Mesa Redonda: Bioinformática e marcadores moleculares para prospecção de bioprodutos

Ferramentas moleculares para o estudo da biodiversidade microbiana Marcia Reed R. Coelho Embrapa Agrobiologia

Ferramentas moleculares para o estudo da biodiversidade microbiana Tópicos abordados:» Exploração da biodiversidade microbiana» Métodos moleculares e Metagenômica» Exemplos práticos do uso das ferramentas de bioinformática: Estudos de diversidade Preservação e Prospecção de Recursos Microbianos

Diversidade Microbiana Micro-organismos:» São os organismos mais numerosos e antigos da biosfera, capazes de colonizar com sucesso todos os nichos ecológico possível do planeta» Sua presença e atividade são essenciais para o funcionamento e equilíbrio dos ecossistemas.» Representam uma importante fonte de recursos genéticos para o avanço biotecnológico e para o desenvolvimento econômico sustentável. http://www.google.com

Diversidade Microbiana Tradicionalmente, compostos com atividade biológica têm sido acessados por métodos envolvendo isolamento e cultivo dos organismos a partir das amostras ambientais, principalmente solo. Estas estratégias tradicionais de isolamento e seleção de microorganismos têm garantido o desenvolvimento de novos fármacos e aplicações nas áreas de saúde, agricultura, indústria e meio ambiente.» Área médica: antibióticos, drogas anti-carcinogênicas, anti-fúngicos, probióticos.» Área industrial: enzimas para aplicações industriais e tecnológicas.» Área agrícula: controle de patógenos, promotores de crescimento e FBN

Diversidade de micro-organismos cultivados» Coleta de material biológico» Isolamento» Pré-seleção e triagem de materiais,» Seleção final do(s) melhor(es) candidato(s)» Desenvolvimento de um produto comercial ou processo industrial Fotos Raphael Conti

Isolamento de bactérias de interesse agrícola Imagens: www.google.com

Limitação: meios de cultura são seletivos em maior ou menor grau para os diversos grupos de micro-organismos e, na maioria das vezes, incapazes de reproduzir as condições encontradas no ambiente. Ex: Consórcios, simbiontes, extremófilos» Cultiváveis X Não Cultiváveis Apenas 1 a 10% dos microrganismos são cultiváveis! http://www.google.com

Diversidade Microbiana Molecular A evolução das metodologias com base em biologia molecular e bioinformática aplicadas ao estudo do meio ambiente tem contribuído significativamente para um grande avanço do conhecimento sobre a diversidade microbiana» Análise de micro-organismos sem a necessidade de isolamento e cultivo, através da lise de células microbianas diretamente na matriz do solo, extração dos ácidos nucléicos a partir desta matriz e clonagem direta de DNA de amostras ambientais (metagenoma).» Prospecção in silico de informações a partir de dados genéticos em bases de dados

O que é metagenômica?» Meta = transcendente» Genômica = estudo de genomas, isto é, do conjunto de genes de um organismo, o que envolve o sequenciamento, o mapeamento e a análise desses genes.» O foco da genômica é no INDIVIDUO. Contudo, visto que um indivíduo não representa a diversidade genética de uma dada espécie, é necessário se realizar o estudo de indivíduos com diferentes fenótipose de diferentes procedências.» A genômica se restringe na maioria dos casos a organismos CULTIVADOS.» Transcende o estudo de genomas individuais, para estudar os genomas no nível da população e da comunidade;» Para que isso seja alcançado, a etapa de cultivo precisa ser dispensada, visto que 1 a 10% dos micro-oganismos podem ser cultivados atualmente.

