Células somáticas no leite

Células somáticas no leite José Renaldi Feitosa Brito Pesquisador - Embrapa Gado de Leite/CNPq Rua Eugênio do Nascimento, 610, Dom Bosco, 36038-330 Juiz de Fora, MG 1. Introdução Nos anos recentes, vem aumentando a demanda pelos consumidores por produtos lácteos de alta qualidade. Essa demanda é sentida pela indústria que, por sua vez, necessita de matéria prima (leite cru) de qualidade. Tal demanda, juntamente com a pressão do mercado internacional por alimentos com reconhecida qualidade e segurança do ponto-de-vista da saúde pública, são os principais fatores que direcionam o uso disseminado da contagem de células somáticas (CCS) no leite. Atualmente, todos os países que possuem uma indústria leiteira desenvolvida usam a CCS como medida da qualidade do leite. A CCS no leite é um sinal de inflamação da glândula mamária da vaca e a maior parte dos pesquisadores e especialistas concordam que a causa primária dessa inflamação são as infecções causadas por bactérias. Dessa forma, a manutenção da saúde da glândula mamária das vacas é a melhor garantia para a produção de leite de qualidade. Consequentemente, a CCS tem sido usada como indicadora do status de qualidade do leite em todos os níveis: vacas, rebanhos, cooperativas, regiões e países. A principal razão com a preocupação em manter baixos os níveis de CCS nos rebanhos é econômica. Há uma perda crescente de produção de leite à medida que aumenta a CCS do leite total do rebanho (Tabela 1). Outras razões para a necessidade de redução da CCS nos rebanhos são: a interferência direta de altas CCS com a composição química do leite e a relação entre altas CCS e as taxas de infecção dos quartos mamários. 2. Definição, origem e função das células somáticas no leite As células somáticas (do grego somatikós, que significa referente ao corpo ) encontradas no leite têm esse nome porque se originam do corpo da vaca. Elas são constituídas principalmente pelos leucócitos (ou células brancas do sangue), cuja função é a defesa do organismo. Os leucócitos são constituídos por vários tipos de células. Os encontrados no leite da glândula mamária sadia são (aproximadamente): macrófagos (60%), neutrófilos (15%) e linfócitos (25%). Além dos leucócitos, as células epiteliais podem estar presentes em pequeno número (1 a 2%), embora alguns autores tenham registrado percentuais de 10 e até 20% destas células no leite normal. A maioria dos leucócitos é atraída do sangue para a glândula mamária, em resposta a uma agressão física, química ou infecciosa (principalmente de origem bacteriana) sofrida pela glândula mamária. O processo inflamatório resultante dessa agressão atrai os leucócitos e quando a agressão é muito intensa, os mecanismos de defesa do animal são requeridos a agir com maior intensidade, o que resulta no aumento exagerado de células e de outras substâncias que são também transferidas do sangue para o interior da glândula mamária e, por extensão, para o leite. O leite da glândula mamária sadia da vaca tem entre 20.000 (ou menos) e 50.000 células/ml, mas considera-se como um valor limite para a definição de normal contagens de até 100.000 células/ml (com base em estudos onde foram consideradas a média de 20.000

células e dois desvios padrão). Considera-se que vacas com CCS menor que 200.000/mL têm maior probabilidade de não estarem infectadas com os chamados patógenos principais da mastite, enquanto vacas com CCS acima de 300.000 têm maior probabilidade de estarem infectadas. Dependendo do estudo, o limite usado como indicativo de inflamação ou mastite tem sido estipulado como 200.000/mL, 250.000/mL ou 283.000/mL. A contagem de células de 250.000/mL tem sido recomendada como valor limiar para indicar a presença ou ausência de inflamação ou mastite. Deve-se registrar, entretanto, que um pequeno percentual de vacas comprovadamente infectadas com os patógenos principais pode apresentar contagens celulares de menos de 250.000/mL, enquanto que algumas vacas infectadas com os chamados patógenos secundários, como os estafilococos coagulase negativos, podem ter CCS acima de 250.000/mL. Os microrganismos classificados como patógenos principais (Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, outros estreptococos e coliformes) causam, em média, aumentos da CCS além de 1.000.000/mL, enquanto os patógenos secundários (Corynebacterium bovis e estafilococos coagulase negativos) são responsáveis, em média, por contagens de 370.000/mL. É importante, ainda considerar que o número de células no leite não é estático, mas parte de um processo dinâmico, independente do status infeccioso da glândula mamária (Harmon 1994). Dessa forma, considerando-se a natureza dinâmica da CCS na glândula mamária, a interpretação de dados baseada em uma única amostra é arriscada porque pode levar a falhas no diagnóstico ou na interpretação dos resultados laboratoriais. 