UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHÃO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE CURSO DE MEDICINA NATÁLIA BARBOSA DA SILVA LOPES

1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO MARANHÃO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE CURSO DE MEDICINA NATÁLIA BARBOSA DA SILVA LOPES EFEITO DO EXTRATO AQUOSO DE Orbignya phalerata MART. NO PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO EM PELE DE RATOS SÃO LUÍS 2015

2 NATÁLIA BARBOSA DA SILVA LOPES EFEITO DO EXTRATO AQUOSO DE Orbignya phalerata MART. NO PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO EM PELE DE RATOS Monografia apresentada ao Curso de Medicina da Universidade Federal do Maranhão para obtenção do grau de Médica. Orientador: Prof. Dr. Orlando José dos Santos SÃO LUÍS 2015

3 Lopes, Natália Barbosa da Silva Efeito do extrato aquoso de orbignya phalerata mart no processo de cicatrização em pele de ratos/natália Barbosa da Silva Lopes. São Luís, 2015. 42f. Orientadora: Profº Dr. Orlando José dos Santos Monografia (Graduação) Curso de Medicina. Universidade Federal do Maranhão, 2015. 1. Cicatrização - Orbignya phalerata.i. Santos, Orlando José dos (Orient.) II. Título. CDU 616-003.9:582.545

4 Monografia submetida à banca examinadora designada pelo colegiado do Curso de Graduação em Medicina da Universidade Federal do Maranhão, como parte dos requisitos exigidos à obtenção do grau de Médica. Aprovado em: / / BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Orlando José dos Santos (Orientador) Prof. Dr. Manoel Lages Castello Branco Neto (Examinador) Prof. Dr. Sebastião Barreto de Brito Filho (Examinador) Me. Braúlio Galdino de Araújo (Examinador)

5 DEDICATÓRIA A Deus, por todas as bênçãos alcançadas e por ter me dado a honra de seguir nessa profissão; Aos meus pais, Antônio e Maria da Paz, por todo amor, dedicação e inspiração; Aos meus irmãos, pelo apoio e compressão em todos os momentos; À minha avó, Margarida Joana, pelas orações diárias; Aos meus sobrinhos, pelos abraços cheios de amor e ternura.

6 AGRADECIMENTOS Em primeiro lugar, agradeço a Deus pelo dom da vida. Obrigada, Senhor, por teres me concedido a graça de ter sido aprovada no vestibular de Medicina e por estares presente em todos os momentos de fraqueza e desesperança, trazendo-me palavras de alegria e fé. Mesmo nos momentos em que pensei que não teria mais forças para continuar, lá tu estavas com teus braços estendidos para me acolher, renovando as esperanças, colocando as pessoas certas no meu caminho e me guiando em direção à vitória. Peço-te para que seja feita exclusivamente a Tua vontade na minha vida, e que eu possa honrar a minha profissão, sendo sensível às dores dos meus pacientes. Agradeço aos meus amados pais por TUDO. Por todo amor, paciência e dedicação. Pelo exemplo de vida e pela garra em cuidar da nossa família com tanto zelo. Só tenho a agradecer pelas palavras de incentivo, pelo colo nos momentos de aflição, pelos abraços e sorrisos nas comemorações. Obrigada por tanta paciência e compressão. Vocês foram - e são - essenciais nessa conquista, permitindo que os meus sonhos se tornassem realidade. Agradeço às minhas irmãs, Daniela e Carolina, e ao meu irmão Davi, pelo companheirismo ao longo desses anos, pelo prazer que é estar na companhia de vocês. Obrigada pelos três presentes que vocês me deram João Pedro, Guilherme e Ana Júlia, alegrias da minha vida. Gostaria de agradecer ao Prof. Orlando Santos, por ser um exemplo de ser humano, médico e mestre. Obrigada por ter me orientando com tanto empenho e paciência, sempre disponível a me escutar e acalmar os meus anseios. Agradeço ainda por tantos ensinamentos durante os anos de academia. Sou privilegiada em ter tido a oportunidade de ser sua aluna, e tenho certeza que o senhor contribuiu de forma significativa na formação de todos nós. Agradeço ao Dr. Manoel Lages, Dr. Braúlio Araújo e ao Dr. Alberto Miranda, pela oportunidade de participar desse estudo e por todos os ensinamentos transmitidos durante a sua elaboração. Agradeço à LACEMA, Liga Acadêmica de Cirurgia Experimental do Maranhão, e a todos os ligantes que contribuem para a ciência com tanta garra e dedicação. Nessa liga, aprendi a trabalhar em equipe, sempre com muito respeito e excelência. Em especial, à Jéssica

7 Freire e ao Francisco Marques, companheiros nesse estudo, pelo excelente trabalho desenvolvido. Não poderia deixar de agradecer aos amigos que a Medicina me deu, e que, com os anos, se tornaram minha segunda família. Vocês transformaram a batalha diária em algo mais leve e a caminhada mais fácil. Especialmente ao Victor, companheiro em todos os momentos, tendo como paciência a característica mais marcante. Agradeço-te por todo amor dedicado e por ser meu porto seguro. Agradeço às minhas amigas incríveis, Jeruska, Laís, Luísa e Ohanna, que se fazem presentes desde a infância, alegrando diariamente a minha vida e me proporcionado tantos momentos de felicidade.

8 Se não puder voar, corra; Se não puder correr, ande; Se não puder andar, rasteje; Mas continue em frente. Martin Luther King

9 LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 CORTE TRANSVERSAL DO COCO BABAÇU FIGURA 2 DESCRIÇÃO E DISTRIBUIÇÃO DOS GRUPOS DO ESTUDO FIGURA 3 DEMARCAÇÃO DA PELE NO DORSO DO RATO COM PUNCH METÁLICO FIGURA 4 RESULTADO FINAL APÓS RETIRAR A PELE NO DORSO DO RATO FIGURA 5 DELIMITAÇÃO DA ÁREA DA FERIDA NO PROGRAMA AutoCAD 2013 FIGURA 6 FOTOMICROGRAFIAS DE TECIDO DE REPARAÇÃO DA PELE DE RATOS FIGURA 7 ASPECTO MACROSCÓPICO DA FERIDA EM UM RATO DO GBÇ 7 FIGURA 8 COLÁGENO JOVEM (TIPO III) DO GBÇ 21 FIGURA 9 COLÁGENO MADURO (TIPO I) DO GBÇ 14

