NOÇÕES DE ESPECTROMETRIA DE MASSA

The world leader in serving science NOÇÕES DE ESPECTROMETRIA DE MASSA José Felipe Lugão felipe.lugao@novanalitica.com.br

Cromatografia Acoplada a Espectrometria de Massa Responde às duas perguntas mais importantes da Química Analítica: O que é? Tempo de Retenção Peso molecular Estrutura molecular Quanto tem? Área cromatográfica Cromatograma Espectro MS

Qual é o espectrômetro de massa ideal?? Entrada de Amostras

Componentes do Espectrômetro de Massa Atmosfera Sistema de Vácuo Entrada da Amostra Ionização Analizador de Massas Detector Sistema de Dados

Espectro X Cromatograma?

Como um Detector de Massa Cria Um Cromatograma? 100 TIC % Se ampliarmos estaregiãodo cromatograma... 50 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 Time

Como um Detector de Massa Cria Um Cromatograma? 100 % TIC Veremos que nesta escalao picoé feito por pontos discretos... 78 2.12 2.14 2.16 2.18 2.20 2.22 2.24 2.26 2.28 Time

Como um Detector de Massa Cria Um Cromatograma? 100 % Cada ponto representa uma única varredura (espectro) do analisador de massa... 240 241 0 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300

Como um Detector de Massa Cria Um Cromatograma? Cadapontodo cromatograma possuium espectro único

Como um Detector de Massa Cria Um Cromatograma? TIC -Cromatograma produzido pela soma do sinal de todas as massas observadas a cada varredura... espectro

TIC x RIC (Cromatograma de Massa Reconstruído) C:\Documents and Settings\...\PPB006 30/9/2008 08:02:25 Relative Abundance 80 60 40 20 RT: 27,83 RT: 28,16 RT: 26,13 RT: 28,41 RT: 26,82 0 26 27 28 29 30 31 32 Time (min) TIC RT: 29,60 RT: 30,43 NL: RT: 31,66 1,68E8 TIC MS ICIS RT: 30,93 PPB006 Relative Abundance 80 60 40 20 RT: 27,83 RT: 28,16 RT: 26,13 RT: 28,41 RT: 26,82 0 26 27 28 29 30 31 32 Time (min) TIC RT: 29,60 RT: 30,43 NL: RT: 31,66 1,68E8 TIC MS ICIS RT: 30,93 PPB006 Relative Abundance 100 50 0 RT: 28,35 NL: 27,18 NL: 4,24E6 100 RT: 28,41 2,33E7 26,13 m/z= m/z= 31,66 27,83 RIC 93 93,11-94,11 RIC 161 159,55- MS PPB006 163,26 MS 29,06 30,91 50 27,88 29,60 PPB006 26,30 27,20 28,95 27,35 29,06 29,85 30,43 31,66 26,95 31,10 26,28 30,91 26,82 29,85 30,43 0 26 27 28 29 30 31 32 26 27 28 29 30 31 32 Time (min) Time (min) Relative Abundance Relative Abundance 100 50 0 69,01 93,01 94,03 161,07 133,03 204,11 207,12 258,88 280,44 340,84 385,77 413,66 439,50 50 100 150 200 250 300 350 400 450 m/z Relative Abundance 100 50 0 105,01 81,01 133,04 161,07 204,11 189,08 207,13 281,12 327,36 385,52 440,36 50 100 150 200 250 300 350 400 450 m/z

Modos de Ionização API CI EI Ionização Sem fragmentos Com Fragmentos

Fontes de Íons GC/MS CI EI LC/MS ESI APCI Ion Volume Removível Coluna Filamento e - e - e - + + + Lentes

Espectro EI M + e - M.+ + 2e - + fragmentos Pico Base Ion Molecular

Fonte de Íons 100,000 Molecular Weight 1000 EI/CI APCI ESI Non-Polar Polar

ESI

APCI

Analizadores de Massa Quadrupolo Triplo Quadrupolo Ion Trap 3D Ion Trap Linear Ion Ciclotron Time Of Flight Setor Magnetico Orbitrap Híbridos...

The world leader in serving science GC/MS QUADRUPOLO

Quadrupolo + + Os íons são varridos pela variação das voltagens DC/RF aplicadas às barras do quadrupolo.

Quadrupolo + + Os íons são varridos pela variação das voltagens DC/RF aplicadas às barras do quadrupolo.

