EVOLUÇÃO DA FORMAÇÃO DE BIOFILME UTILIZANDO EFLUENTE DE ABATEDOURO DE SUÍNOS Marcos Antonio Machioni Junior*, Ana Carolina Pierotti Jacobs*, Bruna de Souza Raña*, Camila Zoe Correa* e Kátia Valéria Marques Cardoso Prates*. *Coordenação do Curso de Engenharia Ambiental/UTFPR, Londrina, Brasil. e-mail: mamachioni@gmail.com Resumo Este estudo avaliou a evolução da formação de biofilme em um Reator em Batelada Sequencial, operado com efluente de suíno. No reator adicionou-se Lamínulas de vidro e cubos de Espuma. Dois meios suportes eram retirados em intervalos pré-determinados. Uma Lamínula e uma Espuma eram retiradas para quantificação dos microrganismos aderidos. Outra Lamínula e Espuma eram retiradas a fim de se avaliar a formação do biofilme. Os resultados obtidos demonstraram que houve adesão do biofilme tanto na Lamínula quanto na Espuma, e que o efluente é propicio para o desenvolvimento do biofilme. Palavras-chave: Biofilme, Reator em batelada sequencial, Lamínulas, Espumas. Abstract The aim of this study was to evaluate the evolution of biofilm formation in a Sequential Batch Reactor, operated with swine wastewater. In the reactor were added Glass coverslip and Foam cubes. In all pre-defined range, a Coverslip and Foam have been removed. Two Coverslips and Foams have been removed for quantification of the microorganisms attached. Another Cover glass and Foam was remover to evaluate the biofilm. The result showed that was the accession of biofilm in the Coverslip and Foam, and that the wastewater is conducive to the evolution of biofilm. Key-Word: Biofilm, Sequential Batch Reactor, Cover glass, Foam. Introdução Os resíduos líquidos gerados pela atividade humana necessitam de tratamento para que possam ser dispostos em corpos d água de uma maneira que não agrida o meio ambiente. Uma forma de tratamento largamente utilizada utiliza reatores com biomassa aderida. Os reatores de biomassa aderida são unidades que permitem a imobilização de microrganismos que degradam compostos orgânicos em meios de suporte fixo. Este processo se apresenta vantajoso tendo em vista que consegue reter altas concentrações de biomassa, tornando o reator mais estável e menos propenso às variações das condições ambientais. Os organismos aderidos sintetizam uma matriz exopolissacarídica, que fornece proteção contra agentes antimicrobianos. As bactérias são os organismos que melhor produzem o biofilme, pois apresentam 1/6
características propícias como tamanho reduzido, boa capacidade de adaptação, alta taxa de reprodução e estruturas extracelulares que as protegem do meio que as circulam [1]. O presente trabalho buscou avaliar a evolução da formação de biofilme utilizando dois meios suporte diferentes, inseridos em um reator em batelada alimentado com efluente proveniente de abatedouro de suínos. Materiais e Métodos O presente trabalho foi realizado no laboratório de Microbiologia da Universidade Tecnológica Federal do Paraná UTFPR, Câmpus Londrina. A instalação experimental construída consistiu de um Reator em Batelada Sequencial (RBS) com capacidade de 6 litros, com uma camada de 1 cm de Espuma de poliuretano revestindo as paredes internas e um difusor de ar. O reator foi operado com efluente proveniente de uma lagoa anaeróbia de um abatedouro de suínos instalado na cidade de Ibiporã, no Paraná. Para estudar a formação de biofilme foram utilizados como meio suporte Lamínulas de vidro 24 x 32 mm e cubos de Espuma de poliuretano de 1 cm 3. Estes meio suportes foram introduzidos no reator e permaneceram em intervalos de tempo pré-determinado (Quadro 1). Quadro 1 - Períodos estabelecidos para a retirada dos materiais suporte do reator para análises da formação de biofilme. Tempo Período de permanência do material suporte no reator T0 0 min T1 30 min T2 1h 30 min T3 2h 30min T4 4h 00min T5 5 h 30min T6 7h 30min T7 9h 30min T8 12h A cada tempo, uma Lamínula era retirada do reator e depositada em uma placa de Petri contendo 10 ml de solução Tween 80 a 1% sendo agitadas em shaker a 40 RPM durante 15 minutos, a fim de se desprender as células aderidas à Lamínula. Para a remoção das células das Espumas, estas foram depositadas em tubos estéreis contendo 10g de pérolas de vidro e 9 ml de água destilada e agitado em Vortex durante 1 minuto. As suspensões obtidas provenientes das Espumas de poliuretano e das Lamínulas de vidro foram submetidas à diluição em série em solução salina e plaqueada em meio PCA (Plate Count Agar) para a determinação das UFC/mL. Para a análise microbiológica em cada tempo foi retirada uma Lamínula do reator e colocada em estufa de secagem a 60ºC durante 1 hora, as Lamínulas secas foram submetidas à coloração de Gram para posterior análise em 2/6