3. Fatores que influenciam a contagem de células somáticas Além do papel preponderante dos patógenos da glândula mamária na elevação da CCS, deve-se considerar a influência de outros fatores, entre eles, a extensão e a duração da infecção, a prévia exposição da vaca aos patógenos, a individualidade da resposta imunológica de cada animal, etc. Observa-se, ainda, variação entre os microrganismos do mesmo grupo. Os estafilococos coagulase negativos, por exemplo, podem induzir uma resposta celular mais alta que os demais patógenos secundários. A CCS é alta imediatamente após o parto, mas em vacas sadias o número de células vai sendo reduzido à medida que decresce a quantidade de colostro no leite, chegando a menos de 200.000/mL dentro de quatro a cinco dias após o parto. Na segunda semana, a CCS é reduzida para menos de 100.000/mL. Em vacas de alta produção, a CCS aumenta ligeiramente quando a produção de leite cai para menos de 4 kg/dia. Considera-se que a CCS do leite de vacas não infectadas é maior logo após o parto, baixa durante a lactação e volta a aumentar no período próximo à secagem. Essa variação pode ser devida ao fator diluição (número de células por maior ou menor volume de leite produzido). Entretanto, o aumento observado em quartos mamários não infectados não é significativo a ponto de alterar a interpretação diagnóstica (por exemplo, a reação observada no California Mastitis Test [CMT]). Já se observou um aumento de 80.000 células entre 35 dias e 265 dias de lactação. Após o parto, a CCS de vacas com mastite subclínica diminui mais lentamente do que a de vacas sadias e o aumento é significativo à medida que elas chegam ao final da lactação. Nas vacas sadias, ao contrário, essas diferenças não são tão evidentes. A idade da vaca não afeta a CCS se a glândula mamária é livre de infecção. Entretanto, a reação celular contra agentes infecciosos em vacas que tenham tido mastite aumenta com a idade. Muitas vezes, a mastite é subclínica e passa despercebida. Dessa forma, é comum que as vacas mais velhas apresentem CCS mais alta, mesmo quando o úbere é aparentemente sadio. Após uma infecção, a CCS desses animais demora mais tempo a voltar ao normal. Ocorrem variações diárias na CCS de vacas individuais, mas essa variação é maior em animais infectados e pode ser causada pelas diferenças dos intervalos de ordenha e por 2

problemas de diluição do leite. Quando se examinam amostras composta da produção diária, por exemplo, essa variação desaparece. Isso justifica a necessidade de se realizar o exame de amostras representativas do leite total da ordenha diária e de reunir vários exames do mesmo animal e do mesmo rebanho, em determinado espaço de tempo. Recomenda-se, no mínimo, três exames consecutivos dos rebanhos (a intervalos semanais, quinzenais ou mensais) para se fazer um diagnóstico ou para se formular programas (por exemplo, de pagamento por qualidade, de controle da mastite, etc.) que incluam a CCS como parâmetro. A CCS é mais alta imediatamente após a ordenha e se mantém assim por três a quatro horas. Quando a produção de leite do animal aumenta, a CCS diminui e atinge o mínimo imediatamente antes da ordenha. Essas variações são menores nos animais sadios que em animais infectados. Alguns estudos demonstram que CCS pode ser influenciada pela raça do animal. A média de CCS no leite de vacas Ayrshire é menor que a de vacas da raça Holandesa, sendo essas diferenças evidentes quando se compararam vacas sadias e também vacas com infecção subclínica. Considera-se que aproximadamente 10% das diferenças entre a CCS de vacas é devida à genética, mas elas não são suficientes para influenciar significativamente o diagnóstico de mastite subclínica. Em um estudo realizado com cerca de 290.000 vacas Ayrshire e Holandesa, em que se comparou a relação de CCS entre essas raças e a produção anual de leite, as diferenças entre raças variaram de menos de 50.000 a menos de 100.000 células/ml. Outros estudos mostram que vacas com mastite subclínica quando estressadas (mudança das condições atmosféricas, agitação, estresse térmico) apresentam um aumento significativo da CCS no leite, quando comparadas a vacas sadias submetidas às mesmas condições de estresse. 