10 LISTA DE TABELAS TABELA 1 - ANÁLISE DAS CROSTAS INTERGRUPOS TABELA 2 - ANÁLISE DAS CROSTAS INTRAGRUPOS TABELA 3 ANÁLISE DA REEPITELIZAÇÃO INTERGRUPOS TABELA 4 - ANÁLISE DA REEPITELIZAÇÃO INTERGRUPOS TABELA 5 ANÁLISE DAS MÉDIAS DAS ARÉAS (cm²) INTERGRUPOS TABELA 6 - ANÁLISE DAS MÉDIAS DAS ARÉAS (cm²) INTRAGRUPOS TABELA 7 - COMPARAÇÃO HISTOLÓGICA INTERGRUPOS 7º DPO TABELA 8 - COMPARAÇÃO HISTOLÓGICA INTERGRUPOS 14º DPO TABELA 9 COMPARAÇÃO HISTOLÓGICA INTERGRUPOS 21º DPO TABELA 10 - COMPARAÇÃO HISTOLÓGICA GRUPO CONTROLE EM RELAÇÃO AO 7º, 14º, 21º DPO (INTRAGRUPOS) TABELA 11 - COMPARAÇÃO HISTOLÓGICA GRUPO BABAÇU EM RELAÇÃO AO 7º, 14º, 21º DPO (INTRAGRUPOS) TABELA 12 ANÁLISE DAS VARIÁVEIS COLÁGENO JOVEM (TIPO III) E COLÁGENO MADURO (TIPO I) DENTRO DE CADA DIA PÓS-OPERATÓRIO

11 RESUMO Introdução: A cicatrização de feridas é um processo sistêmico e dinâmico com finalidade de reconstituição tecidual, sendo o resultado de três etapas sequenciais: fase inflamatória, fase proliferativa e fase de maturação. O babaçu (Orbignya phalerata) é uma planta abundante no estado do Maranhão, utilizada para fins medicinais com efeitos anti-inflamatórios, analgésicos e cicatrizantes e imunomodulador, útil para tratamento de feridas crônicas, úlceras gástricas e duodenais, tumores, obesidade, entre outras patologias. Objetivo: Avaliar através do estudo macroscópico, de planimetria digital e estudo microscópico o efeito do extrato aquoso da Orbignya phalerata no processo de cicatrização tecidual de feridas induzidas na pele de ratos. Método: Foram utilizados 36 ratos Wistar, que foram distribuídos, aleatoriamente, em dois grupos de 18 animais: Grupo controle (Gc) e Grupo babaçu (Gbç). O procedimento experimental constituiu em incisão de 2 cm de diâmetro na pele após marcação com punch metálico em região dorsocostal. No Gc foi utilizado cloreto de sódio a 0,9% e no Gbç utilizou-se extrato aquoso do mesocarpo do babaçu (Gbç), ambos em uso tópico. Os animais foram mortos em sete, 14 e 21 dias. De cada animal foi retirado fragmento de pele com três centímetros de diâmetro. As áreas das lesões foram analisadas por macroscopia e por planimetria digital, e os segmentos ressecados das feridas, por microscopia ótica em colorações de hematoxilina-eosina, tricômico de Masson e Picrosirius Red. Os dados foram avaliados por meio do programa estatístico IBM SPSS Statistics 20.0. Em todos os testes o nível de significância (α) foi de 5% (p < 0,05). Resultados: Na planimetria não foi encontrado diferença estatisticamente significante (p>0,05) entre os grupos Gc e Gbç em relação às médias das áreas. Na avaliação microscópica não houve diferença estatisticamente significante (p>0,05) entre os grupos Gc e Gbç em relação às variáveis histológicas, mas na análise dentro de cada dia, observou-se que o 14º dia houve diferença significativa (p<0,05) na fibroplasia. Na análise intragrupo foi observado diferença significativa (p<0,05) no Gc nas variáveis angiogênese e fibras colágenas, já no Gbç as variáveis com diferença significativa foram: células polimorfonucleares, mononucleares, angiogênese e fibras colágenas. No estudo do colágeno jovem e maduro, foi encontrada diferença significativa (p<0,05) entre os grupos Gc e Gbç na variável colágeno maduro no 14º e 21º DPO. Conclusão: Observou-se que o Grupo Babaçu se mostrou superior ao Grupo Controle em relação a variável proliferação fibroblástica (fibroplasia) no 14º DPO, como também nas variáveis colágeno maduro no 14º e 21º DPO. Palavras-chave: cicatrização, Orbignya phalerata (Babaçu), medicamentos fitoterápicos.

12 ABSTRACT Introduction: Wound healing is a systemic and dynamic process that leads to tissue reconstruction, with the result of three sequential steps: the inflammatory phase, the proliferative phase and the maturation phase. The babassu (Orbignya phalerata) is an abundant plant in the state of Maranhão, used for medicinal purposes as anti-inflammatory, analgesic, immunomodulatory and healing, useful for treatment of chronic wounds, gastric and duodenal ulcers, tumors, obesity, and other diseases. Aims: Assessment of the effects of aqueous extract of Orbignya phalerata the tissue healing process induced wounds in rats, using the digital planimetry and macro and microscopic study. Method: 36 Wistar rats were used, which were randomly divided into two groups of 18 animals: control group (Gc) and babassu Group (Gbç). The experimental procedure consisted in a 2 cm incision in the diameter of the back region skin after labeling with a metal punch. In Gc was used sodium chloride 0.9% and Gbç was used aqueous extract of babassu mesocarp (Gbç), both in topical use. The animals were sacrificed after 7, 14 and 21 days. Of each animal was removed piece of skin with three inches in diameter. The areas of the lesions were analyzed by macroscopy and digital planimetry, and the dry wounds segments by optical microscopy using hematoxylin-eosin, Masson trichrome and Sirius Red. The data were evaluated using the SPSS statistical program Statistics 20.0. In all tests, the significance level (α) was 5% (p <0.05). Results: In planimetry there was no significant difference found (p> 0.05) between Gc and GBC groups regarding mean areas. The microscopic analysis revealed no statistically difference (p> 0.05) between Gc and Gbç groups regarding histological variables, but in the analysis within each day was observed that the 14th there was no significant difference (p <0, 05) in fibroplasia. The intra-group analysis showed a significant difference (p <0.05) in the variables Gc angiogenesis and collagen fibers, since the Gbç variables with significant differences were: polymorphonuclear cells, mononuclear cells, angiogenesis and collagen fibers. In the study of young and mature collagen, there was a significant difference (p <0.05) between Gc and Gbç groups in variable mature collagen in the 14th and 21st POD.Conclusion: It was observed that the babassu group was superior to the control group in relation to variable fibroblast proliferation (fibroplasia) on the 14th POD, as well as in mature collagen variables in the 14th and 21st POD. Keywords: Healing, Orbignya phalerata (Babaçu), herbal medicines

13 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO... 14 2 OBJETIVOS... 16 3 MATERIAL E MÉTODO... 17 3.1 Preparo do fitoterápico... 17 3.2 Amostra... 18 3.3Ambientação... 18 3.4 Descrição dos grupos de estudo... 18 3.5 Pré-operatório... 19 3.6 Indução anestésica e Técnica operatória... 19 3.7 Recuperação pós-anestésica... 21 3.8 Pós-operatório... 21 3.9 Aplicação pós-operatória dos fitoterápicos... 21 3.10 Morte dos animais... 21 3.11 Avaliação microscópica... 21 3.12 Planimetria digital... 22 3.13 Avaliação Macroscópica... 22 3.14 Análise Estatística... 24 4 RESULTADOS... 25 4.1 Avaliação Macroscópica... 25 4.2 Planimetria Digital... 28 4.3 Avaliação Microscópica... 28 5 DISCUSSÃO... 33 5.1 Escolha do animal... 33 5.2 Escolha do fitoterápico... 33 5.3 Avaliação Macroscópica... 34 5.4 Planimetria Digital... 35 5.5 Avaliação Microscópica... 36 6 CONCLUSÕES... 38 Referências Bibliogáficas... 39

