2010/2011 2010/2011 Microscopia Electrónica Scanning Tunneling Microscopy (STM) Aplicações Bioquímicas Faculdade de Ciências da Universidade do Porto Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar Juliana Rodrigues Perazzo Mestrado em Bioquímica [Escolher a data]
Índice 1. Introdução... 3 2. Princípios Físicos... 3 2.1 Efeito Túnel... 3 2.2 O Microscópio de Efeito Túnel... 4 2.3 Resolução... 5 2.4 Limitações... 5 3. Aplicações Bioquímicas... 6 3.1 Catálise... 6 3.2 Obtenção de Imagens à Escala Atómica da Interface Sólido-Líquido.. 6 3.3 Observação e Manipulação de Átomos e Moléculas... 6 3.4 Imagens de material biológico de alta-resolução... 8 4. Referências Bibliográficas... 9
1. Introdução Existem diversas técnicas para observação de detalhes ampliados de superfícies, como por exemplo com lentes, utilizando um microscópio óptico, inventado no século XVIII. Neste século, foram desenvolvidos métodos de visualização baseados em feixes de iões ou de electrões, mas a ideia dos microscópios de sonda é totalmente diferente. Graças à invenção do microscópio de efeito túnel (STM), passou a ser possível não só ver, mas também medir e manipular átomos ou moléculas. O seu desenvolvimento em 1981 concedeu aos seus inventores, Gerd Binnig e Heinrich Rohrer, o Prémio Nobel da Física em 1986 [1]. 2. Princípios Físicos 2.1 Efeito Túnel Para se entender os princípios físicos envolvidos no STM, é necessário entender a mecânica quântica [2]. Existem muitos fenómenos quânticos que não se enquadram nos formalismos clássicos, mas o efeito túnel é talvez o mais impressionante. O efeito túnel é conhecido a mais de sessenta anos, desde a formulação da mecânica quântica. A mecânica quântica prevê, que uma partícula como um electrão, pode ser descrito por uma função de onda. Assim sendo, tem uma probabilidade finita de entrar em uma região classicamente proibida e por conseguinte, essa partícula pode tunelar através de uma barreira de potencial que separa duas regiões classicamente permitidas. A probabilidade de tunelamento é exponencialmente dependente da largura da barreira de potencial. Então a observação experimental dos eventos de tunelamento só é mensurável para barreiras bastante finas, já para a mecânica clássica uma barreira é uma barreira, ou seja, se uma partícula não tiver energia cinética suficiente, ela não conseguirá ultrapassá-la. Em resumo, a mecânica quântica prevê que a matéria apresenta comportamento ondulatório e, portanto, existe uma probabilidade não nula da onda atravessar a barreira, fenómeno este conhecido por efeito túnel.
2.2 O Microscópio de Efeito Túnel A combinação bem sucedida de tunelamento no vácuo com um sistema de cristais piezoeléctricos forma um miscroscópio de efeito túnel com varredura (Figura 1). No STM, o sensor de tunelamento (ponta de metal muito fina, de dimensões atómicas) mede a corrente I que passa entre a amostra e a sonda metálica, posicionada a uma distância de alguns angstrons da superfície da amostra (que deve ser condutora). Quando a distância sonda-amostra é aproximadamente de 10Å, os electrões da amostra começam a tunelar na direcção da sonda ou vice-versa, dependendo da polaridade da voltagem aplicada entre a sonda e a amostra. A corrente varia com a distância entre elas, sendo directamente proporcional à voltagem V aplicada e exponencialmente proporcional à distância d de separação entre a amostra e a sonda, ou seja, a resolução do STM reduz com o aumento de d. Figura 1. O microscópio de efeito túnel [3]. Fundamental para a operação do STM é a extrema sensibilidade da corrente de tunelamento à separação entre os eléctrodos. No STM, uma sonda muito fina, e muito próxima da amostra, varre a sua superfície, retirando electrões, levantando assim a topografia dos átomos na superfície da amostra, ou seja, registando o seu relevo.
