BOLETIM TÉCNICO N 59 ISSN 0100-3054 OUTUBRO/98 Maria Cristina Leme de Lima Dias 1 Walter Rodrigues da Silva 2 1 Eng a. Agr a., Pesquisadora da Área de Propagação Vegetal, IAPAR. Caixa Postal 481. 86001-970 -Londrina-PR E-mail: mariacri@pr.gov.br 2 Engº. Agrº., Departamento de Agricultura, ESALQ/USP, Caixa Postal 9. 13418-900- Piracicaba-SP E-mail: wrsilva@carpa.ciagri.usp.br
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APRESENTAÇÃO O controle de qualidade de sementes é atividade fundamental em todo sistema de produção de sementes. Para o produtor de sementes de café, um teste que possibilite a avaliação rápida da viabilidade da semente é absolutamente importante, visto o longo tempo requerido para o teste de germinação e o curto período de conservação dessas sementes. Com o novo impulso dado à cultura cafeeira no Brasil e o plantio no sistema adensado, tem-se observado grande interesse por parte de produtores e responsáveis técnicos pelos laboratórios de análises de sementes em conhecer técnicas e procedimentos, que permitam uma avaliação rápida e segura da qualidade das sementes. Com base no material didático, utilizado em palestras e aulas proferidas pela primeira autora, sobre o teste de tetrazólio em sementes de café e a crescente demanda de informações sobre a metodologia do referido teste, a Coordenação da Área de Propagação Vegetal e a Liderança do Programa Café do IAPAR têm o prazer de apresentar o presente manual: 'TESTE DE TETRAZÓLIO EM SEMENTES DE CAFÉ", na certeza de que trará grande contribuição para produtores, analistas, estudantes e interessados pelo assunto. Maria Lúcia Crochemore Coordenadora da Área de Propagação Vegetal Armando Androcioli Filho Líder do Programa Café
INTRODUÇÃO O teste de tetrazólio é um método rápido, que estima a viabilidade das sementes com base na alteração da coloração dos tecidos vivos em presença de uma solução de sal de tetrazólio (2,3,5- trifenil cloreto de tetrazólio). No Brasil, começou a ser mais difundido na década de 70, através do Programa do AGIPLAN do Ministério da Agricultura, com treinamentos e lançamentos de publicações (Delouche et al., 1976 e Grabe, 1976). Os testes de germinação, na maioria das espécies cultivadas, necessitam de 7 a 30 dias para obtenção dos resultados, enquanto o de tetrazólio pode informar a viabilidade de um lote em algumas horas. Por isso, tem importância para o setor de sementes, agilizando as decisões de beneficiamento, armazenamento, comercialização ou descarte de lotes. O sal de tetrazólio é um indicador oxidante e redutor, e o desenvolvimento de cor vermelha, não difusível no tecido vivo, é o resultado da redução do sal pela ação enzimática, principalmente das desidrogenases. O teste é baseado na atividade de sistemas de enzimas, envolvidas com a atividade respiratória dos sistemas biológicos, capazes de catalizar as reações durante a glicólise e o ciclo de Krebs, tornando-se inativas com a perda da viabilidade dos tecidos. Durante os processos respiratórios, substâncias interniediárias são produzidas e servem de substratos para as enzimas, íons de hidrogênio são transferidos para o tetrazólio, que atua como um receptor de hidrogênio. O tetrazólio é reduzido a uma substância de cor vermelha, insolúvel e estável, denominada formazan. Como essa reação ocorre no interior das células e o pigmento não é difusível, há um delineamento nítido entre o tecido vivo, que adquire a cor vermelha, e o tecido morto, que permanece sem alteração de cor, já que não há respiração. A distribuição das áreas vivas e mortas nas sementes pode ser visualizada e, conforme sua localização, permite avaliar a viabilidade das sementes. 7
REAÇÃO DO TETRAZÓLIO A velocidade da reação do tetrazólio é afetada por diversos fatores: ph, temperatura, pressão atmosférica, concentração da solução e o nível de deterioração ou dormência das sementes. O equipamento necessário não é complexo, mas requer um maior tempo de trabalho do analista em relação ao demandado pelo teste de germinação. Exige, também, o conhecimento da estrutura embrionária da semente. Como a avaliação é feita sem a germinação, não são identificados os microrganismos presentes e, também, os eventuais danos causados por produtos utilizados no tratamento das sementes. Além de nem sempre ser possível detectar danos mecânicos de ocorrência recente. As sementes de café (Coffea spp.) perdem