14 1. INTRODUÇÃO A cicatrização de feridas é um processo sistêmico e dinâmico com finalidade de reconstituição tecidual, que ocorre a partir de eventos celulares, moleculares e bioquímicos. Apesar da função de restabelecimento da integridade e função dos tecidos afetados, a cicatrização é incapaz de permitir que o tecido lesado retorne ao estado prévio. O processo cicatricial é o resultado de três etapas sequenciais: fase inflamatória, fase proliferativa e fase de maturação (CAMPOS et al., 2007; ROBBINS E COTRAN, 2010). Após ocorrer a lesão tecidual tem início a fase inflamatória, que é caracterizada pela hemostasia e uma resposta inflamatória aguda. A lesão do endotélio vascular é principal estímulo para que ocorra adesão, ativação e agregação plaquetária, seguida de aumento da permeabilidade capilar e quimiotaxia de neutrófilos e monócitos. Esse evento inicial com duração de poucos dias tem objetivo de conter o sangramento provocado pela lesão (através da formação de trombos), combater possível infecção bacteriana e evitar o acúmulo de debris celulares (ROBBINS E COTRAN, 2010; ISAAC et al., 2010). Em seguida inicia a fase proliferativa, que é composta por três processos: fibroplasia, angiogênese e reepitelização. Na fibroplasia ocorre proliferação de fibroblastos e síntese da matriz extracelular (MEC) a partir da ação de citocinas. O processo de angiogênese tem por finalidade nutrir e oxigenar os tecidos em crescimento. Por fim, a reepitelização ocorre a partir da ativação dos queratinócitos nas bordas da ferida, com função de reestabelecer as funções da epiderme, como proteção mecânica e controle da temperatura local (BALBINO et al., 2005; ROBBINS E COTRAN, 2010; RUH et al.,2013). A última é a fase de maturação. Caracterizada pela formação do tecido cicatricial, histologicamente pouco organizado, composto por colágeno e pobre em vascularização. Os eventos principais são o de remodelamento e contração da ferida. O primeiro é resultado do equilíbrio entre a síntese e a degradação do colágeno, associados à redução da vascularização e a presença de células inflamatórias. Já a contração da ferida ocorre através de um movimento centrípeto que aproxima as bordas da lesão e diminui a quantidade de cicatriz desorganizada (ROBBINS E COTRAN, 2010; OLIVEIRA et al, 2012). A Fitoterapia é a ciência dedicada ao estudo das plantas medicinais e suas aplicações nos tratamentos de patologias diversas, atuando na cura, no alívio e prevenção de doenças. É uma forma de terapia medicinal alternativa que vem crescendo bastante nos últimos anos, porém

15 esperava-se um avanço maior dessa área no Brasil, pois somos reconhecidos como detentores de uma das maiores e mais diversificada flora do planeta (YUNES et al., 2001). O uso de plantas medicinais tem relevante importância na medicina popular, cultura bastante difundida principalmente nos países em desenvolvimento, devido ao baixo custo e fácil acessibilidade. Além do uso caseiro, esses princípios ativos presentes nas plantas servem de matéria-prima para elaboração farmacêutica de medicamentos com fins terapêuticos, inclusive com custo menor. A grande crítica em relação a essa prática gira em torno da incerteza dos mecanismos de ação de determinados princípios ativos e o limite entre a dose terapêutica e a tóxica (FARNSWORTH et al., 2001). O babaçu (Orbignya phalerata) é uma planta abundante no estado do Maranhão, além dos estados do Tocantins, Piauí e Mato Grosso, na região conhecida como Mata dos Cocais. Pertence ao Reino vegetal, da classe Monocotyledoneae, família Palmae, do gênero Orbignya, espécie Orbignya phalerata (ANDERSON e BALICK, 1988). É fonte econômica de muitas famílias, que extraem diversos produtos dessa palmeira, entre os principais está a amêndoa contida nos frutos. Além dessa finalidade, o extrativismo dessa planta é utilizado para produção de artesanato, na culinária, como adubo de plantas, na indústria de cosméticos, na produção de biocombustíveis e álcool, e como fitoterápico (COSTA MACHADO et al., 2006; LIMA et al., 2007). Os usuários da Orbignya phalerata para fins medicinais acreditam que o fruto da palmeira possui efeitos anti-inflamatórios, analgésicos, cicatrizantes, imunomodulador e útil para tratamento de feridas crônicas, úlceras gástricas e duodenais, tumores, obesidade, entre outras patologias (BARROQUEIRO, 2001; CARVALHO FILHO et al., 2003; CABRAL, 2011). Essas propriedades são encontradas especialmente na farinha extraído do mesocarpo do babaçu, que também é utilizada como suplemento alimentar (ANDERSON E BALLICK, 1988; CABRAL, 2011).

16 2. OBJETIVOS Esse trabalho tem o intuito de esclarecer os efeitos do babaçu no processo de cicatrização, devido à existência de poucos trabalhos comprovando os benefícios e malefícios dos fitoterápicos. Dessa forma, o objetivo principal do presente estudo é avaliar o efeito do extrato aquoso da Orbignya phalerata no processo de cicatrização tecidual de feridas induzidas na pele de ratos. Através dos seguintes parâmetros: a) Analisar macroscopicamente a reepitelização das feridas; b) Estudar a retração cicatricial das áreas das feridas por planimetria digital; c) Analisar histologicamente segundo a presença de polimorfonucleares, mononucleares, neoformação vascular (angiogênese), proliferação de fibroblastos (fibroplasia), concentração de colágeno e reepitelização.