4. Métodos de aferição da CCS Pode-se avaliar a CCS a partir de amostras de leite provenientes de: (a) quartos mamários individuais, (b) produção total diária do animal e (c) leite total do rebanho. Em alguns países essa amostra do leite total é analisada separadamente, considerandose as vacas de primeira cria em um grupo e as demais em outro grupo. Isso porque as primeiras têm CCS mais baixa. Vários testes podem ser usados para avaliar a CCS. O método padrão adotado internacionalmente e referendado pelo IDF é o microscópico, em que esfregaços de leite preparados em lâminas são corados e examinados ao microscópio. É um método laborioso e cansativo e, por isso, sujeito a erros de contagem, tornando-se inadequado para o exame de grande número de amostras. Outro método usado emprega um equipamento eletrônico ( Coulter counter ) que pode ser calibrado para reconhecer e contar determinados tipos de células. Nos últimos anos ganhou grande aceitação o sistema que usa o princípio da fluorescência ótica (equipamento Fossomatic, fabricado na Dinamarca). Mais recentemente, sistemas que usam como princípio para contagem a citometria de fluxo foram colocados no mercado. Eles são: Somascope (fabricado na Holanda), Somacount (Estados Unidos) e ANADIS (França). Esses sistemas foram analisados e considerados apropriados pelo IDF/FIL, (Federação Internacional de Laticínios) (Reichmuth, 1996). As vantagens e as limitações, assim como o fundamento dos principais métodos usados para aferição da CCS no leite são apresentados na Tabela 3. Uma das características da 3

maioria dos equipamentos usados em laboratório é a dificuldade de diferenciarem contagens abaixo de 50.000 células. Em um estudo recente em que se compararam quatro equipamentos, o Somacount e o ANADIS diferenciaram melhor as contagens abaixo de 50.000. Um dos métodos mais simples, práticos e mais usados em todo mundo é o CMT, em que cerca de 2 ml de leite é misturado com igual volume de solução de detergente (lauril sulfato de sódio a 3%). Isso é suficiente para coagular o DNA das células presentes no leite. O teste pode ser feito ao lado do animal, no próprio local da ordenha, usando-se uma raquete com quatro compartimentos. A interpretação mais comum do CMT considera cinco escores: negativo (normal), reação suspeita ou traços (T), reação positiva fraca (+), reação positiva (++) e reação fortemente positiva (+++). Em alguns países adota-se o critério numérico, que varia de 1 (negativo) a 5 (fortemente positivo). As reações 3, 4 e 5 ou +, ++ e +++ indicam maior probabilidade de infecção. Apesar de o CMT ser um teste subjetivo (não conta as células, apenas faz uma estimativa), existe uma correlação entre os escores (1 a 5) e a CCS (Tabela 2). É importante observar os cuidados na coleta das amostras (para que sejam representativas dos animais ou do leite total do rebanho), o acondicionamento e o transporte para o laboratório (sob refrigeração, dentro do prazo, em recipientes e com conservantes apropriados, etc.) No laboratório é importante que sejam usadas metodologias padronizadas e que os equipamentos sejam calibrados e revisados periodicamente, com supervisão externa. Não se deve esquecer que mesmo métodos e equipamentos altamente sofisticados não podem corrigir os erros cometidos por ocasião da coleta e manuseio das amostras. 