Prática 5. ELETROFORESE CAPILAR Determinação de acidez livre em óleos vegetais 1. Introdução A acidez em óleos vegetais é devido à reação de hidrólise de triacilglicerídeos, onde ácidos graxos livres são formados. 1 O teor de ácidos graxos livres é um dos mais importantes parâmetros no controle de qualidade de óleos vegetais, em especial, os azeites de oliva. 2, 3 Os ácidos graxos dividem-se em dois grupos: saturados (não possuem duplas ligações) e insaturados (com uma ou duas ligações duplas em sua estrutura molecular), sendo esses últimos predominantes nos óleos vegetais. 4 Tabela 1. Composição de alguns ácidos graxos em óleos vegetais. Percentual de Ácidos Graxos Gorduras Mirístico Palmítico Esteárico Oleico Linoleico Linolênico azeite de oliva 0 2 7 20 0,5 5 55 83 4 22 < 0,9 óleo de soja 0 1 6 10 2 5 20 30 50 60 2 10 O método oficial para a determinação de acidez em azeites de oliva é a titulação volumétrica alcalina a frio, que consiste na dissolução da amostra em uma mistura de dietil-éter (ou tolueno) e álcool etílico, na proporção de 1:1 v/v, utilizando-se hidróxido de sódio como titulante e fenolftaleína, como indicador. 5 Alternativamente, a técnica de eletroforese capilar tem se mostrado adequada para a quantificação de ácidos graxos majoritários comumente encontrados nos óleos vegetais tais como o palmítico, oleico e linoleico, permitindo que, além de se determinar o teor de acidez, possa-se identificar individualmente cada ácido graxo, o que favorece a identificação de fraudes e o perfil dos ácidos graxos (AG) envolvidos no processo oxidativo de alimentos. 4 2. Objetivos
Familiarização com a técnica de eletroforese capilar; Determinação dos ácidos graxos livres majoritários e da acidez livre em amostras de azeite de oliva extravirgem e comparar com o perfil em óleo de soja, Comparação entre os resultados obtidos por eletroforese capilar e os obtidos com a metodologia oficial (titulação volumétrica). 3. Metodologia As análises serão realizadas em um equipamento de eletroforese capilar modelo Agilent CE 7100 equipado com detector UV/Vis de arranjo de diodos. Para fins de comparação, serão realizadas análises por titulação volumétrica segundo o método oficial das Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. 5 3.1. Materiais e Reagentes Banho-maria, banho de ultrassom e balança analítica; balões volumétricos de 5,0 e 10,0 ml; erlenmeyers de 125 ml; bureta de 50 ml; pipeta de Pasteur; micropipetas e ponteiras; capilar de sílica fundida com revestimento externo de fluoropolímero (TSH); vials para equipamento de eletroforese; padrões de ácido palmítico (C16:0), oleico (C18:1), linoleico (C18:2) e tridecanoico (C13:0); solução tampão NaH2PO4/Na2HPO4 (ph ~ 6,86); dodecilbenzeno sulfonato de sódio (SDBS); polioxietileno lauril éter (Brij L23); acetonitrila (ACN); 1-octanol; etanol; tolueno; hidróxido de sódio 0,1 mol/l (padronizado); hidróxido de sódio 1,0 mol/l; fenolftaleína 1%; água deionizada. 3.2. Procedimento Extração dos ácidos graxos na amostra: Aqueça a 60ºC, em banho-maria, cerca de 50 ml de etanol, controlando a temperatura com um termômetro; Pese 0,75 g de azeite extravirgem (em triplicatas autênticas) e 1,50 g de óleo de soja, em balões volumétricos de 5,0 ml. Adicione o padrão interno (ácido tridecanoico) nos balões para uma concentração final de 0,5 mmol/l; Complete o volume dos balões com o etanol aquecido, agite em vórtex por 1 min e espere esfriar;
Espere a separação de fases se completar ; Transfira uma alíquota da fase etanólica (superior) para os vials de análise. Identificação dos picos de cada analito: Para identificação dos picos durante as análises, prepare 3 vials, cada um contendo 0,01 ml de um dos 3 padrões de ácidos graxos, palmítico, oleico e linoleico, além de 0,5 ml da fase etanólica de qualquer uma das amostras preparadas anteriormente (observar o aumento do pico). Preparo do eletrólito de corrida: A partir das soluções estoques, prepare, em um balão de 10 ml, o eletrólito com a seguinte composição: 15 mmol/l de solução tampão NaH2PO4/Na2HPO4 (ph ~ 6,86); 4,0 mmol/l de SDBS; 8,3 mmol/l de Brij L23; 45% v/v de ACN; 2,1% v/v de 1-octanol; Completar o volume com água deionizada; Deixar em banho de ultrassom por 10 minutos para degaseificação; Transferir o eletrólito para 3 vials. Parâmetros instrumentais: Dimensões do capilar: 48,5 cm de comprimento total (40 cm efetivos até o detector), 75 µm de diâmetro interno e 375 µm de diâmetro externo; Temperatura no cartucho do capilar: 25ºC; Comprimento de onda de detecção: 224 nm (detecção indireta); Injeção da amostra: 12 mbar por 4 s. Voltagem: + 19 kv. Obs.: Antes do primeiro uso, os capilares devem ser condicionados através de flush com NaOH 1,0 mol/l (40 min), água deionizada (15 min) e solução do eletrólito (15 min). Entre as corridas, condicionamento com NaOH 1,0 mol/l (2 min), água deionizada (2