17 3. MATERIAL E MÉTODO Este estudo foi realizado entre setembro e outubro de 2012, no Laboratório da Liga Acadêmica de Cirurgia Experimental do Maranhão, localizado no Hospital Universitário Materno Infantil. Este trabalho é um subprojeto do estudo Avaliação da Cicatrização de ferida em pele de ratos com uso de Aroeira (Schinus terabinthifollus Raddi), Andiroba (Carapa guinensis Aublet) e Babaçu (Orbignya phaletara) aprovado pelo Comitê de Ética e Experimentação Animal (CEEA-UEMA), parecer n 037/2012. Foram seguidas as regras da Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT), com adaptações aos atuais recursos tecnológicos de informação. Obedeceu-se ainda a Nomina Anatomica Veterinaria (2012), os Princípios Éticos preconizados pela Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório (SBCAL) e as Normas da Legislação Brasileira de Animais de Experimentação, Lei Federal nº 11.794 (08/10/2008). O tamanho da amostra seguiu as recomendações da SBCAL, que determina utilizar o menor número estatisticamente viável de animais em estudos experimentais. Esta pesquisa não apresenta conflitos de interesse. 3.1 PREPARO DO FITOTERÁPICO BABAÇU (Orbignya phalerata) Para obtenção do extrato bruto aquoso utilizou-se 440g do pó do mesocarpo do coco do babaçu. O material foi colocado em recipiente e adicionado 800 ml de água deionizada. A mistura foi agitada e deixou-se em repouso por 24 horas. Após esse tempo a mistura foi filtrada e ao resíduo foi adicionada novamente a água deionizada (600 ml). Repetiu-se este procedimento, totalizando três extrações. O extrato bruto aquoso foi submetido ao processo de concentração sob pressão reduzida em evaporador rotativo à temperatura controlada em até 60 C, reduzindo a um volume 1130 ml e em seguida fez-se a determinação de peso seco (concentração). Retirou-se três alíquotas de 1mL do extrato bruto (1130 ml) e transferiu-se para três frascos de vidro de massa determinada. Utilizou-se corrente de ar quente e estufa a 1000 C a fim de garantir a evaporação total do solvente contido nos frascos. Através da diferença e da media aritmética, determinou-se a concentração, cujo valor foi de 0,005g/mL, com um total de massa obtida de 5,65g.

18 FIGURA 1- Corte transversal do coco babaçu Seta: Mesocarpo do babaçu 3.2 AMOSTRA Foram utilizados 36 ratos (Rattus novergicus albinus, Rodentia mammalia), da linhagem Wistar, machos, com peso variando entre 140 g e 200 g, início do experimento, procedentes do Biotério SupriLab, localizado em Cachoeira - Bahia. 3.3 AMBIENTAÇÃO Foram alojados três animais de mesma idade em 12 gaiolas. Cada gaiola de plástico com tampa de grade metálica inoxidável, medindo 46 cm x 31cm x 16 cm, com fundo protegido por maravalha, com controle de ruídos e temperatura, mantida em torno de torno de 22ºC, ciclos dia e noite (12/12 horas), com livre acesso à água e ração padrão para ratos (Purina Labina),. Institui-se período de aclimação durante sete dias. 3.4 DESCRIÇÃO DOS GRUPOS DE ESTUDO Os ratos foram distribuídos, aleatoriamente, em dois grupos de 18 animais após o procedimento cirúrgico (FIGURA 2): a) Grupo Controle (Gc) b) Grupo Babaçu (Gbç) O Gc corresponde ao grupo de animais submetidos ao tratamento pós-cirúrgico com aplicação de solução salina a 0,9%, no mesmo volume dos fitoterápicos. O Gbç corresponde ao grupo de ratos submetidos ao tratamento pós-cirúrgico com aplicação do extrato aquoso de Babaçu (0,5 mg/kg de peso do animal). Cada grupo foi dividido em três subgrupos de acordo com o período de avaliação em sete, 14 e 21 dias de pós-operatório (DPO), com seis animais em cada subgrupo.

19 FIGURA 2- Descrição e distribuição dos grupos do estudo 3.5 PRÉ-OPERATORIO Os animais foram pesados em balança eletrônica (MARTE, modelo A500, 110-200, Indústria Brasileira) antes da indução anestésica. 3.6 INDUÇÃO ANESTÉSICA E TÉCNICA OPERATÓRIA Para indução anestésica foram administrados por via intramuscular na face ventral do membro posterior, 75 mg/kg cloridrato de quetamina 5% (Vetanarcol ) associada com 10 mg/kg de cloridrato de xilazina 2% (Kensol ). O animal foi considerado anestesiado quando se apresentava imóvel, com reflexos interdigitais e corneanos abolidos, respiração normal e extremidades rosadas de acordo com o procedimento proposto por WHITE, JONHSTON e EGER (1974). Em seguida, foram imobilizados em prancha de madeira de 20 cm x 30 cm e realizada epilação manual da região dorsocostal do animal, 24 cm² (6 cm de comprimento x 4 cm de largura), localizada caudalmente a uma linha imaginária que passava pelos membros anteriores. No centro da área epilada foi realizada demarcação na pele de cada rato por rotação da borda cortante do punch metálico com 2 cm de diâmetro para demarcação da área a ser tratada na pele (FIGURA 3).

20 FIGURA 3- Demarcação da pele no dorso do rato com punch metálico Inicialmente foi feita incisão de 0,5 cm, com bisturi lâmina nº 15 da marca BD, através da qual, com tesoura e pinça de dissecção anatômica realizou-se ressecção de segmento de pele circular, seguindo a demarcação do punch, aprofundando-se a incisão até expor a fáscia muscular dorsal (FIGURA 4). FIGURA 4-Resultado final após retirar a pele no dorso do rato A hemostasia foi realizada por compressão com gaze. Concluída hemostasia, foram realizadas as primeiras administrações tópicas, nas feridas operatórias cruentas. No Gc, aplicou-se o volume de solução salina 0,9% correspondente ao maior volume aplicado dos fitoterápicos, nos animais do Gbç receberam 0,5 mg/kg de peso do extrato aquoso de babaçu.

21 3.7 RECUPERAÇÃO PÓS-ANESTÉSICA Após os procedimentos cirúrgicos e realizadas as primeiras aplicações tópicas do extrato aquoso de babaçu e da solução salina, cada rato foi colocado em gaiola individual até completa recuperação dos movimentos, onde foram identificados por caneta de marcação tipo Sharpie da marca MARKER realizadas no terço proximal da cauda do animal através das cores: roxo, vermelho, preto, verde, azul e sem marcação. Dessa forma, cada gaiola era composta por um animal marcado por cada cor supracitada e um rato sem marcação. Com a finalidade de analgesia pós-cirúrgica, os animais receberam Dipirona na dose de 25mg/kg, segundo Imagawa (2006), por via intramuscular no membro posterior contralateral à aplicação do anestésico. 3.8 PÓS-OPERATÓRIO Os animais foram mantidos nas mesmas condições pré-operatórias, com três ratos em cada gaiola, identificadas com etiquetas adesivas constando o grupo, o subgrupo e o dia do ato operatório, com livre acesso a ração e água. Diariamente, no período vespertino, os animais foram examinados com ênfase a movimentação espontânea e estimulada, sinais sugestivos de infecção e comprometimento do estado geral. 3.9 APLICAÇÃO PÓS-OPERATÓRIA DOS FITOTERÁPICOS As substâncias foram aplicadas diariamente em cada animal de acordo com seu grupo designado até o dia anterior a sua morte. Os ratos foram contidos manualmente pela cauda, sobre a grade metálica da gaiola, para administração tópica do fitoterápico e da solução salina nas feridas operatórias. 3.10 MORTE DOS ANIMAIS Os animais foram mortos através da aplicação de superdosagem (quatro vezes o valor da dose anestésica), por via intramuscular, de Vetanarcol e Kensol nos dias previamente estabelecidos (7, 14 e 21 dia pós-operatório), conforme Comitê Internacional de Cuidados ao Uso de Animais. 3.11 AVALIAÇÃO MACROSCÓPICA Na análise macroscópica das feridas operatórias foram verificadas as ocorrências de hemorragia (sim ou não), presença e extensão de crostas (ausente, parcial ou total), presença