» Estudo de comunidades microbianas com ajuda da biologia molecular Imagens: www.google.com

Dogma central da Biologia Molecular http://www.google.com

Amostras / Extração direta de DNA http://www.google.com

PCR Polymerase chain reaction Uma molécula de DNA é usada para produzir duas cópias, que produzem 4, 8 e assim sucessivamente... Até que essa quantidade possa ser detectada e usada para estudo Google imagens

Clonagem gene direcionada» Obtenção do DNA PCR» Genes ribossomais (rrs), rpob, nifh» Ligação destes fragmentos de DNA ao vetor de clonagem» Introdução da molécula recombinante em uma célula hospedeira por eletroporação» Detecção dos clones contendo as moléculas de DNA recombinante e/ou os produtos dos genes no novo hospedeiro» KITS Google imagens

Gene que codifica a molécula de rrna 16S para saber quem é quem Google imagens

Genes que codificam funções para saber quem faz o que FIXAÇÃO BIOLÓGICA DO NITROGÊNIO FBN O nitrogênio (N 2 ) constitui aprox. 80% da nossa atmosfera N N NITROGENASE NH 3 Diversas espécies de bactérias que possuem a informação genética para produzir a enzima nitrogenase (genes nif) são capazes de fixar o nitrogênio atmosférico.

Clonagem gene direcionada Biblioteca de clones ambientais

Sequenciamento Google imagens Sequenciamento Sanger» 6 meses para sequenciar o genoma de um fungo» Reads de até 1100 pb» Depende de clonagem (genes conhecidos) Sequenciamento de ultima geração» 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo» Reads de até 250 pb» Não há clonagem

Clonagem de DNA diretamente do ambiente» Clonagem em BAC (Bacterial Artificial Chromosome), para clonagem de fragmentos grandes de DNA (20 a 300 kb) a partir de amostras ambientais, e análise das complexas bibliotecas metagenômicas resultantes em busca por novas atividades biológicas.» Os vetores podem manter estáveis, insertos de DNA excedendo 300.000 pares de bases e permitir a expressão de genes procarióticos em um hospedeiro bacteriano heterólogo» Indica capacidades fisiológicas da comunidade microbiana presente» Rendimento final ilustra a mistura de genes presentes, muitos dos quais não seriam detectados por PCR» Descreve o conteúdo genômico de ecossistemas inteiros

Estratégia de Cultivo X Metagenômica» Obtenção/expressão de novos compostos com atividade biológica de interesse. Lorenz et al

Clonagem direta

Projeto de pesquisa Fixação biológica do nitrogênio em pastagens: ecologia e diversidade molecular de bactérias diazotróficas visando a seleção de inoculantes Google imagens Objetivos:» Avaliar a diversidade molecular do gene nifh de bactérias diazotróficas associadas à raiz de braquiária;» Identificar os principais grupos que possam estar contribuindo para a FBN na cultura.

» Conhecendo a diversidade além do que se pode cultivar hoje em dia: METAGENÔMICA» Funcionalidade das bactérias» Estudando um gene que é responsável pela Fixação Biológica do Nitrogênio em procariotos = Gene nifh» Novas bactérias que podem estar auxiliando no crescimento da planta

Metodologia http://www.google.com Extração de DNA dos solos de rizosfera http://www.google.com Amplificação por PCR de seqüencias do gene nifh Vetor + inserto http://www.google.com Biblioteca de clones + seqüenciamento Clonagem dos genes nifh http://www.google.com

Análise das sequencias- Bioinformática» A partir das sequências obtidas: busca das sequencias mais próximas nos bancos de dados GenBank (NCBI): base de dados genéticos (todos os genes). EUA (GenBank), Japão (DDBJ) e Europa (EMBL). RDP (The Ribosomal Database Project): Genes ribossomais

Análise das sequencias- Bioinformática Softwares livres que permitem:» Alinhamento de sequencias: ClustalX, BioEdit, MEGA» Comparação de comunidades: S-Libshuff» Estimativas de riqueza e diversidade (UTO): MOTHUR» Estimar a posição das sequencias obtidas frente à existentes em bancos de dados: construção de árvore filogenética:mega

Resultados» Quatro bibliotecas de quatro locais diferentes;» 284 clones de qualidade obtidos (77,62,64,81);» Visão geral da diversidade das populações de diazotróficos; 80 70 60 50 40 30 20 10 outros Β;Paenibacillaceae Β;Rhodocyclales γ;cromatiales ;Desulfovibrionales α;rhodospirillales Β;burkoderialles α; Rhizobiales 0 Pastagem 4 Pastagem 3 Pastagem 2 Pastagem 1 Avn Bn Mono Cons Distribuição das porcentagens de famílias dos clones do gene nifh obtidos de cada uma das quatro bibliotecas com base na identificação feita pelo BLAST-N (primeiro hit cultivável).

