Palavras-chave: Dorstenia brasiliensis, extração, CLAE, bergapteno, psoraleno.

Otimização das condições de extração hidroalcoólica das furanocumarinas de Dorstenia brasiliensis Lam. por maceração com ultra-som e análise quantitativa por CLAE/UV e fluorescência 61 CELEGHINI, R.M.S 1*.; YARIWAKE, J.H. 2 ; LANÇAS, F.M. 2 1 Faculdade de Engenharia de Alimentos-Departamento de Tecnologia de Alimentos-UNICAMP rua Monteiro Lobato, n o 80, CEP 13083-862, Campinas- SP, Caixa Postal: 6121 e-mail:celeghin@fea. unicamp.br 2 Instituto de Química de São Carlos, USP, CP780, CEP 13560-970, São Carlos-SP, Brasil. RESUMO: Neste trabalho avaliou-se as condições de extração hidroalcoólica por maceração com ultra-som das furanocumarinas, psoraleno e bergapteno, presentes nos rizomas das espécies de Dorstenia brasiliensis Lam. As variáveis de extração foram otimizadas obtendo-se um tempo de maceração em 30 minutos e porcentagem do solvente extrator etanol: água (50%). Os extratos hidroalcoólicos foram quantificados e a seletividade foi avaliada para os modos de detecção CLAE/UV e CLAE/fluorescência. Observou-se pequena diferença nos resultados quantitativos em relação aos dois modos de detecção: (7,8 ± 0,4) mg psoraleno g -1 e (1,6 0,1) mg bergapteno g -1 por CLAE/fluorescência e (8,8 ± 0,2) mg psoraleno g -1 e (1,74 ± 0,03) mg bergapteno g -1 por CLAE/UV. Em relação à seletividade o modo de detecção CLAE/UV apresentou melhores resultados para a análise das furanocumarinas em extratos hidroalcoólicos de rizomas de D. brasiliensis. Palavras-chave: Dorstenia brasiliensis, extração, CLAE, bergapteno, psoraleno. ABSTRACT: Optimization of the conditions of hydroalcoholic extraction of furocoumarins from Dorstenia brasiliensis Lam. by maceration with sonication and quantitative analysis by HPLC/UV and fluorescence. There were evaluated in this work the conditions of hydroalcoholic extraction using maceration with sonication of the furocoumarins, psoraleno and bergapteno present in the rhizomes of Dorstenia brasiliensis Lam. species. The variables of the extractions were optimized obtaining 30 minutes time for the maceration and a proportion of the extractor solvent ethanol: water of 50:50 v/v. The hydroalcoholic extracts were quantified and the selectivity was evaluated in two modes HPLC with ultraviolet detector and HPLC with fluorescence. A small difference was observed between these two modes of detection: (7.8 ± 0.4) mg psoralen g -1 and (1.6 ± 0.1) mg bergapten g -1 for HPLC/fluorescence when compared to (8.8 ± 0.2) mg psoralen g -1 e (1.74 ± 0.03) mg bergapten g -1 for HPLC/UV. The selectivity of the HPLC/UV was the best for the furocoumarins analyses of D. brasiliensis rhizomes in hydroalcoholic extracts. Key words: Dorstenia brasiliensis, extraction, HPLC, bergapten, psoralen. INTRODUÇÃO O presente trabalho tem como fonte de estudo Dorstenia brasiliensis L., pertencente à família Moraceae e conhecida popularmente, como carapia (Hoehne, 1939; Carauta, 1976). D. brasiliensis é erva perene, típica dos campos do sul do Brasil, Paraguai, Uruguai e Argentina (Noll, 1984; Simões et al., 1996). As espécies do genêro Dorstenia encontram-se entre aquelas de uso empírico, com diversas finalidades (Pozetti,1980). A química dasespécies brasileiras de Dorstenia até agora estudadas caracterizam-se pela presença de furanocumarinas. Rizzini et al. (1988) resgataram informações populares a respeito de plantas brasileiras empregadas para o tratamento de picadas de cobras venenosas, dentre as quais D. brasiliensis. Ruppelt et al. (1991) prepararam infusões com os rizomas de D. brasiliensis e verificaram a presença de atividade analgésica e antiinflamatória desta planta em ratos. Bauer & Noll (1986) analisaram extratos etéreos e alcoólicos dos rizomas de D. brasiliensis Recebido para publicação em 19/04/2005 Aceito para publicação em 15/03/2006

