sequence Tags) que amostrem os genes expressos (induzidos ou reprimidos) sob uma determinada condição (tecido, célula ou estresse). Pré-requisitos: a condição, tecido e genótipo permitam que os genes de interesse sejam expressos; a biblioteca possua qualidade e quantidade de clones suficiente para amostrar os mrnas, incluindo aqueles com reduzido número de cópias, que são normalmente aqueles de maior interesse.
Definição do Material Genético e das Condições É de fundamental importância garantir que os genes de interesse sejam expressos sob uma determinada condição. Para isso, é necessário: Genótipos caracterizados; Fenótipo confiável indicador da característica em estudo; Estudos fisiológicos para de determinar quando e em qual tecido os genes de interesse são expressos; Condições de estresse para o aparecimento do fenótipo e para a expressão dos genes; Coleta e armazenamento adequados do material vegetal.
Material Genético Linhagens contrastantes F 1 F 1 F 2 RC 1... Linhagens isogênicas F 2:3 F 7... RC 4 96,875%
Genótipos Caracterizados Colonização micorrízica P-efficient P-inefficient P-efficient P-inefficient c/ colonização Al tolerant Al sensitive Al sensitive Al tolerant s/ colonização
Caracterização Fisiológica
Caracterização em Campo Melhoramento Genético Genética Molecular Eficiência na utilização de N Clonagem de Genes Tolerância ao Al tóxico Tolerância a Seca
Biblioteca de cdna A representatividade da biblioteca de cdna está em função da sua qualidade, que por sua vez depende da integridade do RNA original e dos cuidados na construção da biblioteca. A qualidade da biblioteca pode ser avaliada pela: quantidade de clones: número suficiente para amostrar o máximo de mrnas possível, incluindo os de baixo número de cópias; tamanho dos insertos: favoreça a clonagem de cdnas completos, evitando fragmentos espúrios
Tipos de Biblioteca de cdna Típica: obter o perfil dos genes de um organismos, transcriptoma direcional: orientação da polaridade transcricional do mrna original ao acaso: insertos clonados em qualquer orientação Subtrativa seguida por PCR: identificar genes diferencialmente expressos biblioteca enriquecida com fragmentos de mrna raros e diferencialmente expressos
Etapas para a Construção da Biblioteca de cdna Isolamento do RNA mensageiro Síntese do cdna Clonagem dos fragmentos Estocagem dos clones Sequenciamento Análise: Bioinformática
Isolamento do RNA mensageiro Qualidade do mrna é primordial para se garantir a qualidade da biblioteca, obtendo o máximo de informações que serão convertidas em cdna Extração pode ser do RNA total ou do mrna RNA total = rrna, trna e mrna (0,5 a 2%) A maioria do mrna é poli-adenilado (poli-a) e sua purificação pode ser realizada em coluna de afinidade com oligo dt Cuidado para evitar contaminação com RNase De 1 a 5 ug de mrna são suficientes para construção de biblioteca com 10 5 a 10 6 clones
Primeira fita Segunda fita Síntese do cdna Depende da hibridização do primer (polit) com o mrna Para clonagem direcional o primer deve ter um adaptador com um ou mais sítios de restrição Transcriptase reversa (RT) deve ser eficiente para favorecer a síntese de cdnas completos e sem atividade RNase H Substituição da fita do mrna por DNA usando nick translation Combinação da DNA polimerase I, RNase H e DNA ligase Para clonagem direcional um segundo adaptador com sítios de restrição deve ser adicionado
Síntese de cdna via SuperScript (Invitrogen) Primer polit contendo sítio de restrição Síntese da primeira e segunda fita em um único tubo Ligação de um adaptador com sítio para Sal I Digestão com Not I Fragmentos prontos para a clonagem direcional