min) e solução de eletrólito (2 min). Para isso, prepare um vial com NaOH 1,0 mol/l e outro com água e mais dois vials vazios que servirão como descarte. Cálculos e resultados: Nos eletroferogramas, integre os picos referentes aos ácidos graxos palmítico, oleico e linoleico e do padrão interno ácido tridecanoico, obtendo as áreas; Tabela 2. Áreas dos analitos Ácido graxo Área réplica 1 Área réplica 2 Área réplica 3 Tridecanoico (C13:0) Palmítico (C16:0) Oleico (C18:1) Linoleico (C18:2) A concentração de cada ácido nos vials pode ser calculada utilizando a equação: onde [AG] é a concentração do ácido graxo e AAG é a área encontrada para o ácido graxo correspondente, [PI] é a concentração do padrão interno e API é a área encontrada para o padrão interno, e Fr é um fator de resposta previamente obtido através de curvas analíticas utilizando as mesmas condições de análise. Os fatores de resposta para cada um dos 3 ácidos podem ser encontrados na referência [2].
Tabela 3. Concentrações dos analitos Ácido graxo Fator de resposta (Fr) [AG] mol/l réplica 1 [AG] mol/l réplica 2 [AG] mol/l réplica 3 Palmítico (C16:0) 0,622 Oleico (C18:1) 0,526 Linoleico (C18:1) 0,604 A acidez deve ser expressa em porcentagem (% m/m) de ácido oleico, levando-se em consideração a massa pesada e a diluição feita no preparo da amostra. Titulação volumétrica (apenas para o azeite extravirgem) Pese 1,75 g de azeite extravirgem em um erlenmeyer de 125 ml (em triplicata); Adicione 25 ml de uma mistura etanol/tolueno 1:1 v/v ao erlenmeyer; Adicione também o indicador fenolftaleína (2 a 3 gotas) ao erlenmeyer; Prepare uma bureta de 25 ml com solução de NaOH ~ 0,1 mol/l padronizada; Titule a amostra até o aparecimento de coloração rosa que perdure por 30 s. Para os cálculos da titulação, utilize a equação: % acidez em ácido oleico = V NaOH. [NaOH]. 8,945 m a onde VNaOH é o volume gasto na titulação (em ml); [NaOH] é a concentração do titulante (em mol/l); ma é a massa de amostra utilizada (em g); e 8,945 é um fator de correção para o ácido oleico.
Tabela 4. Percentual de acidez, por titulação volumétrica. Réplica Massa de amostra (g) VNaOH (ml) % acidez (ác. oleico) 1 2 3 4. Questões para o relatório Qual a função do SDBS na composição do eletrólito de corrida? E a função do tampão? Calcule a concentração de cada ácido graxo e a acidez livre dos óleos vegetais analisados e expresse este resultado em porcentagem de ácido oleico. Compare os resultados obtidos por eletroforese capilar com os obtidos por titulação volumétrica usando a abordagem estatística adequada e dizendo se os métodos diferem entre si em um intervalo de 95% de confiança. Discuta possíveis vantagens e desvantagens entre os dois métodos. Pesquise na literatura os valores permitidos de acidez para o azeite extravirgem e discuta se os valores obtidos experimentalmente estão de acordo com a legislação. Explique se seria possível identificar algum tipo de fraude no azeite por eletroforese capilar. 5. Referências 1. OSAWA, C. C.; GONÇALVES, L. A. G.; RAGAZZI, S., Potentiometric titration applied to free fatty acid determination of edible oils and fats. Quim Nova, 2006, 29, 593-599. 2. SATO, R. T. et al. Rapid Separation of Free Fatty Acids in Vegetable Oils by Capillary Zone Electrophoresis. Phytochem Analysis, 2014, 25, 241-246. 3. BALESTEROS, M. R. et al. Determination of olive oil acidity by CE. Electrophoresis, 2007, 28, 3731-3736. 4. DE OLIVEIRA, M. A. L. et al. 20 years of fatty acid analysis by capillary electrophoresis. Molecules, 2014, 19, 14094-14113. 5. INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz:: Métodos Químicos e Físicos para Análise de Alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, 1985, p. 245-246.