22 de secreção (sim ou não) e a reepitelização (ausente, parcial ou completa), constando em ficha protocolo. Estes dados foram comparados entre os grupos nos dias pré-determinados para estudo (7, 14 e 21). 3.12 PLANIMETRIA DIGITAL Antes da morte, todos os ratos foram pesados em balança eletrônica digital. Após morto, cada animal foi colocado sobre prancha cirúrgica e teve a lesão fotografada por câmera digital (Sony Cyber-shot DSC-H55 14.1 megapixels), mantida em tripé a uma distância constante de 34 cm, com aproximação de 1,3x e resolução de 1280 x 960 pontos. Este procedimento visou obter imagens para avaliar a retração cicatricial por planimetria digital através do programa de computador AutoCad 2013 (FIGURA 5). A imagem (fotografia digital) foi importada para o programa de computador AutoCad 2013, no qual realizou-se delimitação da área na periferia da ferida (poliline). FIGURA 5- Delimitação da área da ferida no programa AutoCAD 2013 3.13 AVALIAÇÃO MICROSCÓPICA (HISTOLÓGICA) Cada ferida cirúrgica foi dissecada com margem de 1cm de pele íntegra em torno da lesão, com profundidade até a musculatura dorsocostal do animal. Cada peça cirúrgica dissecada (0,5 cm de espessura x 3,0 cm de diâmetro) foi retirada, fixada por alfinete em uma placa de isopor (com a face muscular mantida em contato com esta placa) e colocada em recipiente plástico com formaldeído a 10% para então ser destinada a análise histológica. O preparo das lâminas e estudo histológico foi realizado no Laboratório de Patologia do Hospital Universitário da UFMA.

23 As peças foram processadas histologicamente por método convencional. Foram realizadas colorações histológicas por Hematoxilina-Eosina (HE) e Tricômico de Masson (TM). As lâminas foram montadas com entellan e lamínula, e examinadas em microscópio óptico (Modelo BX 41, Olympus, Japan), com ocular de 10X e utilização das objetivas planas de 10X, 20X e de 40X. Foram obtidas fotomicrografias (FIGURA 6) através de câmera digital (Modelo DP 21, Olympus, Japan), depois arquivadas em computador. Para análise da densidade dos colágenos jovens e maduros na microscopia óptica em lâminas coradas por Picrosirius Red (PR) foi utilizada lente de luz polarizada (U-POT, Olympus, Japan). Nas observações de microscopia óptica, foram avaliados os seguintes parâmetros: células polimorfonucleares, células mononucleares, proliferação vascular (angiogênese), proliferação fibroblástica (fibroplasia), fibras colágenas (colageinização) e reepitelização. Foram adotados escores para quantificar as variáveis de acordo com a intensidade: em relação às células polimorfonucleares, células mononucleares, proliferação vascular (angiogênese), proliferação fibroblástica (fibroplasia) e fibras colágenas foram atribuídas 4 graduações: ausente, discreta, moderada e acentuada e para reepitelização, foram atribuídas 3 graduações: ausente, parcial e completa. Adotou-se a classificação do processo inflamatório em agudo e crônico; o infiltrado neutrofílico, edema intersticial e congestão vascular constituíram os indicadores do processo inflamatório agudo, correspondendo à fase I, ou inflamatória do processo cicatricial, enquanto que a presença de proliferação vascular (angiogênese), infiltrado mononuclear, proliferação fibroblástica (fibroplasia), fibrose (colagenização) e constituíram os indicadores de processo inflamatório crônico, correspondendo à fase II, ou proliferativa do processo cicatricial e a reepitalização encerrando a fase reparadora (fase III). As lâminas coradas por PR foram utilizadas para diferenciar as densidades de colágenos jovens (tipo III) e colágenos maduros (tipo I). As variáveis foram quantificadas como ausente, discreta (<25%), moderada (25-50%), intensa (50-75%) e acentuada (>75%).

24 PF CM FIGURA 6 Fotomicrografias de tecido de reparação da pele de ratos LEGENDA - A: Células mononucleares (CM), coloração HE, 40x B: Proliferação fibroblástica (PF), coloração Tricrômico de Masson, 40x 3.14 ANÁLISE ESTATÍSTICA Os dados foram avaliados por meio do programa estatístico IBM SPSS Statistics 20.0 (2011). Inicialmente as variáveis numéricas, tais como as morfométricas (áreas) foram avaliadas através do teste de normalidade de Shapiro Wilk, e foi verificado que elas não têm normalidade. Para as variáveis macroscópicas (crostas e reepitelização), histológicas (polimorfonucleares, mononucleares, proliferação fibroblástica e fibras colágenas), colágeno jovem e colágeno maduro utilizou-se o teste não paramétrico de Mann Whitney para avaliar o efeito do grupo. E o efeito dos dias dentro de cada grupo foi avaliado através do teste não paramétrico de Friedman. Em todos os testes o nível de significância (α) foi de 5%, ou seja, foi considerado estatisticamente significante quando p < 0,05.

25 4. RESULTADOS No pós-operatório todos os ratos recuperaram da anestesia, e não ocorreram complicações com boa evolução. 4.1 AVALIAÇÃO MACROSCÓPICA 1. Gc Subgrupo sete dias de pós-operatório Foi constatada ausência de hemorragia ou exsudato nas feridas operatórias. Verificou-se que três animais apresentaram crosta total, que recobriram toda a superfície da lesão, e os outros três animais apresentaram crosta parcial nas áreas das lesões. Em todos os animais a reepitelização se deu de forma parcial (FIGURA 7). 2. Gbç Subgrupo sete dias de pós-operatório Foi constatada ausência de hemorragia ou exsudato nas feridas operatórias. Todos os animais apresentaram crosta total nas áreas das lesões. A reepitelização ocorreu de forma parcial em todo o subgrupo. FIGURA 7- Aspecto macroscópico da ferida em um rato do Gbç 7 3. Gc Subgrupo 14 dias de pós-operatório Foi constatada ausência de hemorragia ou exsudato nas feridas operatórias. Todos os animais apresentaram crosta total nas áreas das lesões. A reepitelização ocorreu de forma parcial em todo o subgrupo.

