KIT NF Indicações: O KIT NF da PROBAC DO BRASIL é constituído pelos testes de oxidase, utilização de glicose em meio base OF, descarboxilação de lisina e arginina (base Moeller), liquefação da gelatina, hidrólise da uréia, DNAse, e sensibilidade a polimixina. Os resultados destes testes permitem identificar a maioria dos bacilos Gram negativos não fermentadores da glicose isolados na rotina laboratorial. Características dos componentes:. Meios OF glicose com óleo e sem óleo... 4 ml/tubo.. Meios Descarboxilase de Moeller: controle, lisina e arginina...2 ml/tubo.. Meio de Gelatina... 1fita/tubo.. Meio DNAse...6 ml/placa.. Uréia...3 ml/tubo. Polimixina...6 discos/frasco. Fitas para determinação de oxidase...6 fitas/frasco Procedimento: Os testes devem ser realizados a partir de colônias isoladas e puras com 24 horas de crescimento..oxidase: com auxílio de alça de platina, bastão de vidro ou madeira, faça um esfregaço da colônia na fita de oxidase.. Não utilize qualquer tipo de alça ou bastão que contenha vestígios de ferro, pois este poderá provocar uma reação falso-positiva.. Não utilize colônias de meios com indicadores, pois poderão apresentar resultados falso-positivos. Meios de cultura: inocular densamente todos os meios do KIT NF, a partir do crescimento bacteriano no meio EPM ou agar inclinado:. OF glicose com óleo e sem óleo: inocular por picada central, introduzindo a agulha até o fundo.. Controle, Lisina e Arginina: inocular com alça ou agulha, depositando o inóculo na parede do tubo, abaixo do óleo mineral.. Gelatina: - pingar 10 gotas de salina estéril, no tubo identificado como GEL, com o auxílio do conta gotas, que acompanha o produto. Com o auxílio de uma alça turvar a salina (inóculo pesado).. Uréia: semear com inóculo denso na superfície do meio.. DNAse: semear 2-3 colônias em spot ( círculo de 0,5 cm de diaâmetro) deixando bastante espaço entre os teste para avaliar a presença de halo.. Polimixina: fazer antibiograma em M.Hinton e colocar o disco..incubar os meios de cultura a 37ºC durante 24-48 h; quando houver dúvidas quanto a interpretação dos teste, reincubar por mais 24 a 48 h e fazer nova leitura. Interpretação do resultado: A) Teste de Oxidase: a leitura é feita em poucos segundos: Oxidase + : o esfregaço bacteriano na fita apresenta coloração rosa intenso, que após alguns segundos pode mudar para preta. Oxidase - : o esfregaço bacteriano não apresenta alteração de cor. A cor rosa intensa aparece rapidamente (15-20 segundos). Após este intervalo, cores: rosa, violeta pálido são falsos positivos. A B. cepacia pode dar reação fraca. B) Glicose O/F: Testes Tubos OF glicose c/ óleo s/óleo Oxidação do açúcar inalterado amarelo só na (Oxidativo) superfície Não utilização do açúcar (Inerte ou alcalino) 1 inalterado inalterado ou azulado Fermentação da glicose (Fermentador ou amarelo amarelo Ácido) 2
1. Aguardar no mínimo 72 h para definir como inerte pois pode ocorrer a oxidação tardia ou lenta. 2. Quando a bactéria fermenta a glicose, não pode ser identificada pelo KIT NF II. Deve ser repicada em ENTEROKIT B para diagnóstico. C) Descarboxilação de aminoácidos: Lisina e Arginina:. Cor púrpura do meio mais acentuada que a do tubo controle : utilização do aminoácido.. Cor do meio igual ou mais amarelada que a do tubo controle : não utilização do aminoácido. Se negativo aguardar até 5 dias. Apenas uma prova deve ser positiva, exceto a B.cepacia que pode ser ornitina + e lisina +. D) Gelatina: Gelatinase (+): Utilização da gelatina impregnada na fita, com alteração da cor de cinza metálico para azul transparente. Gelatinase (-): A cor da fita permanece inalterada. Obs: antes de fazer a leitura, agitar suavemente o tubo. E) Uréia; a cor rosa forte aparece em parte do ápice ou em todo o meio após 24-72 h de incubação: ligeira mudança de cor rósea no ápice que não progride com maior incubação é considerada negativa. A Bordetella bronchiseptica pode dar reação positiva em 4 h. F) DNAse: adicionar ácido clorídrico 1N e aguardar 5 minutos. Observar a presença de halo transparente em volta do inoculo e o restante do meio fica leitoso. Se negativo repetir o teste com leitura em 48 h. Sempre usar uma cepa controle positivo e negativo. G) Polimixina: qualquer halo em torno do disco significa sensibilidade. Provas adicionais não incluídas:. Crescimento em Mac Conkey: Semear com alça uma colônia isolada o crescimento deverá ocorrer entre 1 e 3 dias.. Motilidade: Se a motilidade em tubo for negativa, recomenda-se a confirmação do resultado com o teste em lâmina. Teste de motilidade em lâmina: Inocular 2 colônias em um caldo TSB e incubá-lo pó 18-24 h á 37ºC. Agitar o tubo e com uma pipeta ou alça estéril retirar uma gota e depositar sobre uma lâmina. Sobre a gota depositar uma lamínula e observar com aumento de 400 vezes. A presença de muitas ou poucas bactérias cruzando o campo é significativa de motilidade positiva. Movimentos vibratórios fracos são considerados negativos. A motilidade deve ser observada em 37º e 20ºC.. Coloração de Gram: Realizar a coloração de Gram para a observação da morfologia bacteriana. Crescimento a 42º C: semear 2 colônias no meio. Incubar a 42º C. A prova será positiva quando ocorrer com a turbidez do meio ou for nítido o aumento da densidade bacteriana. O ideal é comparar com um controle mantido a temperatura ambiente. A interpretação dos resultados obtidos no KIT NF deve ser realizada de acordo com o Sistema Numérico que acompanha o produto. Quando necessário, outros testes podem ser realizados para confirmação do diagnóstico. Apresentação: Caixa com 6 conjuntos. Validade: 6 meses. Conservação: Manter os meios de cultura em temperatura ambiente 10º- 25ºC (local fresco). Manter as Fitas de Oxidase, os discos de polimixina e as placas de DNAse em geladeira (2 a 8º C). Precauções: Após o uso, o produto deverá ser descartado conforme as recomendações vigentes para resíduos de serviços de saúde.