62 MATERIAL E MÉTODO Lam. e identificaram duas furanocumarinas lineares: o psoraleno [1] e o bergapteno [2]. Vilegas et al. (1990) realizaram análises cromatográficas por CCD qualitativas e semiquantitativas de amostras comercializadas com os nomes figueirilha e carapiá, encontradas em algumas farmácias especializadas em plantas medicinais. A análise qualitativa permitiu identificar apenas o psoraleno. As amostras comercializadas foram identificadas como D. brasiliensis devido ao teor de psoraleno encontrado nas amostras ser compatível com o teor encontrado nesta espécie. Cardoso et al. (2002) analisou a composição de furanocumarinas na infusão e decocção, presentes nas espécies D.vitifolia, D.tubicina, D.asaroides. Observou a presença de psoraleno e bergapteno nos rizomas de D.tubicina e D. asaroides e no caso da espécie D. vitifolia apresentou somente isopimpinelina tanto nos rizomas como nas partes aéreas. A espécie D. brasiliensis é tida como a mais valiosa do ponto de vista terapêutico (Simões et al., 1996). Os estudos fitoquímicos já realizados justificam o uso dessa e de outras espécies de Dorstenia apenas para o tratamento de afecções cutâneas, já que a administração oral ou tópica de furanocumarinas (em conjunto com irradiação UV) é empregada clinicamente para o tratamento da psoríase e vitiligo (Karrer et al., 2001). No entanto, essas substâncias têm atividade fotossensibilizante e fototóxica, podendo causar lesões cutâneas (dermatites e queimaduras de pele) em combinação com a luz UVA, exibindo propriedades citotóxica e mutagênica (Murray, 1973; Diawara, 1993). Mesmo na ausência da luz UVA, doses diárias de 200 e 400 mg de bergapteno kg -1 de massa corporal ministrada em ratos demonstrou efeitos tóxicos sob o fígado (Ostertag, 2002). Muitas pessoas abusam do emprego do carapiá na pinga como aromatizante, e assim o seu efeito de estímulo da mucosa e secreção interna pode tornar-se danoso, atacando a mucosa e produzindo ulcerações na mesma (Pozetti, 1980). Este trabalho otimizou as condições de extração com o solvente etanol: água por ser este o mais utilizado no preparo de tinturas farmacêuticas e determinou o tempo ótimo de extração e os níveis de bergapteno e psoraleno presentes nos rizomas comerciais de D. brasiliensis por CLAE/UV e fluorescência. Material Vegetal: Os rizomas da Dorstenia brasiliensis Lam. utilizados em todas as análises foram adquiridos no comércio local, sendo que todos provinham de um único laboratório. Os rizomas foram separados das raízes, pulverizados e tamisados (partículas entre 0,5-1,0 mm). As amostras foram reunidas em um único lote e armazenadas em frasco bem vedado, protegido da luz. Otimização da composição do solvente extrator: Um grama do pó da planta foi extraído com 10mL da mistura etanol: água nas seguintes proporções em relação ao etanol: 100, 90, 80, 70, 60,50 e 40%. A mistura foi colocada em ultra-som à temperatura ambiente, por 20 minutos. As extrações foram feitas em triplicatas. O material foi diluído, filtrado e analisado por CLAE/UV. Otimização do tempo ótimo de extração: Misturou-se um grama do pó da planta a 10 ml de etanol:água (50%). A mistura foi colocada em ultrasom à temperatura ambiente, variando-se o intervalo de tempo durante o qual a mistura foi submetida a sonicação. Foram utilizados 8 intervalos de tempo de extração: 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50 e 60 minutos. As amostras foram extraídas em triplicata e os extratos obtidos foram diluídos, filtrados e analisados diretamente por CLAE/UV. Teste da reextração da D. brasiliensis: Misturou-se um grama do pó da planta a 10 ml de etanol: água (50%). A mistura foi colocada em ultrasom à temperatura ambiente por 30 minutos. A amostra foi extraída e reextraída por mais duas vezes. As extrações foram feitas em triplicata e os extratos obtidos foram diluídos, filtrados e analisados diretamente por CLAE/ UV. CLAE-UV: Após vários ensaios, chegou-se às seguintes condições de análise como as melhores investigadas: Coluna RP-18 Supelco (250 mm x 4mm x 5 mm); fluxo 1mL min -1 ; volume injetado 20 µl; fase móvel Acetonitrila:água (30 :70 ), modo isocrático; bomba Shimadzu-LC 10 AD; sistema de dados LC - Work Station Class LC-10; detector UV/DAD Shimadzu- SPD-M10A. Para trabalhar com os dois compostos em um único comprimento de onda comparou-se os valores de absorbância dos compostos e concluiu-se que o melhor lambda (λ) onde ambos os compostos apresentam boa sensibilidade foi de 223 nm. CLAE- Fluorescência: Após vários ensaios, chegou-se às seguintes condições de análise como as melhores investigadas: Coluna RP-18 Supelco