5. Aplicações dos diferentes métodos de CCS Os dados individuais do animal são usados para determinar se a vaca ou o quarto mamário têm mastite ou com a probabilidade de estarem infectados. Tem-se demonstrado que em 80% dos casos, a CCS acima de 250.000/mL é relacionada com a presença de infecção. A CCS do leite total do rebanho tem três usos principais: a) monitoramento da prevalência de mastite no rebanho (Tabela 2); b) indicador da qualidade do leite cru e c) indicador das condições higiênicas da produção de leite na fazenda. Além desses, a CCS tem sido usada em esquemas de pagamento de leite por qualidade e como um padrão internacional de monitoramento da produção higiênica e de segurança do leite. 6. Emprego da CCS como exigência de qualidade e sua influência no comércio internacional Na União Européia há um limite de 400.000 células/ml para o leite total do rebanho poder ser entregue para consumo ou industrialização (a partir de 1998, mesmo o leite destinado à produção industrial teve de obedecer a este limite). Nos Estados Unidos, o limite é de 750.000 células, mas alguns estados estabelecem limites mais rígidos. Em países como Austrália, África do Sul, Japão e Nova Zelândia, as exigências variam entre 250.000 e 500.000 células. No momento não existem exigências internacionais para o limite de CCS do leite, mas existem exigências nacionais (ou, no caso da Comunidade Européia, de vários países em conjunto) que poderão ou deverão influenciar o comércio internacional. No caso da Comunidade Européia, por exemplo, o limite de 400.000 células/ml estabelecido para os produtos lácteos dos países membros é também aplicado para os produtos exportados para a Comunidade por outros países. 4

É possível que com o incremento do comércio internacional de leite e derivados haja necessidade de se estabelecer um padrão internacional para CCS. Sabe-se que a mastite não pode ser erradicada dos rebanhos leiteiros, mas a redução das infecções nos rebanhos é um alvo atingível, e já se dispõe de tecnologia para a produção econômica de leite (do rebanho) com CCS abaixo de 400.000 células/ml. A relação entre a CCS do leite total do rebanho e o percentual de quartos mamários infectados apresentada na Tabela 1 justificam essa política. De acordo com os dados apresentados, observa-se que mesmo rebanhos que atendem o limite de 400.000 células ainda apresentam um percentual elevado de animais infectados. Rebanhos com CCS acima de 400.000/mL têm claramente um sério problema de mastite que resulta em perdas econômicas consideráveis para o produtor. 7. Influência da CCS na qualidade do leite Verifica-se perda da qualidade do leite quando a contagem de células do leite total do rebanho é de 400.000/mL. Há um aumento indesejável de alguns componentes do leite (sódio, cloretos, proteínas do soro, soroalbumina, lactoferrina, imunoglobulinas) e um decréscimo (indesejável) de outros componentes (gordura, lactose, caseína, cálcio, potássio, etc.). Como resultado, a produção de vários derivados do leite, incluindo queijos, leite em pó e produtos fermentados, é prejudicada. Além disso, a estocagem do leite pasteurizado com alta CCS é prejudicada porque seu tempo de prateleira é menor. A política de melhoria da qualidade do leite pela redução da CCS afeta a todos, desde o produtor de leite (aumento de produção e ao melhor preço do leite, quando há programas de incentivo pela qualidade) até a indústria processadora (melhor rendimento, melhor qualidade e estabilidade dos derivados e maior tempo de prateleira), com reflexos positivos no mercado, pela maior aceitação dos produtos pelo consumidor. 8. Uso dos dados de CCS no gerenciamento dos rebanhos Os resultados laboratoriais da CCS dos rebanhos e de animais individuais devem ser analisados e as informações resultantes são úteis para orientar o gerenciamento da saúde dos rebanhos. Essas informações podem ser usadas para: a) monitorar a saúde do rebanho, ou, mais apropriadamente, a saúde do úbere dos animais, tanto quanto a efetividade das medidas de prevenção e tratamento das infecções; b) estabelecer políticas de controle da qualidade do leite, em bases objetivas; c) ampliar o conhecimento da epidemiologia (medidas de prevalência, incidência, e análise dos padrões da mastite no rebanho no decorrer do tempo) que contribuirá para a implementação e acompanhamento de programas de controle das infecções causadas pelos patógenos contagiosos, principais responsáveis pelas mastites subclínicas; d) monitorar a eficácia dos esquemas de tratamento da mastite, especialmente a terapia à secagem; e) identificar deficiências de manejo e possibilitar a recomendação de procedimentos específicos e efetivos; f) demonstrar a importância da mastite subclínica e funcionar como um motivador dos programas de controle da mastite e da melhoria da qualidade do leite. Entretanto, não se deve superestimar o alcance dessas informações. Os dados de CCS não servem, por exemplo, para: 5