rapidamente a qualidade fisiológica e o teste de germinação necessita de 30 dias para obtenção dos resultados finais. Esses fatos, além de impedirem que a informação, proveniente do teste de germinação, reflita fielmente a viabilidade do lote analisado, causam dificuldades na comercialização devido ao curto espaço de tempo disponível entre a colheita e a semeadura. Diante dessa situação, uma série de pesquisas tem sido desenvolvidas, visando abreviar o prazo requerido para a obtenção dos resultados de viabilidade, através de métodos indiretos passíveis de correlação com o teste de germinação. Dentre as tentativas realizadas, a do teste de tetrazólio tem-se mostrado como uma das mais eficientes, não apenas pela rapidez proporcionada, mas também por ser uma técnica amplamente utilizada em várias espécies, como por exemplo soja (França Neto et al, 1988) e milho (Dias & Barros, 1995). A maior dificuldade na aplicação do teste de tetrazólio, em sementes de café, reside na metodologia a ser, adotada para sua condução, uma vez que o embrião, além de necessitar de um íntimo contato com a solução, encontra-se em região de difícil acesso para a sua exposição, durante a avaliação. Paralelamente, a idade de póscolheita da semente pode exigir diferentes tempos de permanência na solução de tetrazólio para a coloração dos embriões. 8
Buscando contornar esses problemas, Dias & Silva (1986) desenvolveram metodologia para o teste de tetrazólio em sementes de café, visando a obtenção de resultados equivalentes aos de germinação e a facilidade na execução, utilizando técnica que procurou evitar, ao máximo, danos mecânicos sobre o embrião, durante o processo de seu preparo para a avaliação. Os resultados obtidos não indicaram diferenças significativas entre as informações provenientes dos testes de germinação e de tetrazólio. Posteriormente, Dias & Barros (1993), comparando vários testes para avaliação da qualidade fisiológica de sementes de café, verificaram que o teste de tetrazólio foi o que apresentou maior sensibilidade para detectar diferenças de qualidade entre os lotes estudados. MATERIAIS E EQUIPAMENTOS - sal de tetrazólio (2,3,5-trifenil cloreto de tetrazólio); - água destilada; - placas de Petri, Becker ou copos plásticos descartáveis; - frasco de vidro escuro (âmbar); - bisturi, estilete e pinças; - papel toalha e papel filtro; - estufa ou germinador com controle de temperatura; - lupa e microscópio estereoscópio; - refrigerador. PREPARO DA SOLUÇÃO As soluções devem ser preparadas com água destilada, com ph entre 6 e 8, devendo ser acondicionadas em frasco de vidro escuro (âmbar) e guardadas em local escuro e fresco. Embora, para sementes de café, as Regras para Análise de Sementes (Brasil, 1992) recomendem solução a 1% (que é obtida misturando-se 10 g do sal de tetrazólio em 1 litro de água destilada), o teste pode ser conduzido com concentração de 0,1 %, sem prejudicar a precisão dos resultados e com significativa redução de custo. 9
OBTENÇÃO DA AMOSTRA As sementes são obtidas do componente "sementes puras" da análise de pureza, da mesma forma adotada na obtenção da amostra de trabalho para o teste de germinação. Nas análises oficiais são testadas 200 sementes (duas subamostras de 100 ou quatro de 50); para testes não oficiais, as amostras podem ser menores, geralmente duas repetições de 50 sementes, em virtude da uniformidade das condições ambientais proporcionadas pelo teste e da reduzida possibilidade de aparecimento das infecções, que normalmente ocorrem no teste de germinação. PRÉ - CONDICIONAMENTO Após a retirada manual dos pergaminhos, as sementes são embaladas em papel toalha úmido, para que a embebição provoque o amolecimento da semente e a ativação do sistema enzimático, facilitando o seu corte, a penetração da solução e o desenvolvimento da coloração. A embebição deve ser feita durante 18-24 horas a 30 C para acelerar o processo. Para evitar a perda de água, as amostras devem permanecer em câmara úmida ou acondicionadas em sacos plásticos. PREPARO DAS SEMENTES As sementes de café são seccionadas, conforme o indicado na Figura 1. Com o uso de um bisturi, a parte do endosperma portadora do embrião é retirada, de forma a não danificar ou expor o embrião. O restante do endosperma é descartado. Fig. 1 - Esquema dos cortes efetuados no endosperma da semente de café para a coloração no tetrazólio. Londrina, PR. 1998. 10