2.3 Resolução Para um STM é possível obter resolução atómica, podendo-se medir distâncias de até 0,1Å. Mas, para que isso aconteça é fundamental isolar as vibrações, criando uma unidade STM o mais rígida possível, reduzindo as influências das vibrações ambientais. A resolução do STM depende ainda da corrente que varia com distância sonda-amostra, sendo directamente proporcional à voltagem V aplicada e exponencialmente proporcional à distância d de separação entre a amostra e a sonda, ou seja, a resolução do STM reduz com o aumento de d. 2.4 Limitações Obviamente, o microscópio de efeito túnel só funciona com amostras de materiais condutores ou semicondutores; do contrário, não haveria passagem de corrente eléctrica. Materiais isolantes, como vidro ou células vivas, seriam invisíveis ao STM. Assim, surgiu o microscópio de força atómica (AFM), variante do STM onde se acoplou à ponta da sonda um pequeno fragmento de diamante, que contorna os átomos da amostra exercendo uma pressão suficientemente pequena para não destruí-la. Conforme o fragmento de diamante se move quando encontra saliências, move-se também a ponta, criando-se então imagens como no STM. No entanto, houve já relatos de sucesso na obtenção de imagens pelo STM sem metalização da amostra e sob algumas circunstâncias, mostraram que algumas biomoléculas conduzem corrente eléctrica. O STM pode ainda ser utilizado não só em vácuo, mas também em contacto com o ar, água ou outros líquidos ou gases e em várias temperaturas. Porém quando usado no ar, tem-se uma contaminação da superfície da amostra, fazendo com que a imagem obtida não seja uma imagem pura. STM pode ser uma técnica difícil, pois requer superfícies extremamente limpas e estáveis, pontas afiadas, controle de vibrações excelente, e componentes electrónicos sofisticados.
3. Aplicações Bioquímicas Desde sua invenção, o STM encontrou uma imediata aceitação como uma poderosa ferramenta de análise superficial. As actuais e futuras aplicações desta tecnologia dependem da nossa compreensão da técnica de medida. 3.1 Catálise O processo de catálise é a base da química sintética e está envolvida na produção de tecidos, combustíveis, fertilizantes e produtos farmacêuticos. A catálise é também essencial para o ambiente. É exigido por lei que cada automóvel tenha um conversor catalítico para evitar a libertação de gases tóxicos para o meio ambiente. Uma vez que o STM pode funcionar numa atmosfera com reagentes reais, possibilita a observação de processos catalíticos ao nível atómico e em tempo real. Assim, a investigação com STM pode ajudar a compreender, controlar e projectar os processos de catálise. 3.2 Obtenção de Imagens à Escala Atómica da Interface Sólido-Líquido Os fenómenos que ocorrem na interface sólido-líquido são de elevado interesse tecnológico e científico. Por exemplo, a maioria do material biológico só é activo em tampão aquoso. No entanto, os métodos tradicionais de caracterização de superfícies são realizados em ultra-vácuo e nestas condições a interface sólido-líquido é inacessível. A invenção do STM abriu uma ampla janela para o estudo dos fenómenos que ocorrem à escala atómica na interface sólido-líquido. 3.3 Observação e Manipulação de Átomos e Moléculas As palavras soavam como que saídas da boca de um visionário: "Não tenho receio de considerar como questão final se, por fim no futuro distante nós pudermos arranjar os átomos da maneira que quisermos (...). O que aconteceria se pudéssemos arranjar os átomos, um por um, do jeito que quiséssemos?" Na época em que o físico