a) selecionar animais para tratamento (antibiótico) da mastite subclínica durante a lactação. Tem sido demonstrado que o tratamento realizado com base na CCS não traz benefício econômico ao produtor e as taxas de cura das infecções são muito baixas. b) ser usada como diagnóstico da mastite, se usada isoladamente. É um método excelente de triagem, que deve ser associado ao exame microbiológico. c) monitorar as mastites causadas por patógenos do ambiente. A prevalência da infecção por esses microrganismos tende a ser baixa e rebanhos com predominância de problemas de mastite ambiental podem ter CCS abaixo de 300.000 células/ml. As exceções que ocorrem se devem ao aumento da incidência de mastite clínica, em determinados períodos. Além disso, os dados de CCS são úteis se usados e analisados em série (dados mensais e reunidos a intervalos trimestrais ou semestrais, por exemplo). É necessário o resultado de vários exames, em seqüência, para estimar os níveis de infecção do rebanho e determinar as tendências de ocorrência de novas infecções. Isso permitirá avaliar a necessidade de implementação de medidas corretivas ou simplesmente acompanhar as medidas recomendadas. Deve-se considerar, também, a necessidade de se trabalhar com as médias das contagens, sendo a média geométrica a mais recomendada. 9. Medidas para reduzir a CCS dos rebanhos O fundamental é a prevenção de novas infecções da glândula mamária, principalmente por meio de medidas higiênico-sanitárias. Estas incluem: a) medidas gerais: redução da prevalência de mastite; atenção ao manejo e instalações (condições de estabulação, umidade, ventilação, cuidados durante o parto, etc.) b) intervalo entre as ordenhas: qualidade da cama e do ambiente de circulação dos animais (limpos e secos), atenção aos animais no período da secagem (aplicação de antibióticos específicos); c) durante a ordenha: condições de tetas (limpas e secas antes da ordenha); desinfecção de tetas (depois da ordenha, sempre, e antes, em casos específicos); procedimentos adequados antes e durante a ordenha (prevenção de estresse, conforto do animal, ordenha rápida e completa); higienização e manutenção adequada dos equipamentos de ordenha; fornecimento de ração aos animais após a ordenha (para evitar que se deitem). 10. Bibliografia consultada Brito, J. F. F.; Caldeira, G. A. V.; Verneque, R. S.; Brito, M. A. V. p. Sensibilidade e especificidade do California Mastitis Test como recurso diagnóstico da mastite subclínica em relação à contagem de células somáticas. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 17, p. 49-53, 1997. Bramley, A. J. et al. Current concepts of bovine mastitis. 4. ed. Madison: National Mastitis Council, 1996. 64 p. Hamman, J. Somatic cells: factors of influence and practical measures to keep a physiological level. Bruxelas: International Dairy Federation, 1996. (IDF, Mastitis Newsletter 21). p. 9-11. Harmon, R. J. Physiology of mastitis and factors affecting somatic cell counts. Journal of Dairy Science, v. 77, p. 2103-2108, 1994. Heeschen, W. & Reichmuth, J. Mastitis: influence on qualitative and hygienic properties of milk. In: INTERNATIONAL DAIRY FEDERATION, INTERNATIONAL MASTITIS SEMINAR, 3 º Tel Aviv, 1995. Proceedings... p. 3.3-3.13. 6