microscópio óptico para se obter a porcentagem de adesão do biofilme aderido e observar as morfologias das bactérias presentes. As Espumas retiradas do reator foram analisadas com auxílio de um estereomicroscópio para avaliação da colonização da Espuma e evolução da adesão. Resultados A partir da análise das placas de Petri inoculadas com as suspensões das Espumas e Lamínulas, foi possível obter as curvas de evolução da adesão dos microrganismos formando o biofilme. (Figuras 1 e 2) Figura 2 - Curva de evolução da adesão dos microrganismos aderidos à Espuma. A partir da análise das Lamínulas coradas com Gram em microscópio óptico, foi possível obter a porcentagem de recobrimento da Lamínula pelos microrganismos aderidos (Quadro 2 e Figura 3) e a observação das morfologias bacterianas presentes (Figura 4). Foram analisadas as Lamínulas a partir do tempo 2h 30min. Figura 1 - Curva de evolução da adesão dos microrganismos aderidos à Lamínula. Quadro 2 - Porcentagem de recobrimento das Lamínulas pelos microrganismos nas Lamínulas no decorrer do experimento. Tempo Adesão T3 15% T4 18% T5 36% T6 60% T7 84% T8 90% 3/6
Figura 3 - Porcentagem de recobrimento das Lamínulas pelos microrganismos em função do tempo. Quadro 3 - Porcentagem de recobrimento das Espumas pelos microrganismos no decorrer do experimento. Tempo Adesão 0 min 0% 30 min 3% 1h 30 min 5% 2h 30min 10% 4h 00min 19% 5 h 30min 25% 7h 30min 40% 9h 30min 70% 12h 90% Figura 4 - Morfologias bacterianas observadas nas Lamínulas com coloração de Gram. A análise das Espumas em estereomicroscópio permitiu observar a porcentagem de recobrimento pelos microrganismos formadores do biofilme (Quadro 3 e Figura 5) e o biofilme aderido aos poros da Espuma (Figura 6). Figura 5 - Porcentagem de recobrimento das Espumas pelos microrganismos em função do tempo. Figura 6 - Fotografia do acúmulo de biofilme nos poros da Espuma. 4/6
Discussão A estimativa de UFC/mL da solução proveniente da Lamínula revelou que houve evolução da formação do biofilme, tendo em vista o crescimento exponencial da quantidade de microrganismos. A análise da solução proveniente da Espuma apresentou um comportamento semelhante com a análise da Lamínula, com crescimento exponencial. A Espuma de poliuretano apresentou um maior crescimento dos microrganismos aderidos ao longo do tempo, tendo em vista que a porosidade do material é um fator que interfere na formação do biofilme [3]. A Lamínula apesar de não apresentar um crescimento rápido comparado com a Espuma, apresentou maior recobrimento pelos microrganismos. As duas análises apresentaram um comportamento natural de acumulação de biofilme. A adesão dos microrganismos nas Lamínulas apresentou crescimento contínuo no decorrer do tempo, apresentando uma diferença de crescimento de 75% entre os tempos T3 e T8. O resultado da microscopia óptica, no aumento de 1000 vezes, das lâminas com coloração de Gram, indicou que as morfologias dos microrganismos presentes foram, predominantemente, estreptococos e estreptobacilos em que os cocos apresentaramse gram-positivos e os bacilos, gram-negativos e gram-positivos. A quantidade de cocos gram-positivos apresentou um grande crescimento a partir do tempo T6, porém a diversidade de microrganismos se apresentou igual em todos os tempos. A adesão de microrganismos na Espuma se apresentou inicialmente nos poros das camadas mais externas da espuma, a partir de 5h e 30 min o acúmulo de material começou a se apresentar no interior da Espuma juntamente com o exterior. Conclusão O reator em batelada sequencial operado com efluente de abatedouro suíno pode proporcionar a formação de biofilme nas Lamínulas de vidro e nas Espumas de poliuretano. A análise de UFC/mL das soluções provenientes das Lamínulas e Espumas revelou que houve a evolução do biofilme aderido aos dois suportes. A Lamínula apresentou a característica de proporcionar um recobrimento por biofilme mais acelerado, porém a Espuma possibilitou o crescimento de um número maior de microrganismos. A observação da Lamínula recoberta com o biofilme possibilitou observar todos os microrganismos presentes, visto que não necessita da inoculação dos microrganismos. 5/6
Agradecimentos Á Universidade Tecnológica Federal do Paraná UTFPR pelo suporte financeiro. Referências [1] Chaves, L. C. D. (2004) Estudo da cinética da formação de biofilmes em superfícies em contato com água potável. Dissertação (Mestrado em Tecnologia do Ambiente) Departamento de Engenharia Biológica, Universidade do Minho, Braga. [2] Xavier, J.B., Picioreanu, C., Almeida, J. S., Van Loosdrecht, M. C. M. (2003) Monitorização e modelação da estrutura de biofilmes. Biomatemática Modelação da estrutura de Biofilmes Boletim de Biotecnologia, n. 76. p. 2-13. [3] Picanço, A.P., Sassim, M.N.M., Zaiat, M., Blundi, C.E. (2003) Avaliação da atividade biológica do biofilme formado em materiais suportes de filtros anaeróbios de fluxo ascendente. 21ºCongresso Brasileiro de Engenharia Sanitária e Ambiental. 6/6