63 (250mm x 4mm x 5µm); fluxo 1 ml min -1 ; volume injetado 20 µl; fase móvel acetonitrila: água (30:70), modo isocrático; bomba Waters 510; Sistema de dados Maxima 820, Waters; detector Fluorescência (Scanning) - Waters 470. Para trabalhar com os dois compostos em um único comprimento de onda de excitação e emissão, efetuou-se a injeção dos padrões separados no comprimento de onda ótimo para cada um. As melhores condições para os dois compostos foram λ ex = 308 nm e λ em = 489 nm Análise Quantitativa: Para a análise quantitativa do bergapteno e do psoraleno foi utilizado o método do padrão externo. Este método permitiu comparar as áreas do bergapteno e do psoraleno obtidas nas amostras vegetais com as áreas obtidas destas mesmas substâncias em soluções-padrão de concentrações conhecidas: 1, 10, 20, 40, 60, 80 e 100 µg ml -1. Foi feita uma curva-padrão para o bergapteno (Aldrich, 99%) e psoraleno (Aldrich, 99%). RESULTADO E DISCUSSÃO Otimização da maceração com ultra-som como método de extração Otimização da composição do solvente extrator (EtOH : H 2 O): O principal objetivo que pretende-se atingir ao preparar uma solução extrativa é a extração da maior quantidade dos princípios ativos de uma droga, bem como a separação destes em relação àqueles componentes inativos, e isto depende fundamentalmente da seletividade do solvente utilizado. A Tabela 1 apresenta os teores de psoraleno e bergapteno, variando-se a proporção do solvente extrator EtOH : H 2 O. Através dos dados apresentados na Tabela 1, observou-se que a simples variação da concentração do etanol utilizado como solvente altera o poder dissolvente para as substâncias em estudo. TABELA 1. Variação da concentração de psoraleno e bergapteno com a variação da concentração do solvente extrator. Verificou-se que a proporção ideal da mistura extratora foi de 50% EtOH: H 2 O, pois observou-se o aumento nos rendimentos de psoraleno e bergapteno quando comparado às demais proporções do solvente extrator. Otimização do tempo ótimo de extração da maceração com ultra-som: Com a finalidade de estabelecer o tempo ótimo de extração, tendo-se como critério o maior rendimento na extração de psoraleno e bergapteno, estabeleceu-se uma curva cinética (rendimento da extração em função do tempo) usando-se a mistura etanol: água (1:1 v/v). Através das curvas apresentadas nas Figuras 1 e 2 verificouse que o tempo de extração melhora o rendimento do processo. Porém, é importante considerar que a escolha do tempo de extração deve ser racional, pois quanto maior o tempo de exposição dos compostos ao ultra-som, maior a possibilidade de ocorrer degradação dos mesmos, além de ao final de longo período obter-se resultado semelhante em rendimento ao obtido em períodos mais curtos (List & Schimidt, 1989). Em ambos os casos, verificou-se que a partir de 30 minutos o ganho de massa em relação ao aumento de tempo foi muito pequeno; portanto optouse por este tempo como sendo o tempo ótimo de extração por maceração com ultra-som. Teste da reextração da D. brasiliensis por maceração com ultra-som: Para confirmar a eficiência da extração por maceração com ultra-som, uma amostra foi submetida a uma extração e a duas reextrações consecutivas. A Tabela 2 apresenta os resultados obtidos em relação à concentração de psoraleno e bergapteno em cada reextração. Verificou-se em ambos os casos que a maior porcentagem de extração de psoraleno (87%) e bergapteno (80%) foram obtidas na 1 a extração, sendo estes resultados satisfatórios para um método analítico. Concluiu-se que o aumento no tempo de análise e consumo de solventes não justifica a realização de uma 2 a etapa consecutiva de extração. Análise quantitativa do psoraleno e bergapteno: Inicialmente procurou-se a melhor condição cromatográfica para a separação do psoraleno e bergapteno no extrato hidroalcoólico da planta.