ESQUEMA NÚMERICO PARA IDENTIFICAÇÃO EM BACTÉRIAS NÃO FERMENTADORAS Etapa 1 Fazer as seguintes provas: Oxidase Motilidade O/F Glicose / Controle Crescimento em Mac Conkey Gram Gelatina DNAse Uréia Lisina Arginina Crescimento a 42ºC Teste de sensibilidade a polimixina Etapa 2 - Interpretar as provas A e B e atribuir valores: PROVAS A: PROVAS VALORES Provas Positivas Provas Negativas Oxidase 4 0 Motilidade 2 0 - Somar valores obtidos para as provas de oxidase e motilidade= A PROVAS B: PROVAS VALORES Provas Positivas Provas Negativas OF Oxidativo=4 Inerte ou alcalino=0 Mac Conkey Crescimento=2 Não crescimento=0 Morfologia (Gram) Bacilo=1 Coco/Cocobacilo=0 - Somar valores obtidos para as provas de OF glicose + Crescimento em Mac Conkey + Gram= B OBS.: Se colônias com pigmento rosa vide tabela 3. Etapa 3 Localizar na tabela 1 o valor AB obtido e completar a interpretação numérica das provas indicadas para obter o número ABCDE correspondente CRES 42 o C + =4 NEG=0 Não fazer leitura GELATINA + = 2 NEG=0 Não fazer leitura DNASE + = 1 NEG=0 Não fazer leitura URÉIA + = 4 NEG=0 Não fazer leitura LISINA + = 2 NEG=0 Não fazer leitura ARGININA + = 1 NEG=0 Não fazer leitura POLIMIXINA Resistente= 1 Sensível= 0 Não fazer leitura
Tabela 1 Leitura A B C D E Leitura ABCDE 42ºC 4 GEL 2 DNA 1 URÉ 4 LIS 2 ARG 1 PMX 1 00 * * 01 * * 02 * * 03 * * 06 * * 07 * * 22 * * * 26 * * * 40 * * * * 41 * * * 42 * * * * 43 * * * 45 * * * 47 * * * 63 * * * * * 65 * * 67 * * *campos preenchidos não considerar a leitura da prova Etapa 3 Provas complementares Estas provas poderão ser indicadas para caracterizar alguns não fermentadores ou diferenciar outros cujas provas empregadas apresentaram padrão semelhante. 1. Citrato 2. Crescimento em NaCl 6,5% 3. Esculina 4. Indol 5. PYR Etapa 4 Localizar o número com 5 algarismos obtido e a correspondente identificação na coluna da esquerda. A tabela de freqüência mostra para alguns microrganismos a freqüência que o conjunto de provas pode ocorrer. Frequências baixas (<10% ) sugerem necessidade de revisão das provas (p. ex. aguardar mais tempo para interpretar provas negativas ou repetição de todas elas). Números não encontrados sugerem bactéria com padrão não comum, falha de interpretação de uma ou mais provas ou bactéria rara.