Full Scan X SIM CHBr3 Full Scan SIM (173)

Full Scan + SIM na mesma corrida SIM: Análise de traços de compostos alvos Full Scan: Espectro de massa para identificação de desconhecidos e confirmação dos alvos encontrados Exemplo: 14 Pesticidas EI, Full Scan + SIM Matriz: Morango/Espinafre/Pera

Método Full Scan + SIM

Método Full Scan + SIM

GCMS Quadrupolo EI Full Scan + SIM Raw RT: 4.97-33.08 100 5.18 50 8.80 12.09 12.39 21.24 NL: 3.96E7 TIC MS data08 Full Scan 0 100 50 5.18 8.80 12.09 12.39 21.24 NL: 3.96E7 TIC F: + c Full ms [ 50.00-500.00] MS data08 Relative Abundance 3 dos 14 segmentos SIM 0 100 50 0 100 50 0 100 50 11.06 11.35 14.61 21.24 Methiocarb 21.82 NL: 7.57E4 TIC F: + c SIM ms [ 131.50-132.50] MS data08 NL: 2.06E3 TIC F: + c SIM ms [ 224.50-225.50] MS data08 NL: 7.43E3 TIC F: + c SIM ms [ 178.50-179.50, 263.50-264.50] MS data08 Pesticides analysed in strawberry/spinach/pea extract at 5 pg/µl, 2ul injection 0 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 Time (min)

GC/MS Quadrupolo (ISQ) Sensibilidade Turbo 70L/s, EI Full Scan 1pg OFN RT: 3.50-4.50 100 95 RT: 3.92 AA: 321 AH: 406 m/z 272 S/N 27:1 NL: 1.28E3 TIC MS ICIS 500_ag 90 85 80 75 70 65 60 m/z 272 S/N > 600:1 Relative Abundance 55 NCI, SIM 500 ag OFN (5 x 10E-16g)

ISQ Aplicação: Poluentes Semivoláteis em Águas 120 Compostos 20 minutos 1uL, Split 1:20 Average IDL = 0,023 ng/ul (~20pg on column) Working Range: 0.05 to 200 ng/ul

ISQ Aplicação: Poluentes Voláteis em Águas EPA 524.3 84 compostos 18 min 5 ml amostra 30:1 split Average IDL = 0,035 ug/l (~5pg on column) Working Range: 0.05 to 200 ng/ul

Cocaína em Urina (3) (1) (4) (2) 1 3 4 2

Aplicação ISQ Toxicologia

The world leader in serving science MS/MS ION TRAP E TRIPLOQUADRUPOLO Isolando a Matriz

?!

GC/MS Organofosforado

MS/MS

GC/MS/MS Ion Trap Organofosforado 251 > 169

MS/MS Análise de composto-alvo Coeluição de muitos picos Matriz interferente Confirmação

Caracterização Estrutural MS/MSn continua sendo necessário e complementar à informação de massa exata Esta informação coletivamente define a estrutura da molécula

Fragmentação por LC/MS/MS Cromatograma ESI Full Scan MS [MH] + ESI Full Scan MS/MS

Ion Trap

Ion Trap Linear

Why Linear (2D) Ion Traps? A technology evolution based on basic principles 3-Dimensional vs. 2-Dimensional RF Quadrupole Ion Trap

Trapping Efficiency (Effect of RF Phase) 760 khz Successful Trapping of Injected Ions ~ 5% 1.2 MHz, 5kV ~ 70%

Ion Ejection 2D vs 3D Ion Transfer Tube Skimmer Tube Lens

Radial Detection ~ High Sensitivity Linear Ion Trap ~ 100% of ions trapped are detected due to radial ejection Skimmer Axial ejection allows for hybridization without compromise (FT)! Hybrid Quadrupole Trap Majority of trapped ions cannot be scanned out ~ 15% detected* *Hager, J., RCM., 2003, 17, 1389 Axial ejection depends on fringe fields generated by grid this grid compromises triple quadrupole performance

Ion Trap Linear x 3D LTQ 3D Traps Increase Trapping efficiency Detection efficiency Trapping capacity ~ 55-70% ~5% ~ 11-14x ~ 50-100% ~50% ~ 1-2x ~ 20,000 ions ~500 ions ~ 40x