64 FIGURA 1. Curva de rendimento de extração versus tempo da extração por maceração com ultra-som para o psoraleno em amostra de D. brasiliensis. FIGURA 2. Curva de rendimento de extração versus tempo da extração por maceração com ultra-som para o bergapteno em amostra de D. brasiliensis. TABELA 2. Concentrações de psoraleno e bergapteno em cada etapa de extração (n=3) Avaliando-se os cromatogramas, no qual utilizou-se a fase móvel MeOH:H 2 O (40:60 v/v) com a fase móvel ACN:H 2 O (30:70 v/v), observou-se que esta fase móvel apresentou melhor separação e menor tempo de análise (10 minutos). Para efetuar uma melhor separação do psoraleno e bergapteno, usando como fase móvel MeOH:H 2 O, seria necessário diminuir a porcentagem do metanol em relação à água; isto ocasionaria um aumento no tempo de análise que nestas condições foi de 25 minutos. O objetivo ao estabelecer-se uma metodologia de análise é a determinação de um método rápido e eficiente; portanto, optou-se pela utilização da fase móvel ACN:H 2 O (30:70 v/v). Curva de calibração: Através dos resultados obtidos das curvas de calibração foi possível verificar a linearidade de ambos detectores dentro dos intervalos de concentrações avaliados. Os coeficientes de correlação encontrados para as curvas realizadas com o detector UV foram de 0,99965 para o psoraleno e 0,99982 para o bergapteno; para o detector de fluorescência foram de 0,99273 para o psoraleno e 0,99295 para o bergapteno. Estes resultados demonstram a validade do método, pois obedecem a uma correlação linear dentro dos intervalos de concentrações avaliados. Limite de detecção e quantificação: O limite de detecção foi determinado como três vezes o valor do sinal do ruído e o de quantificação como cinco vezes o sinal do ruído (Scott, 1994). O limite de detecção encontrado para o bergapteno foi de 0,05 µg ml -1 e 0,01µg ml -1 para o psoraleno e o limite de quantificação foi de 0,5 µg ml -1 para o bergapteno e 0,08 µg ml -1 para o psoraleno, demonstrando um baixo nível de ruído e uma boa sensibilidade do detector UV para o composto, a 223nm. No caso do detector de fluorescência o limite de detecção determinado para ambos os compostos foi de 1 µg ml -1 e o de quantificação foi de 4 µg ml -1 para o psoraleno e 7 µg ml -1 para o bergapteno. Análise de amostras comerciais de D. brasiliensis: As Figuras 3 e 4 ilustram os cromatogramas obtidos na análise do extrato hidroalcoólico de uma amostra comercial de D. brasiliensis utilizando a metodologia desenvolvida. Através da Figura 3 é possível observar que as furanocumarinas foram bem separadas, num tempo de análise de aproximadamente 10 minutos. Observa-se também a presença de outros compostos que foram extraídos junto com as furanocumarinas, mas que não prejudicam a análise, pois não observou-se co-eluição destes com os compostos de interesse. Os teores de psoraleno e bergapteno encontrados no extrato hidroalcoólico da amostra comercial de D. brasiliensis foram respectivamente de: (8,8 ± 0,2) mg g -1 e (1,74 ± 0,03) mg g -1. Comparando-se o cromatograma obtido na análise da amostra por CLAE-fluorescência (Figura 4) com o CLAE/UV (Figura 3), verifica-se que, além do psoraleno e do bergapteno as demais substâncias presentes também apresentaram fluorescência,