Munro, G. L.; Grieve, p. A.; Kitchen, B. J. Effects of mastitis on milk yield, milk composition, processing properties and yield and quality of milk products. The Australian Journal of Dairy Technology, v. 39, p. 7-16, 1984. Reichmuth, J. New systems for somatic cell counts. Bruxelas: International Dairy Federation, 1996. (IDF, Mastitis Newsletter 21). p. 16-19. Smith, K. L. Standards for somatic cells in milk: physiological and regulatory. Bruxelas: International Dairy Federation, 1996. (IDF, Mastitis Newsletter 21). p. 7-9. Tabela 1. Relação entre contagem de células somáticas (CCS) e percentual de perda de produção de leite. CCS do leite total do rebanho Quartos mamários infectados (%) Decréscimo da produção (%) 200.000 6 0* 500.000 16 6 1.000.000 32 18 1.500.000 48 29 *Perda calculada como um percentual da produção esperada a 200.000 células/ml. Fonte: Bramley et al. (1996). Tabela 2. Contagem de células somáticas (CCS) de 3.012 amostras de leite, distribuídas entre diferentes classes de escores do California Mastitis Test (CMT). Escore do CMT Interpretação do CMT Nº de amostras CCS (x1.000/ml) 1 (-) negativo 2.029 80 2 (T) reação suspeita 313 334 3 (+) fracamente positivo 311 670 4 (++) positivo 237 1.354 5 (+++) fortemente positivo 122 4.456 Fonte: Brito et al. (1997). Tabela 3. Fundamentos, vantagens e limitações dos testes de contagem de células somáticas no leite. Teste Fundamento Vantagens e limitações Contagem microscópica direta Contador tipo Coulter As células são fixadas e coradas em lâmina de vidro e contadas, usando-se microscópio ótico comum. Usa um contador eletrônico que pode ser calibrado para reconhecer e contar células. É o teste padrão, reconhecido pelo IDF (FIL). É laborioso, cansativo (induz a erros de contagens); não é apropriado para grande número de amostras. Método amplamente usado. Apresenta limitações para o teste de grande número de 7

Ótico-fluorescente (equipamento Fossomatic) Citometria de fluxo (equipamentos: Somascope, Somacount e ANADIS) Wisconsin Mastitis Test (WMT); Viscosímetro Conta células que têm intensidade mínima de fluorescência, devido à coloração do DNA nucléico. Usa um sistema ótico (laser) para detectar e contar células, cujos núcleos são corados com uma substância química (coloração do DNA). O leite é misturado com um detergente e o DNA das células se torna viscoso. Quanto mais células, mais DNA e mais viscosidade. A velocidade de passagem da mistura leite+detergente pelo orifício de um tubo é a medida do número e células. California Mastitis Test (CMT) É uma adaptação do WMT em que o detergente é misturado com o leite em uma raquete e o grau de formação do gel (viscosidade) é estimado visualmente. Fonte: diversos autores. amostras e por não ser informatizado. Método automático, barato, de fácil processamento e muito usado na maioria dos países desenvolvidos. Os vários modelos se adaptam a diferentes exigências dos laboratórios. Limitações: preço do equipamento e manutenção (dependendo da região). Praticamente as mesmas do equipamento Fossomatic. Método indireto. Não apropriado para grande número de amostras. Não permite automação. Não diferencia contagens baixas de células. É prático, barato e pode ser aplicado ao lado do animal, com resultado imediato. A interpretação é subjetiva e pode variar entre pessoas. Permite estimar o número de células, geralmente em cinco categorias, com enorme variação entre categorias. Literatura Esses textos, infelizmente, não estão publicados, mas abaixo envio algumas referências de livros e artigos sobre o assunto e o endereço de um site (do National Mastitis Council. dos Estados Unidos) onde você pode ampliar sua pesquisa. 1. Existe um livro (The bovine udder and mastitis), editado por Markus Sandholm e outros, que aborda em vários capítulos aspectos relativos à imunologia da glândula mamária. O livro foi publicado pela Universidade de Helsinque, em 1995. 2. No livro "Bovine Medicine. Diseases and husbandry of cattle", editado por Andrews, A. H. e outros, da editora Blackwell Scientific Publications, de Oxford, Inglaterra, há alguns capítulos que abordam o tema. 8

3. Existe um artigo de revisão muito bom (Sordillo, L. M.; Shafer-Weaver, K. and DeRosa, D. Immunobiology of the mammary gland. Journal of Dairy Science, v. 80, p. 1851-1865, 1997. Nesse artigo você encontrará várias referências úteis. 4. Outro artigo (em espanhol), mas um pouco mais antigo: Diaz Otero, F. & Santiago Cruz, J. R. Mecanismos de defensa de la glándula mamária bovina en las fases de involución y lactación. Veterinaria Mexico, v. 23, n. 4, p. 357-365. 5. Em alguns sites na Internet poderão ser encontrados trabalhos ou referências: www.nmconline.org A partir desse site, existem numerosos outros em que podem ser encontradas informações (a maioria em inglês, infelizmente). \\c\sac - Pastas\Cartas Padrão\Qualidade do Leite\1 - CCS\Ccs.doc 9