Exemplo MS/MSn Flavonóide

Exemplo MS/MSn Flavonóide Rhoifolin

Ion Trap - Aplicações

Triploquadrupolo

Fragmentando moléculas de mesma massa + 100 60 40 + 100 80 20

Triploquadrupolo TSQ GC/MS/MS & LC/MS/MS NPAMOZ LANAGRO 0,025 ppb 0,250 ppb 2,0 ppb C:\Xcalibur\...\231106\NPF_36 23/11/2006 14:21:13 2.0ng/mL NPFs/NPAHD3.0ng/mL ACE 3 C18 50 X 2 Acetato NH40.5mM/MeOH(50;50) 200uL/min. RT: 0,00-9,00 SM: 7G RT: 1,99 SN: 128 8000 7500 7000 NL: 8,01E3 m/z= 290,50-291,50 F: + c sid=-10,00 SRM ms2 335,10@-12,00 [ 262,00-291,00] MS NPF_39 RT: 0,00-9,00 SM: 7G RT: 1,99 SN: 1154 60000 55000 NL: 6,30E4 m/z= 290,50-291,50 F: + c sid=-10,00 SRM ms2 335,10@-12,00 [ 262,00-291,00] MS NPF_33 RT: 0,00-9,00 SM: 7G RT: 1,96 SN: 8257 460000 440000 420000 400000 NL: 4,64E5 m/z= 290,50-291,50 F: + c sid=-10,00 SRM ms2 335,10@-12,00 [ 262,00-291,00] MS NPF_36 6500 6000 5500 50000 45000 380000 360000 340000 320000 5000 40000 300000 280000 4500 35000 260000 Intensity 4000 Intensity 30000 Intensity 240000 220000 3500 200000 3000 2500 25000 20000 180000 160000 140000 2000 1500 1000 15000 10000 120000 100000 80000 60000 500 5000 40000 20000 0 2 4 6 8 0 2 4 6 8 0 2 4 6 8 Time (min) Time (min) Time (min) 330 pesticidas em alimentos

Aplicações Triploquadrupolo

Multiresíduo 32 pesticidas, 10ng/mL Spike em Água

Amostra Real Extrato Vegetal?????????? Bitertanol Iprodione

Elemental composition Calculations for : 250 amu monoisotopic mass C 12.0000-1 to 20 H 1.0078-0 to 60 N 14.0030-0 to 10 O 15.9949-0 to 10 S 31.9720-0 to 5 Cl 34.9688-0 to 5 35000 30000 25000 Isolation Window +-2 amu = 30.562 +-1 amu = 15.278 +-0.5 amu = 7.632 +-0.2 amu = 3.704 +-0.1 amu = 2.564 30562 20000 15000 10000 5000 0 15278 7832 2564 3704 0,1 0,2 0,5 1 2

SRM with Unit Resolution Q3 Q1 Q2 256.3 408.6 408.1 256.2 1 Da 1 Da

Improved Selectivity in H-SRM Mode Q3 Q2 Q1 256.3 408.6 1 Da 408.1 0.2 Da

Iprodione

Bitertanol

MS/MS Triploquadrupolo Análise de Composto Alvo

Benefícios e Limitações da Técnica SRM Triploquadrupolo Benefícios: Baixos limites de detecção são alcançados Excelente quantificação Robustez Limitações: Apenas compostos alvos podem ser analisados Não permite novos resultados após a aquisição Limitado número de compostos por corrida Não é possível buscar compostos desconhecidos

The world leader in serving science Orbitrap: A new class of Mass Spectrometer

Resolução

Resolução

Exact Mass and Isobaric Compounds Element Exact Mass H 1.007825 C 12.000000 N 14.003074 O 15.994915 Is a simultaneous measurement possible? 0.1033 amu Relative Abundance 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 289.1424 289.1390 289.1022 289.1314 289.1329 289.1547 289.0514 288.0441 C9H21O2P1S3 Terbufos 288.0949 C13H21O3P1S1 Iprobenfos 289.0514 288.1142 C15H17N4Cl1 Myclobutanil 288.1256 C11H20N4O3S1 Epronaz 289.0513 289.1021 289.1022 289.1329 289.1424 288.1351 C11H21N4O3P1 289.1215 Pirimethaphos 288.1474 C16H20N2O3 Imazamethabenz R = = 100,000 10,000 20,000 289.1215 289.1329 289.1424 289.1215 0 289.00 289.05 289.10 289.15 289.20 m/z Yes, at high resolution!