65 algumas com fluorescência maior do que as dos compostos analisados apresentando também um interferente com tempo de retenção entre os dois compostos de interesse. Os teores de psoraleno e bergapteno encontrados no extrato hidroalcoólico da amostra comercial de D. brasiliensis foram respectivamente de (7,8 ± 0,4) mg g -1 e (1,6 ± 0,1) mg g -1. Comparandose estes resultados com os obtidos por CLAE/UV [psoraleno (8,8 ± 0,2) mg g -1 ; bergapteno (1,74 ± 0,03) mg g -1 ] observou-se diferença nos valores dos resultados obtidos por CLAE/Fluorescência, ocasionada pela dispersão das medidas durante a etapa de integração dos picos devido à formação de uma pequena calda descendente. Embora os compostos analisados apresentassem propriedades fluorescentes, a metodologia utilizando CLAE/UV mostrou-se mais eficiente com melhor resolução dos picos e menor intensidade dos compostos presentes entre 2-5 minutos. FIGURA 3. Cromatograma (CLAE/UV) do extrato hidroalcoólico da amostra comercial de D. brasiliensis. FIGURA 4. Cromatograma (CLAE - Fluorescência ) do extrato hidroalcoólico da amostra comercial de D. brasiliensis. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA AGRADECIMENTO À FAPESP, CNPq e CAPES pelo apoio financeiro (bolsas e auxílio-pesquisa). BAUER, L.; NOLL, I.B. Furanocumarinas de Dorstenia Brasiliensis Lam. Caderno de Farmácia, v.2, p.163-71, 1986. CARAUTA, J.P.P. Dorstenia L. (Moraceae) do Brasil e países limítrofes. 1976. 148p. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro. CARDOSO, C.A.L. et al. Simultaneous determination of

66 furanocoumarins in infusions and detections from carapiá (Dorstenia Species) by high-performance liquid chromatography. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.50, p.1465-69, 2002. DIAWARA, M.M. et al. Toxicity of linear furanocoumarins to spodoptera-exigua - evidence for antagonistic interactions. Journal of Chemical Ecology, v.19, p.2473-84, 1993. HOEHNE, F.C. Plantas e substâncias vegetais tóxicas e medicinais. São Paulo: Departamento de Botânica do Estado de São Paulo, 1939. 355p. KARRER, S. et al. Phototherapy of psoriasis: comparative experience of different phototherapeutic approaches. Dermatology, v.202, p.108-15, 2001. LIST, P.H.; SCHIMIDT, P.C. Phytopharmaceutical technology. Boca Raton: CRC Press, 1989. 374p. MURRAY, R.D.H. et al. The natural coumarins: occurrence, chemistry and biochemistry. Chichester : John Wiley & Sons, 1973. 702p. NOLL, I.B. Isolamento, identificação e doseamento de furanocumarinas. 1984. 60p. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre. OSTERTAG, E. et al. Effects of storage conditions on furocoumarin levels in intact, chopped, or homogenized parsnips. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.50, p.2565-70, 2002. POZETTI, G.L. Contribuição do estudo químico de Dorstenia bryoniiflolia Mart. Ex Miq. 1980. 96p. Tese (Livre Docência) - Universidade Estadual Paulista, Araraquara. RIZZINI, C.T.; MORS, W.B.; PEREIRA, N.A. Plantas brasileiras tidas como ativas contra peçonhas animais, especialmente de cobras. Revista Brasileira de Farmácia, v.69, p.82-6, 1988. RUPPELT, B.M. et al. Pharmacological screening of plants recommended by folk medicine as anti-snake venom. 1. Analgesic and anti-inflammatory activities. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v.86, p.203-5, 1991. SCOTT, R.P.W. Liquid Chromatography for the Analyst. New YorK: Marcel Dekker, 1994. 328p. SIMÕES, C.M.O. et al. Plantas da medicina popular do Rio Grande do Sul. Porto Alegre: Editora da Universidade, 1996.174p. VILEGAS, J.H.Y. et al. Análise cromatográfica de drogas vegetais supostamente pertencentes ao gênero Dorstenia. Revista de Ciências Farmacêuticas, v.12, p.89-93, 1990.