COLORAÇÃO As porções dos endospermas portadoras dos embriões são submersas em solução de tetrazólio e levadas à câmara sob 35 C, para acelerar a reação, em ausência de luz. Após 14 a 16 horas, a solução de tetrazólio é eliminada e as porções dos endospermas são lavadas em água corrente e conservadas imersas em água até a avaliação. Se esta não for imediata, as amostras devem ser mantidas a 5-10 C. A interpretação pode ser adiada por algumas horas, porém a demora aumentará a dificuldade de extração do embrião e a precisão do teste ficará prejudicada. AVALIAÇÃO Para a avaliação, os embriões são cuidadosamente extraídos da parte remanescente do endosperma, com o auxílio de bisturi e estilete, e colocados sobre papel filtro umedecido (Figura 2). A interpretação do teste deve ser realizada com o auxílio de microscópio estereoscópio. Fig. 2 - Extração do embrião da semente de café, após a sua coloração, para a avaliação do teste de tetrazólio. Londrina, PR. 1998. O teste de tetrazólio baseia-se principalmente na distribuição dos tecidos vivos com coloração de rosa claro a vermelho; dos tecidos mortos descoloridos ou acinzentados, entre os vários órgãos do embrião. Por isso, para avaliação do teste é necessário conhecer com segurança a estrutura das sementes e das plântulas. Se a importância e a função de cada órgão não for conhecida, as reações coloridas não terão sentido. 11
Além da coloração são observadas a turgescência dos tecidos, a ausência de fraturas em regiões vitais da semente e a sua formação morfológica. Em café podem ocorrer sementes sem embrião ou com a presença de mais de um embrião. Sementes sem embrião são anotadas como não viáveis. Diferenças na coloração dos tecidos podem não significar variações na viabilidade e, sim, alterações na permeabilidade. Sementes deterioradas, geralmente, colorem-se mais rápida e profundamente de vermelho-grená. As sementes vigorosas colorem-se vagarosamente, em tom rosa claro, brilhante e superficial, independentemente do período de permanência no tetrazólio, demonstrando dificuldade de penetração do sal nos tecidos com células portadoras de membranas celulares pouco deterioradas, O analista deve conhecer essas diferenças de coloração porque, também, podem indicar tempo insuficiente de contato com o tetrazólio ou concentração inadequada da solução. Devem ser consideradas viáveis as sementes que apresentarem embriões coloridos de rosa claro ou vermelho, segundo os critérios apresentados na Figura 3: 1 - Embrião totalmente colorido de rosa claro. 2 - Embrião com a extremidade da radícula descolorida ou acinzentada. 3 - Embrião com as extremidades dos cotilédones descoloridas ou acinzentadas. 4 - Embrião com as extremidades da radícula e dos cotilédones descoloridas ou acinzentadas. 5 - Embrião com coloração vermelha intensa, indicadora de deterioração fisiológica ou de danificação superficial, em área total ou circunscrita a pequenas regiões. 12
V=VIÁVEL NV+NÃO VIÁVEL Fig. 3 - Representação esquemática dos critérios para avaliação da viabilidade dos embriões no teste de tetrazólio em sementes de café. As áreas coloridas de rosa claro a vermelho indicam as regiões de tecidos vivos. Londrina, PR. 1998. 13
REFERÊNCIAS BRASIL, Ministério da Agricultura e Reforma Agrária. Regras para análise de sementes. Brasília, 1992. 365 p. DELOUCHE, J. C; STILL, T. W.; RASPET, M.; LIENHARD, M. O teste de tetrazólio para viabilidade da semente. Brasília, AGIPLAN,1976. 103 p. DIAS, M. C. L. L. & SILVA, W. R. da. Determinação da viabilidade de sementes de café através do teste de tetrazólio. Pesquisa Agropecuária Brasileira, 21(11): 1139-1145, 1986. DIAS, M. C. L. L. & BARROS, A. S. R. Avaliação de testes para determinação da qualidade fisiológica de sementes de café (Coffea arabica l). Informativo ABRATES, 3(3): 155, 1993. DIAS, M. C. L. L. & BARROS, A. S. R. Avaliação da qualidade de sementes de milho. Londrina, IAPAR, 1995. 43 p. (IAPAR. Circular, 88). FRANÇA NETO, J. B.; PEREIRA, L. A. G.; COSTA, N. P. da; KRZYZANOWSKI, F. C; HENNING, A. A. Metodologia do teste de tetrazólio em sementes de soja. Londrina, EMBRAPA-CNPSo, 1988. 60 p. (EMBRAPA-CNPSo. Série Documentos, 32). GRABE, D. F. Manual do teste de tetrazólio em sementes. Brasília, AGIPLAN, 1976. 85 p. 15
AGRADECIMENTOS Os autores agradecem aos funcionários do Laboratório de Análise de Sementes do IAPAR pelas colaborações recebidas.