Resolução e Massa Exata Exatidão de Massa (ppm) = 10 6 X (Mm Mr) / Mr 1 ppm = 200.0000 +- 0,0002 m/z Resolução = M / (M2 M1) 100.000 FWHM @ 200 m/z = 0,002 m/z 250.000 250.005 199,99 m/z 200 m/z

Standard Pesticide Mixture in Horse Feed Matrix Unusually high error of 6.5 ppm indicates the need for higher resolution Reanalysis at 80,000 resolving power 100 239.15181 C11 H 19 O 2 N4 6.50 ppm Relative Abundance 80 60 40 20 R = 15,000 Error = 6.50 ppm 0 239.00 239.05 239.10 239.15 239.20 239.25 m/z Relative Abundance 100 80 60 40 20 239.15033 C 11 H 19 O 2 N 4 0.32 ppm R = 80,000 Error = 0.32 ppm 0 239.00 239.05 239.10 239.15 239.20 239.25 m/z

Quadrupole Orbitrap (Qexactive) 140.000 FWHM 1 3 ppm MS/MS

Lord of the ion rings: Retainment of the rings ω = k m / z Frequencias são convertidas em m/z utilizando transformada de Fourier

Lord of the ion rings: Retainment of the rings ω = k m / z Frequencias são convertidas em m/z utilizando transformada de Fourier

Aplicação Exactive

510 Pesticides Exactive

RIC (1 ppb)

Multiresíduos por LC-Full Scan MS Targeted Screening Análise Pós-Aquisição Busca por compostos-alvos Screening Pesticidas Drogas Veterinárias Hormônios Toxinas Poluentes Orgânicos Persistentes PCBs Etc, Confirmação Distribuição Isotópica Full Scan MS/MS Sample(s) Database(s) Result(s)

Relative mass errors at different resolving power settings of 151 compounds at the 25 ppb level in horsefeed and honey matrix.

Conclusion Minimum 70,000 resolution is required Mass Accuracy Should Cross the Peak (not by averaging)

Orbitrap Análise Antidoping

QEXACTIVE - Quanfirmation Azoxystrobin 1.5ppb RT: 0.00-18.00 Relative Abundance 100 0 100 0 100 0 100 0 100 0 100 0 2.64 Quantitation 7.32 7.68 7.99 10.01 9.70 Diuron Azoxystrobin Boscalid Methomyl Spinosad D Indoxacarb 0 5 10 15 Time (min) NL: 2.39E7 m/z= 233.0231-233.0255 F: FTMS + p ESI Full ms [100.00-1000.00] MS cal5_02 NL: 6.40E6 m/z= 404.1221-404.1261 F: FTMS + p ESI Full ms [100.00-1000.00] MS cal5_02 NL: 2.18E6 m/z= 343.0382-343.0416 F: FTMS + p ESI Full ms [100.00-1000.00] MS cal5_02 NL: 5.99E6 m/z= 163.0528-163.0544 F: FTMS + p ESI Full ms [100.00-1000.00] MS cal5_02 NL: 1.02E6 m/z= 746.4801-746.4875 F: FTMS + p ESI Full ms [100.00-1000.00] MS cal5_02 NL: 5.03E6 m/z= 528.0754-528.0806 F: FTMS + p ESI Full ms [100.00-1000.00] MS cal5_02 RT: 7.50-7.90 Relative Abundance 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Number of scans across a peak doing MS/MS 7.69 NL: 3.88E6 TIC F: FTMS + p ESI Full ms2 404.02@hcd40.00 [50.00-430.00] MS cal5_02 7.55 7.60 7.65 7.70 7.75 7.80 7.85 7.90 Time (min) cal5_02 #1739 RT: 7.69 AV: 1 NL: 7.33E5 F: FTMS + p ESI Full ms2 404.02@hcd40.00 [50.00-430.00] 100 90 80 Azoxystrobin MH+ = 404.1242 329.0806 344.1041 Confirmation Relative Abundance 70 60 50 40 30 372.0992 20 10 0 183.0560 216.0665 301.0852 316.1092 134.0606 172.0399 273.0899 287.0824 107.0499 129.0454 187.0509 71.2217 82.0298 226.8040 242.0326 386.1146 401.8168 420.7813 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 m/z

Q Exactive Full Scan Quan (Azoxystrobin at 1.5ppb) Direct comparison of neat vs matrix

Q Exactive Quantitation Full Scan Targeted DD MS/MS (Azoxystrobin at 1.5ppb) Direct comparison of neat vs matrix

Melamine-Tainted Milk Scandal

SIEVE Workflow

Unalign vs Align Unaligned Aligned

Incurred Orange Sample - Navel

Incurred Orange Sample - Navel Imaverol

Isotope Ratio Actual vs. Simulation Mass Accuracy 0.454 ppm Imaverol Actual Simulation

Obrigado www.planetorbitrap.com felipe.lugao@novanalitica.com.br