Resultados 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 4 3 2 1 Avn bn monocultivo consorcio

Resultados 35 30 Pastagem 1 25 20 15 10 5 0

Resultados 35 30 25 Pastagem 2 20 15 10 5 0

Resultados 35 30 25 Pastagem 3 20 15 10 5 0

Resultados 45 40 35 30 Pastagem 4 25 20 15 10 5 0 Bradyrhizobium sp. azospirillum brasiliense Bradyrhizobium denitrificans bradyrhizobium japonicum Rhizobium sp Azonexus hydrophilus

Resultados» Quatro bibliotecas;» Visão geral da diversidade das populações de diazotróficos;» Estirpes de Bradyrhizobium prevalecendo (54%)» Azospirillum brasiliense também foi expressivo;» A primeira vez que se identificou sequencias de Bradyrhizobium em braquiária. Google imagens

Conclusão» Sugere-se que os Bradyrhizobium possam ter um papel importante para a cultura de brachiaria;» Importante lançar mão de métodos de cultivo para selecionarmos essas bactérias e testar suas habilidades em melhorar o crescimento da planta

Uso da metagenômica para Prospecção e Preservação de Recursos Microbianos Apesar de o país agregar uma das maiores biodiversidades do planeta, a utilização e transformação de tais ativos naturais na geração de riquezas, especialmente através da promoção das biotecnologias, ainda pode ser considerada modesta frente ao potencial nacional.» Caracterização e preservação dos recursos microbianos» Importância das coleções biológicas/centros de recursos biológicos» conservação da biodiversidade e são responsáveis pela aquisição, caracterização, autenticação, preservação e distribuição de material biológico com conformidade assegurada.

Exemplos» Rondon et al. (2000) - clones BAC com DNA genômico de solo agrícola expressando funções biológicas em E. coli: produção de amilases, lipases e antibacterianos (novas sequencias = inestimável fonte de genes novos.» Gillespie e colaboradores (2002) - expressão e o isolamento de compostos pigmentados com atividade antibiótica de amplo espectro.» MacNeil et al. (2001) - expressão e o isolamento de pequenas moléculas antimicrobianas e com propriedades anti-leucêmicas a partir de bibliotecas de DNA do solo» Piel et al. (2004) - síntese de produtos naturais a partir de micro-organismos de solo vem sendo atualmente utilizados para outros habitats, tais como a microbiota de insetos ou animais marinhos

Exemplo no Brasil» Construção de bibliotecas metagenômicas e a subseqüente exploração da microbiota presente em amostras de lodo de efluentes de refinarias petróleo e em sedimentos impactados com hidrocarbonetos, respectivamente.» Obtenção de clones, ou consórcios destes, que apresentem alta eficiência de degradação de um ou vários compostos aromáticos recalcitrantes e que possam ser utilizados em tratamentos complementares de efluentes de refinarias de petróleo e em processos de biorremediação de áreas contaminadas.

Preservação e Prospecção de Recursos Microbianos no Brasil Apesar de o país agregar uma das maiores biodiversidades do planeta, a utilização e transformação de tais ativos naturais na geração de riquezas, especialmente através da promoção das biotecnologias, ainda pode ser considerada modesta frente ao potencial nacional.» Caracterização e preservação dos recursos microbianos» Importância das coleções biológicas/centros de recursos biológicos» conservação da biodiversidade e são responsáveis pela aquisição, caracterização, autenticação, preservação e distribuição de material biológico com conformidade assegurada.

Coleção de Culturas de Bactérias Diazotróficas e outros Microrganismos Multifuncionais - CCBD Projeto FAPERJ para a modernização da CCBD» Mais de 2500 bactérias e FMA» Banco de DNA e de caracteres fenotípicos» Plataforma Bionumerics (Apllied Maths, Belegica) para armazenamento destes dados

Obrigada pela atenção! marcia.coelho@embrapa.br