26 4. Gbç Subgrupo 14 dias de pós-operatório Foi constatada ausência de hemorragia ou exsudato nas feridas operatórias. Todos os animais apresentaram crosta total nas áreas das lesões. A reepitelização ocorreu de forma parcial em todo o subgrupo. 5. Gc Subgrupo 21 dias de pós-operatório Foi constatada ausência de hemorragia ou exsudato nas feridas operatórias. Todos os animais apresentaram crosta parcial nas áreas das lesões. A reepitelização ocorreu de forma parcial em todos os animais deste subgrupo. 6. Gbç Subgrupo 21 dias de pós-operatório Foi constatada ausência de hemorragia ou exsudato nas feridas operatórias. Três animais apresentaram crosta parcial e, em três animais, não se observou a presença de crostas nas áreas das lesões; logo, foram classificadas como ausentes. Houve reepitelização total em três animais, e no restante, o processo se deu de forma parcial. Em relação à análise estatística das crostas entre os grupos estudados, o Gc e Gbç não diferiram estatisticamente (p>0,05) no 7º, 14º e 21º dias pós-operatórios (TABELA 1). Porém, na análise intragrupo, verificou-se que houve diferença significativa no Gc do 7º e 14º dia em relação ao 21º dia pós-operatório (p<0,05) (TABELA 2). TABELA 1. Análise das crostas intergrupos CROSTAS Gc Gbç P D7 Parcial/total Total 0,056 D14 Total Total 1,000 D21 Parcial Ausente/Parcial 0,423 Teste não paramétrico de Mann Whitney

27 TABELA 2. Análise das crostas intragrupos CROSTAS Gc Gbç D7 Parcial/total Total D14 Total Total D21 Parcial Ausente/Parcial P 0,014 1,000 Teste não paramétrico de Friedman Na análise da variável reepitelização não houve significância entre os grupos estudados, Gc e Gbç, no 7º, 14º e 21º dia pós-operatório (TABELA 3). Porém, na análise intragrupo, verificou-se que houve diferença estatisticamente significante no Gbç do 7º e 14º dia em relação ao 21º dia pós-operatório (p=0,033) (TABELA 4). TABELA 3. Análise da reepitelização intergrupos REEPITELIZAÇÃO Gc Gbç P D7 Parcial Parcial 1,000 D14 Parcial Parcial 1,000 D21 Parcial Parcial/Completa 0,575 Teste não paramétrico de Mann Whitney TABELA 4. Análise da reepitelização intragrupos REEPITELIZAÇÃO Gc Gbç D7 Parcial Parcial D14 Parcial Parcial D21 Parcial Parcial/Completa P 1,000 0,033 Teste não paramétrico de Friedman

28 4.2 PLANIMETRIA DIGITAL Em relação às médias das áreas calculadas através da planimetria, verificou-se que após o 7º dia do pós-operatório, o Gbç apresentou uma área maior que Gc (1,21 cm² e 0,84 cm², respectivamente). Diferentemente dos outros dias, após 14º dia do pós-operatório, o Gbç apresentou área menor (0.1 cm²) que o Gc (0,14 cm²). E após 21º dia do pós-operatório, o Gbç apresentou área 0,01 cm² versus 0.03cm² do Gc. Apesar de o Gbç apresentar uma área menor no 14º e 21º dia pós-operatório, esses resultados não apresentaram diferença estatisticamente significante (p=0,749 e p=0,507, respectivamente) (TABELA 5). Foi verificada diferença estatisticamente significativa na análise intragrupo das médias das áreas no Gbç e Gc (p=0,001 em ambos os grupos) (TABELA 6). TABELA 5. Análise das médias das áreas (cm²) intergrupos ÁREA CONTROLE BABAÇU p valor D7 0,84 ± 0,12 1,21 ± 0,38 0,055 D14 0,14 ± 0,11 0,10 ± 0,05 0,749 D21 0,03 ± 0,06 0,01 ± 0,02 0,507 Teste não paramétrico de Mann Whitney TABELA 6. Análise das médias aréas (cm²) intragrupos ÁREA CONTROLE BABAÇU D7 0,84 ± 0,12 1,21 ± 0,38 D14 0,14 ± 0,11 0,10 ± 0,05 D21 0,03 ± 0,06 0,01 ± 0,02 p valor 0,001 0,001 Teste não paramétrico de Friedman 4.3 AVALIAÇÃO MICROSCÓPICA Para a avaliação miscroscópica foram utilizadas as variáveis: presença de células polimorfonucleares, mononucleares, proliferação vascular (angiogênese), proliferação fibroblástica (fibroplasia) e fibras colágenas (colageinização). Foi realizada avaliação entre os

29 grupos controle (Gc) e babaçu (Gbç), como também entre os dias dentro de cada grupo, ou seja, análise intergrupos e intragrupos. Não foi verificada diferença significativa das variáveis durante a análise entre os grupos estudados no 7º dia pós-operátorio (TABELA 7). TABELA 7. Comparação histológica intergrupos 7º dia pós-operatório. Gc 7 Gbç 7 p valor Polimorfonucleares Discreta Discreta 1,000 Mononucleares Discreta Discreta 1,000 Angiogênese Moderada/Acentuada Moderada 0,056 Fibroplasia Discreta/Moderada Moderada 0,423 Fibras colágenas Discreta Discreta/Moderada 0,056 Teste não paramétrico de Mann Whitney Na análise das variáveis no 14º dia pós-operátorio foi verificada diferença significativa da proliferação fibroblástica do Gbç em relação ao Gc (p=0,006), porém o mesmo não foi visto nas outras variáveis estudadas (TABELA 8). TABELA 8. Comparação histológica intergrupos 14º dia pós-operatório. Gc 14 Gbç 14 p valor Polimorfonucleares Ausente Ausente 0,461 Mononucleares Ausente Discreta 0,247 Angiogênese Ausente/Discreta Discreta 0,118 Fibroplasia Discreta Moderada 0,006 Fibras colágenas Moderada Moderada 0,484 Teste não paramétrico de Mann Whitney Não foi verificada significância das variáveis estudadas entre o Gbç e o Gc no 21º dia de pós-operatório (TABELA 9).

30 TABELA 9. Comparação histológica intergrupos 21º dia pós-operatório. Gc 21 Gbç 21 p valor Polimorfonucleares Ausente Ausente 0,138 Mononucleares Ausente Ausente 0,523 Angiogênes Ausente Ausente 0,461 Fibroplasia Moderada Discreta/Moderada 0,575 Fibras colágenas Acentuada Acentuada 0,523 Teste não paramétrico de Mann Whitney Verificou-se na análise intragrupo das variáveis histológicas do Gc que houve diferença significativa na variável proliferação vascular (p=0,03) e fibras colágenas (p=0,007), porém o mesmo não foi visto nas outras variáveis estudadas (TABELA 10). TABELA 10. Comparação histológica Grupo Controle em relação ao 7º, 14º e 21º dia pósoperatório (intragrupos). Gc7 Gc 14 Gc21 p Polimorfonucleares Discreta Ausente Ausente 0,074 Mononucleares Discreta Ausente Ausente 0,074 Angiogênese Moderada/Acentuada Ausente/Discreta Ausente 0,003 Fibroplasia Discreta/Moderada Discreta Moderada 0,174 Fibras colágenas Discreta Moderada Acentuada 0,007 Teste não paramétrico de Friedman Verificou-se na análise intragrupos das variáveis histológicas do Gbç que houve diferença significativa em todas as variáveis, exceto proliferação fibroblástica (fibroplasia) (TABELA 11).