Tabela 2 A B C D E Freqüência % Provas complementares Acinetobacter lwoffii 0 0 0 0 0 80 Citrato negativo Acinetobacter lwoffii 0 2 0 0 0 10 Citrato negativo Acinetobacter 0 2 2 1 0 45 Citrato positivo Acinetobacter 0 3 2 1 0 <10 Citrato positivo e Hemólise em AS pos Acinetobacter 0 6 0 1 0 90 Citrato positivo calcoaceticus Acinetobacter 0 6 4 1 0 90 Citrato positivo Acinetobacter 0 6 4 5 0 <10 Citrato positivo Acinetobacter 0 7 0 1 0 <10 Citrato positivo calcoaceticus Acinetobacter 0 7 4 1 0 <10 Citrato positivo Acinetobacter 0 7 4 5 4 <10 Citrato positivo Acinetobacter 0 6 2 1 0 45 Citrato positivo e Hemólise em AS pos Acinetobacter 0 7 2 1 0 <10 Citrato positivo e Hemólise em AS pos Acinetobacter 0 0/1/2/3/4/ 2/0 2/0 0 <10 5/6/7 Stenotrophomonas 2 2 1 2 0 15 maltophilia Stenotrophomonas 2 6 1 2 0 56 maltophilia Pseudomonas 2 6 0 0 0 86 oryzihabitans Burkholderia cepacia 2 6 0 0 1 20 Pseudomonas luteola 2 6 0 1 0 99 Esculina positivo e PYR pos Pseudomonas 2 6 0 1 0 14 Esculina negativo e PYR positivo oryzihabitans Burkholderia cepacia 2 6 0 2 1 80 PYR negativo Stenotrophomonas 2 6 1 2 0 29 PYR negativo maltophilia Moraxella 4 0 0 0 0 50 Moraxella catarrhalis 4 0 1 0 0 99 Moraxella lacunata 4 0 2 0 0 99 Chryseobacterium 4 1 2 0 1 <10 Chryseobacterium 4 1 3 0 1 <10 Moraxella 4 2 0 0 0 50 Moraxella 4 2 0 4 0 99 fenilpiruvica /Ureolytica Moraxella canis 4 2 1 0 0 99 Chryseobacterium 4 3 2 0 1 <10 Indol pos Chryseobacterium 4 3 3 0 1 <10 Indol pos 4 5 0 0 0 Indol neg Sphingobacterium 4 5 0 4 1 Indol neg
A B C D E Freqüência % Provas complementares Sphingobacterium 4 5 1 4 1 Indol neg Chryseobacterium 4 5 2 0 1 90 Indol pos Chryseobacterium 4 5 3 0 1 45 Indol pos Sphingobacterium 4 7 0 4 1 Indol neg Sphingobacterium 4 7 1 4 1 Indol neg Chryseobacterium 4 7 2 0 1 <10 Indol pos Chryseobacterium 4 7 3 0 1 45 Indol pos 6 3 0 0 0 NaCl 6,5% negativo e PYR positivo denitrificans Alcaligenes faecalis 6 3 0 0 2 NaCl 6,5% positivo e PYR negativo Bordetella bronchiseptica 6 3 0 4 0 Uréia positiva ++ e PYR negativo denitrificans Pseudomonas stutzeri 6 3 0 4 0 Uréia Fraca e PYR positivo 6 5 0 0 0 6 5 4 0 0 6 5 1 0 0 6 5 5 0 0 6 7 0 0 0 07 Esculina negativa, NaCl 6,5% negativa e PYR positivo 6 7 0 0 0 Esculina positiva 6 7 0 0 0 Esculina negativa, NaCl6,5% positiva e PYR negativo Burkholderia cepacia 6 7 0 0 1 03 6 7 4 0 0 43 Esculina negativa, NaCl 6,5% negativo e PYR positivo 6 7 4 0 0 Esculina positiva Pseudomonas 6 7 4 0 0 Esculina negativa e NaCl6,5% stutzeri positiva Burkholderia cepacia 6 7 4 0 1 13 Pseudomonas putida 6 7 0 1 0 Pseudomonas aeruginosa 6 7 4 1 0 18 NaCl 6,5%=Variável Pioverdina= Variável Pseudomonas mendocina 6 7 4 1 0 90 NaCl 6,5%=positiva Pioverdina= negativa Burkholderia pseudomallei 6 7 4 1 1 21
A B C D E Freqüência % Provas complementares 6 7 0 2 0 07 Burkholderia cepacia 6 7 0 2 1 13 6 7 4 2 0 43 Burkholderia cepacia 6 7 4 2 1 51 6 7 1 0 0 Esculina positiva Shewanella 6 7 1 0 0 H 2S positivo no TSI e Esculina negativa 6 7 5 0 0 Burkholderia cepacia 6 7 2 0 1 01 Burkholderia cepacia 6 7 6 0 1 03 Pseudomonas 6 7 2 1 0 fluorescens Pseudomonas 6 7 6 1 0 82 aeruginosa Burkholderia 6 7 6 1 1 79 pseudomallei Burkholderia cepacia 6 7 2 2 1 03 Burkholderia cepacia 6 7 6 2 1 13 Shewanella 6 7 3 0 0 H 2S positivo no TSI Shewanella 6 7 5 0 0 H 2S positivo no TSI Shewanella 6 7 7 0 0 H 2S positivo no TSI Tabela 3 Colônias com Pigmento rosa Microrganismo A B C D E Cor da colônia Methylobacterium 6/4/2/0 5/1 0 4 0 Coral e seca Roseomonas 6/4/2/0 7/6/3/2 0 4 4 Rosada e mucóide Referências Bibilográficas: 1. Murray - Manual of Clinical Microbiology. American Society for Microbiology. 2.. Koneman, E. - Diagnostic Microbiology..J. P. Lippincott Company,. 3.. Baron, E. J. - Diagnostic Microbiology. Mosly.