Clonagem dos Fragmentos No caso da clonagem direcional, os cdnas devem ser digeridos como mostrado anterior, e fracionados O fracionamento dos clones é importante para eliminar o excesso de adaptadores que são adicionados em excesso e para reduzir a clonagem de fragmentos de cdnas pequenos e degradados Ligação dos fragmentos de cdna e transformação usando vetores e células competentes de qualidade 10 a 20 ng de cdna x 50 ng de vetor 5 x 10 5 clones (protocolo do fabricante) Tecnologia Gateway, usa a recombinação sítio específica flanqueando os sítios de clonagem
Genoma Funcional Bibliotecas de cdnas RNA mensageiro = genes expressos 5 AAAAA 3 5 3 5 AAAAA 3 TTTTT 5 TTTTT 5 TTTTT 5 TTTTT 5 1 a fita de cdna 5 3 CONTIG ~ GENE
GENES EXPRESSOS: bibliotecas de cdnas Diferentes tecidos Diferentes genótipos Diferentes condições Diferentes estágios de desenvolvimento ESTs: Alinhamento, Clusterização, Anotação Northern Eletrônico, Display Differencial Digital, SNPs, UniGenes
Banco de ESTs: dbest Total 31.307.034 humanos 7.057.754 camundongo 4.688.047 bovino 702.645 milho 656.945 trigo 600.039 Arabidopsis 420.789 arroz 406.651 soja 355.978 cana 246.301 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbest/ 11 nov, 2005 UniGenes: conjuntode clusters orientados e não redundantes que representam um gene único http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unigene
Biblioteca Subtrativa seguida por PCR Objetivo é enriquecer a biblioteca de transcrito raros e diferencialmente expressos entre duas situações Síntese de cdnas a partir de duas populações de mrna diferentes (genótipos ou condições contrastantes), que são extraídos separadamente, e denominados tester e driver Tester é o tratamento: genótipo tolerante ou condição de estresse Driver é o controle: genótipo sensível ou sem estresse Quantidade inicial de mrna pode ser de 500 ng cdnas são digeridos, separadamente com a enzima Rsa I, de corte abrupto, e ligado dois adaptadores diferentes cdna Tester: dividido em porções iquais cdna Driver, sem adaptador e em excesso com adaptador 1R com adaptador 2R
Biblioteca Subtrativa seguida por PCR Hibridização Subtrativa cdna Tester com adaptador 1R cdna Driver (em excesso) cdna Tester com adaptador 2R a: transcritos raros b: transcritos abundantes c: transcritos comuns nas duas condições d: transcritos do controle em excesso a b c d 1 a hibridização a, b, c, d + e 2 a hibridização Com adição de Driver desnaturado e end filling
Biblioteca Subtrativa seguida por PCR Ciclos de PCR a e d: sem amplificação por não ter sítio de anelamento do primer c: amplificação linear b: formação de alça estável e: amplificação exponencial a b c d e 1 a PCR: adição do primer externo 5 3 3 5 2 a PCR: adição dos primers internos 5 3 3 5
Clonagem dos Fragmentos Clonagem utilizando os kits disponíveis para fragmentos de PCR blunt-end, como TA Topo (Invitrogen), pgem-t (Promega) Não é clonagem direcional Normalmente são fragmentos pequenos, na faixa de 500 pares de base 1kB Controle 2 a PCR Fragmentos blunt-end com A nas extremidades deixados pela Taq-polimerase após a reação de PCR + 1018 506 200 A A
Obtenção dos cdnas Tester e Driver RNA Total Peso Molecular Controle: Driver Tratamento:Tester Peso Molecular mrna Controle: Driver Tratamento:Tester cdna Driver cdna Driver digerido cdna Tester cdna Tester digerido Síntese do cdna Purificação poly-a Digestão com Rsa I
Fragmentos de cdna após as Hibridizações Subtrativas e as Reações de PCR 1kB ladder Controle 1 a PCR Control 2 a PCR Clonagem dos fragmentos em 1018 506 200 Vetores específicos
Clonagem dos Fragmentos de cdna Transformação em E. coli e seleção com X-gal/IPTG Eletroporação: estratégia que usa pulsos elétricos para alterar a estabilidade da membrana Mini-preps e digestão com EcoR I para identificação dos clones com insertos
Armazenamento dos Clones Organização para garantir a conservação e o uso posterior dos clones Sequenciamento e Análise Detalhamento na palestra do Felipe Rodrigues da Silva