31 TABELA 11. Comparação histológica Grupo Babaçu em relação ao 7º, 14º e 21º dia pósoperatório (intragrupos). Gbç7 Gbç 14 Gbç21 p Polimorfonucleares Discreta Ausente Ausente 0,003 Mononucleares Discreta Discreta Ausente 0,016 Angiogênese Moderada Discreta Ausente 0,005 Fibroplasia Moderada Moderada Discreta/Moderada 0,210 Fibras colágenas Discreta/Moderada Moderada Acentuada 0,026 Teste não paramétrico de Friedman Na avaliação entre os grupos estudados foi constatado que houve diferença estatisticamente significante no 14º DPO em relação ao colágeno maduro (tipo I) (p=0,07) (FIGURA 9), como também no 21º DPO em relação à mesma variável (p=0,019) (FIGURA 8). Não foi verificada diferença significativa entre os grupos estudados em relação a variável colágeno jovem (tipo III) (TABELA 12). FIGURA 8 - Colágeno jovem (tipo III) do Gbç 21 Legenda: Coloração PR, 400 X

32 FIGURA 9 - Colágeno maduro (tipo I) do Gbç 14 Legenda: Coloração PR, 400 X TABELA 12. Análise das variáveis colágeno jovem (tipo III) e colágeno maduro (tipo I) dentro de cada dia pós-operatório. Grupo Colágeno Jovem III Dia 7º DPO 14º DPO 21º DPO Colágeno Maduro I Colágeno Jovem III Colágeno Maduro I Colágeno Jovem III Colágeno Maduro I Controle Discreta/Moderada Moderada Moderada Moderada Intensa Discreta/Moderada Babaçu Moderada Discreta Moderada Intensa/Acentuada Moderada Moderada/Intensa P 0.553 0.360 0.604 0.007 0.162 0.019 Teste não paramétrico de Mann Whitney

33 5. DISCUSSÃO 5.1 ESCOLHA DO ANIMAL A busca pelo modelo experimental ideal é uma tarefa difícil para o pesquisador, pois o animal deve apresentar características fisiológicas, anatômicas e orgânicas semelhantes ao ser humano, para que os resultados e conclusões possam ter maior aplicabilidade na prática médica (SCHANAIDER e SILVA, 2004). Grande parte dos animais utilizados em experimentos são aqueles de pequeno porte, como os camundongos, ratos e hamsters. Eles totalizam aproximadamente 90% das espécies submetidas a procedimentos nos laboratórios. Além do pequeno porte, os ratos da linhagem Wistar apresentam como vantagens o baixo custo e a facilidade no transporte, obtenção e manuseio, apesar de serem agitados (FAGUNDES e TAHA, 2004). São resistentes à manipulação, agressões cirúrgicas e a processos infecciosos, além de ter sua anatomia bastante conhecida e permitir padronização em relação à idade, ao peso, ao sexo e à alimentação. Por isso, esse roedor se consagrou como uma das espécies mais utilizadas em trabalhos experimentais (COHEN e MAST, 1990). A escolha do animal para realização do presente trabalho levou em consideração as vantagens citadas acima, além de verificar o uso habitual e consagrado na literatura dos ratos em modelo experimental de cicatrização de pele (FACURY NETO, 2001). Em relação à escolha do sexo, optou-se pelo masculino com o objetivo de evitar a influência das variações hormonais do ciclo estral das fêmeas (MARTINS et al., 2006). Como desvantagem, a pele do rato apresenta diferença em relação ao aspecto histológico da pele humana, que é a ausência de limite definido entre a derme papilar e reticular, o que pode falsear possíveis resultados em trabalhos experimentais (FAGUNDES e TAHA, 2004) 5.2 ESCOLHA DO FITOTERÁPICO Um medicamento é considerado fitoterápico pela legislação sanitária brasileira, quando é obtido exclusivamente de matérias-primas vegetais, deve apresentar eficácia e riscos conhecidos e capacidade de ser reproduzido com constância e qualidade (BRASIL, 2004; NETTO et al., 2006).

34 O uso de plantas como alternativa para tratamento de doenças é extremamente difundido no Brasil, principalmente pelo baixo custo e fácil acessibilidade. Porém, estudos aprofundados dessas matérias-primas não são incentivados pelos órgãos públicos, de forma contraditória, pois possuímos uma imensa e diversa flora. Uma grande parcela desses fitoterápicos é conhecida apenas pelo uso na medicina popular, sem estudos e embasamento científico que comprovem os reais benefícios do uso com fins terapêuticos (FARNSWORTH et al., 2001; YUNES et al., 2001). A Orbignya phalerata é uma dessas matérias-primas bastante utilizadas pela população. A farinha obtida a partir do mesocarpo do babaçu é útil no tratamento de feridas crônicas, úlceras gástricas e duodenais, obesidade, entre outras patologias a partir de efeitos antiinflamatórios, analgésicos e cicatrizantes (BARROQUEIRO, 2001). Existe uma polêmica quanto à classificação taxonômica do coco babaçu. Alguns botânicos classificam como Orbignya oleifera, enquanto outros como O. speciosa, O. martiana, ou ainda, O. phalerata (COSTA MACHADO et al. apud ROSA, 2006). Estudo semelhante foi realizado para avaliação do processo de cicatrização da linha Alba em ratos Wistar utilizando o extrato aquoso de Orbignya phalerata, porém diferentemente desse estudo, a aplicação do fitoterápico foi por via intraperitoneal na dose de 50mg/Kg. Os animais foram acompanhados e mortos após três e sete dias e os autores realizaram a análise histológica e tensiométrica (BRITO FILHO et al., 2006). O presente estudo utilizou a via tópica como escolha para a administração do extrato aquoso do babaçu, e fez uso 0,5mg/Kg/dose. 5.3 AVALIAÇÃO MACROSCÓPICA Não foi constatada presença de hemorragia ou secreção nas feridas operatórias de ambos os grupos, apenas presença de sangramento inerente ao procedimento cirúrgico, que foi contido por manobras hemostáticas, como compressão manual com gazes à semelhança de MIRANDA (2001). Dessa forma, todos os animais apresentaram boa evolução do processo de cicatrização das feriadas operatórias, corroborando com os estudos de BRANCO NETO et al. (2006). O processo normal após a remoção de fragmento da pele é o preenchimento do local lesado por coágulo, fibrina e exsudato inflamatório, que por fim irão originar a crosta fibrinoleucocitário segundo BRANCO NETO et al. (2006).