americano e aprendiz de profeta Richard Feynman (1918-1988) devaneou diante de uma platéia incrédula, o mundo não era lugar para pequenas idéias. Em dezembro de 1959, quando Feynman preferiu as visionárias palavras na palestra "Há muito lugar no fundo" para seus colegas da Sociedade Americana de Física, os computadores ainda eram geringonças que ocupavam metade das salas em que eram colocados. Feynman falava em mexer átomos num tempo em que ninguém sequer tinha visto um deles. Trinta anos depois, o sonho do físico ganhou forma na ciência do muito pequeno, a nanotecnologia. A observação de biomoléculas, como nucleótidos e proteínas, com STM em soluções aquosas requer uma etapa de imobilização, isto é, a adsorção da molécula em uma superfície plana, sem alterar as suas funções. Utiliza-se frequentemente uma camada de cisteínas numa superfície de ouro, que ao expor grupos carboxílico e grupos amino, permitem a imobilização das biomoléculas (Figura 2). Figura 2. (a) imagem de STM de uma monocamada de cisteínas self-assembled. (b) modelo de estrutura proposto: o átomo de enxofre ligado ao Au (111) num local oco. (c) modelo da cisteína. As operações básicas de manipulação de átomos consistem na utilização da ponta do STM para mover os átomos de uma posição inicial para uma posição final sobre um substrato. No início, os átomos são depositados de forma aleatória sobre um substrato, então uma energia de activação E deve ser aplicada para levantar o átomo de uma posição estável para movê-lo para outra posição estável, largando-o devido à diminuição gradual da corrente de tunelamento. Contudo, durante a manipulação atómica, nem a energia de interacção, nem a distância entre a ponta do STM e o átomo são conhecidas. A Figura 3 representa caracteres chineses escritos com átomos de prata (Ag) num substrato de Ag (111) utilizando a técnica anteriormente descrita. A área de uma carácter chinês é de 12 nm x 12 nm e a área de cada ponto é inferior a 0,8 nm x 0,8 nm, 100 vezes inferior ao proposto por Feynman.
Figura 3. Caracteres chineses escritos com o STM. Uma sequência de imagens de STM mostrando a manipulação de átomos de Ag (prata) em uma superfície de Ag (111). A técnica de manipulação lateral permite a colocação exacta de átomos nos locais pretendidos. A obtenção da imagem final requer não só a manipulação atómica individual, mas também muitos passos de limpeza. 3.4 Imagens de material biológico de alta-resolução A aplicação do STM a materiais biológico é uma área com um grande potencial, que tem revelado detalhes estruturais impossíveis de ser observados com outras técnicas tradicionais, como a microscopia electrónica de varrimento (SEM) por exemplo. Várias estruturas biológicas, como membranas, pele, bulbo olfactivo, lipoproteínas de baixa densidade (LDL) já foram observadas por STM [4,5]. Contudo, como a grande maioria dos materiais biológicos não são condutores, é necessário proceder ao seu revestimento com metais como Ag, ouro (Au), platina (Pt) ou outros, o que dificulta a visualização das estruturas devido à granularidade inerente ao metal. Em alguns casos o revestimento metálico pode não mimetizar o arranjo exacto das partículas tais como elas são. Uma maneira de obviar este problema é a utilização de um revestimento de carbono, que apesar de ser menos condutor do que os metais anteriormente referidos, são átomos mais pequenos e que não formam agregados. Por outro lado, algumas amostras biológicas, como a LDL, possuem uma certa condutividade e podem ser observadas sem nenhum revestimento metálico por STM [4].
Figura 4. Investigação de amostras biológicas por STM. (A) superfície do quimioreceptor do bulbo olfactivo do tubarão Carcharhinus longimanus. (B) célula receptora diferenciada à superfície do bulbo olfactivo. (K,L) superfície de lipoproteínas humanas de baixa densidade. 4. Referências Bibliográficas 1. Binnig, G. and H. Rohrer, Scanning tunneling microscopy—from birth to adolescence. Reviews of Modern Physics, 1987. 59(3): p. 615. 2. Eisberg, R.M., R. Resnick, and E. Derringh, Quantum physics of atoms, molecules, solids, nuclei and particles. 1985, New York: John Wiley. 3. Chen, C.J., Introduction to Scanning Tunneling Microscopy: Second Edition. 2007, Oxford: Oxford University Press. 4. Permjakov, N.K., et al., Use of STM for analysis of surfaces of biological samples. Applied Surface Science, 1999. 144-145: p. 146-150. 5. Beveridge, T.J., et al., High-resolution topography of the S-layer sheath of the archaebacterium Methanospirillum hungatei provided by scanning tunneling microscopy. J Bacteriol, 1990. 172(11): p. 6589-95.