35 A formação de crostas é um mecanismo benéfico e necessário ao processo de cicatrização das feridas (OLIVEIRA, 1992). No presente estudo, apesar de ter ocorrido formação progressiva de crostas nas fases iniciais e finais de ambos os grupos, não foi verificado diferença estatisticamente significante do Gbç em relação ao Gc nessa variável. Corroborando com os resultados, FERNANDES et al. (2014) ao avaliarem a cicatrização de feridas em pele de ratos após aplicação tópica de óleo de andiroba observaram formação de crostas em todos os animais a partir do 4º DPO, porém não encontraram resultados significativos em relação a esta variável. Segundo MALDELBAUM et al. (2003), a reepitelização ocorre a partir da ativação dos queratinócitos nas bordas da ferida, com função de reestabelecer as funções da epiderme. Na análise intragrupos, foi observada diferença estatisticamente significante do Grupo Babaçu (Gbç7, Gbç14 e Gbç21) em relação à reepitelização (p=0,033). Não houve resultado com significância estatística no 7º, 14º e 21º DPO no estudo da reepitelização em relação à análise intergrupos (p=1, p=1, p=0,575, respectivamente). Diferente dos nossos resultados, o estudo realizado AMORIM et al. (2006) verificou efeito significativo positivo na reepitelização do grupo experimento (babaçu) em relação ao controle no 7º e 14º DPO. 5.4 PLANIMETRIA DIGITAL A aplicação tópica do extrato aquoso de babaçu não acelerou o processo de redução da área da lesão em relação ao grupo controle. Verificou-se que no 7º DPO, o Gbç apresentou a média de áreas maior que o Gc, 1,21 cm³ e 0,84 cm³ respectivamente. Em contrapartida, o Gbç apresentou uma média de área menor que o Gc no 14º e 21º DPO, porém essa diferença não foi considerada estatisticamente significante. O estudo semelhante foi realizado por AMORIM et al. (2006) com o objetivo de analisar comparativamente as alterações histológicas proporcionadas pelo extrato aquoso do Babaçu nas feridas cutâneas. Verificaram decréscimo significante das médias das áreas ao longo do tempo no grupo experimento (babaçu) e no grupo controle, corroborando com os atuais resultados. Porém, ao comparar os dois grupos, notaram que houve diferença estatisticamente significante entre eles favorecendo o grupo experimento, diferentemente do encontrado no presente estudo. Corroborando com o presente estudo, PISTORE et al. (2014) ao estudarem a aplicação tópica de óleo essecial de Ruta graveolens L.(Arruda) no tratamento de feridas cutâneas em

36 ratos, também verificaram que o tratamento utilizado não afetou o processo de redução da área da lesão cirúrgica. Foi constatada uma diminuição progressiva nas médias das áreas das feridas de todos os animais do 7º, 14º e 21º DPO de ambos os grupos, concordando com os achados de BRANCO NETO et al. (2006) e SANCHEZ NETO et al. (1993) que afirmam o organismo promove um processo de contração da ferida na tentativa de reparação tecidual. 5.5 AVALIAÇÃO MICROSCÓPICA O processo cicatricial é o resultado de três etapas sequenciais: fase inflamatória, fase proliferativa e fase de maturação (CAMPOS et al., 2007; ROBBINS E COTRAN, 2010). A fase inflamatória tem função de conter a progressão do dano tecidual e combater possíveis infecções, por isso é caracterizada principalmente pela hemostasia e quimiotaxia de neutrófilos e monócitos (ROBBINS E COTRAN, 2010; ISAAC et al., 2010). Os polimorfonucleares surgem no momento da lesão tecidual e permanecem por três a cinco dias em média, e são responsáveis pela fagocitose das bactérias (MANDELBAUM et al., 2003). No presente estudo houve diferença estatisticamente significante em relação à presença de células polimorfonucleares no Grupo Babaçu (Gbç7, Gbç14 e Gbç21) na comparação histológica intragrupo (p=0,003). Resultado semelhante foi observado em relação à presença de células mononucleares, onde foi observada diferença estatisticamente significante (p=0,016) na comparação histológica do Grupo Babaçu (Gbç7,Gbç14 e Gbç21). Além disso, houve redução da quantidade dessas células de acordo com o tempo transcorrido do pósoperatório nos dois grupos estudados, corroborando com o estudo de MARTINS et al. (2006) e de BRANCO NETO et al. (2006). Ao estudar o efeito da andiroba e do babaçu na cicatrização de cecorrafias em ratos, SOARES SILVA et al. (2014) observaram na avaliação microscópica que os ratos no 14º dia do pós-operatório do grupo babaçu apresentaram redução da quantidade de células polimorfonucleres com diferença estatisticamente significante, discordando com o atual estudo, onde não foi encontrada significância estatística dessa variável no Gbç14 em relação ao Gc14. A fase proliferativa é composta por três processos: angiogênese, fibroplasia, e reepitelização. O processo de angiogênese tem por finalidade nutrir e oxigenar os tecidos em crescimento (MANDELBAUM et al., 2003; BALBINO et al., 2005; ROBBINS E COTRAN,

37 2010; RUH et al.,2013). Foi observada significância estatística (p=0,005) na comparação histológica do Grupo Babaçu (Gbç7, Gbç14 e Gbç21) quanto à angiogênese. O mesmo resultado foi verificado no Grupo Controle (Gc7, Gc14 e Gc21), que apresentou um p=0,003. A fibrodisplasia é caracterizada pela proliferação de fibroblastos e síntese da matriz extracelular (MEC) a partir da ação de citocinas, que são fatores extremamente importantes na formação do tecido de granulação (MANDELBAUM et al., 2003; BALBINO et al., 2005; ROBBINS E COTRAN, 2010; RUH et al.,2013). Na análise da proliferação fibroblástica (fibroplasia), o estudo apresentou diferença estatisticamente significativa na comparação histológica intergrupos do 14º DPO (p=0,006), demonstrando efeito positivo do extrato aquoso de babaçu em relação ao controle nessa variável. SANCHEZ NETO et al. (1993) ao avaliar o processo de cicatrização em peles de rato com o uso tópico de papaína a 2%, observaram uma reparação tecidual mais eficaz nas fases inicias da proliferação fibroblástica (fibroplasia), semelhante ao presente estudo. SOARES SILVA et al. (2014), além de obter resultados positivos na variável células polimorfonuclares no grupo babaçu no 14º DPO, também verificaram que houve diferença significativa na análise da fibroplasia no 7º DPO no grupo andiroba. Em relação à análise microscópica das fibras colágenas não foi verificado significância estatística na comparação do Gbç e Gc no 7º, 14º e 21º DPO. Porém, na análise intragrupos foi observado resultado positivo tanto no Gbç (p=0,026) quanto no Gc (p=0,007). Todos os grupos obtiveram aumento gradual da quantidade de fibras colágenas ao longo dos períodos estudados, corroborando com os estudos de SANCHEZ NETO et al. (1993) e MARTINS et al. (2006), que verificaram aumento na quantidade de colágeno durante o processo de cicatrização de ferida operatória aberta. Inicialmente na fase de cicatrização há predominância do colágeno III, considerado o tipo jovem, que ao longo do tempo é substituído progressivamente pelo colágeno maduro, tipo I (ROBBINS E COTRAN, 2010; RUH et al.,2013). Foi observado que na análise da variável colágeno maduro houve diferença estatisticamente significante entre os Gbç e Gc no 14º e 21º DPO (p=0,007 e p=0,019, respectivamente). Diferentemente do resultado encontrado neste estudo, BRANCO NETO et al. (2014) ao analisarem as densidades dos colágenos após aplicação tópica de aroeira e óleo de andiroba em feridas na pele de ratos, não encontraram significância estatística entre os grupos em nenhum momento da avaliação (7º, 14º e 21º DPO).