SELEÇÃO DE BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS DE PLANTAS DE ARROZ IRRIGADO NO ESTADO DO TOCANTINS Patrícia Verdugo Pascoal¹, Raimundo Wagner de Souza Aguiar² 1 Aluna do Curso de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia; Campus de Gurupi; e-mail: verdugopaty@uft.edu.br. PIBIC/UFT 2 Orientador do Curso de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia; Campus de Gurupi; e-mail: rwsa@uft.edu.br RESUMO A cultura do arroz está classificada entre as dez principais culturas agrícolas do Brasil, ocupando lugar de destaque mundial em área cultivada. A planta de arroz possui um complexo de insetos-praga, cujos danos provocados pelos mesmos podem variar de uma região para outra, sendo que os gastos necessários para o controle podem chegar a até 25% do custo da produção. A descoberta de novos micro-organismos e seus bioprodutos, além do desenvolvimento de variedades de plantas com resistência a pragas e/ou doenças são alternativas de controle que podem se tornar mais eficazes, minimizando os danos ao meio ambiente. O desenvolvimento deste projeto contribuiu para criação de uma nova linha de pesquisa na instituição, com identificação de enzimas e análises moleculares, permitindo assim o desenvolvimento de possíveis produtos de uso biotecnológico e a geração de novas tecnologias que visam o controle de doenças e pragas com aplicação agrícola, principalmente, para a cultura do arroz desenvolvida no estado do Tocantins. Palavras-chave: bactérias endofíticas, controle biológico, atividade enzimática, antagonismo de fungos, perfil genético. INTRODUÇÃO As bactérias endofíticas são capazes de interferir no estado de defesa das plantas hospedeiras por indução de resistência sistêmica, produção de compostos antimicrobianos ou por produção de enzimas e outros metabólicos que interferem no desenvolvimento do insetopraga (PRAKAMHANG, J. et al., 2009; AKELLO et al., 2007;). Diversos trabalhos evidenciam que algumas proteínas de defesa são acumuladas em altos níveis nos tecidos da planta pela presença de bactérias endofíticas, e essa alteração fisiológica possui atividade inibidora direta sobre insetos-praga e fitopatógenos, podendo assim reduzir o ataque dos mesmos (WANG, H. et al., 2009; SHI, J. et al., 2010. O potencial biotecnológico de muitas dessas proteínas relacionadas à defesa foi demonstrado por meio da introdução dessas proteínas Página 1
em plantas de interesse. Hoje existe uma enorme lista de plantas geneticamente modificadas resistentes a pragas, sendo muitas delas comercializadas. 2 MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Coleta: área de cultivo e material vegetal Para a efetivação do isolamento e representação da diversidade de bactérias, as amostras foram coletadas no município de Formoso do Araguaia TO, em áreas de várzea cultivadas com arroz. 2.2 Isolamento de bactérias endofíticas de arroz O isolamento da comunidade bacteriana endofítica foi realizado utilizando-se as partes vegetativas amostradas (raízes, ramos e folhas) de arroz. As quais foram fragmentadas em pedaços ( 1g) e submetidas a tratamento asséptico. -Os fragmentos desinfestados superficialmente foram triturados em tampão PBS. A suspensão obtida, juntamente com os restos vegetais, foi transferida para tubos Falcon e mantida em agitação por 1 hora a 120 rpm. 2.3 Determinação da atividade enzimática 2.3.1 Pectinase Todos os isolados foram avaliados quanto a sua atividade pectinolítica. A presença da pectinase foi identificada pela presença de um halo esbranquiçado em redor da colônia. 2.3.2 Celulase Os isolados foram semeados em placas de Petri contendo o meio CMC 1%. A atividade celulolítica foi evidenciada pelo surgimento de um halo amarelo ao redor das colônias. 2.3.3 Protease Os isolados foram semeados sobre o meio de cultura específico para esta enzima. Após a inoculação dos isolados foi adicionado ao meio 100 ml de leite desnatado, previamente esterilizado. As placas foram incubadas a 28ºC por cerca de 4 dias. A formação de um halo ao redor das colônias indicará a atividade proteolítica.. 2.4 Triagem dos melhores isolados e identificação pelo gene 16S DNAr Página 2
Os isolados com melhores resultados quanto ao caráter tóxico por ação antagônica e produção de compostos com propriedades biotecnológicas foram selecionados para posterior identificação a partir do gene 16S DNAr. 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Isolamento de bactérias endofíticas de arroz. O isolamento foi efetuado com sucesso, gerando 54 isolados. Após o isolamento dos micro-organismos e posterior plaqueamento, foi possível caracterizá-los morfologicamente, sendo a maioria pertencente ao gênero Bacillus, por possuírem colônias com bordas não uniformes, coloração branca e fosca. 3.2 Determinação da atividade enzimática Todos os 54 isolados foram submetidos aos ensaios enzimáticos. A formação do halo é resultado do consumo do meio de cultura específico para cada enzima. A tabela 1 demonstra a relação dos isolados com atividade enzimática positiva. Tabela 1 Relação dos isolados com atividade enzimática positiva (+) e negativa (-) e média das medidas dos respectivos halos enzimáticos Isolado Protease Celulase (exocelulase) Pectinase Média do halo enzimático (triplicata) (cm) Protease Celulase Pectinase 6-P + - - 2,81 - - 8-P + - - 2,63 - - 12-P - - + - - 2,52 14-P + - + 3,27-0,14 16-P + - - 4,13 - - PVP-3 + - - 3,72 - - PVP-4 + - - 5,34 - - PVP-6 + - - 3,55 - - PVP-13 + - - 3,43 - - PVP-17 + - - 4,54 - - PVP-21 + - - 0,37 - - PVP-23 + - - 0,44 - - 2 A.C - + - - 0,12-4 A.C - + - - 0,09-4 V A.C + - - 1,12 - - 5/A.C - + - - 0,20-6/A.C - + - - 0,15-8 A.C + + - 4,05 0,17 - Página 3
8/A.C + - 2,75 - - 9/A.C + + - 4,65 0,47-10 A.C + + - 4,2 0,26-12 A.C + - - 4,91 - - 13/ A.C + - - 4,68 - - Na figura 1 foi possível observar os halos formados nas placas com meio para protease e celulase, respectivamente. A proposta deste estudo visou avaliar qualitativamente a atividade enzimática dos isolados. Figura 1 (a) Melhores isolados com atividade proteolítica, presença de halos translúcidos e (b) Melhores isolados com atividade celulolítica, presença de halos amarelo fosco. 3.3 Triagem dos melhores isolados Todos os isolados foram submetidos a testes de confronto direto contra fungo da espécie Bipolares sp., fitopatógeno da própria planta de arroz. As placas foram incubadas a 28ºC por 5 dias, todo o experimento foi realizado em triplicata e como controle o fungo sem a suspensão bacteriana. (a A figura 2 mostra os melhores resultados no teste de confronto direto contra o fungo. 6 isolados tiveram ação antagônica contra a espécie Bipolares sp. ( Figura 2 Teste de confronto direto demonstrando 6 isolados, à esquerda, com capacidade de inibir o crescimento do fungo Bipolares sp., e à direita, controle em triplicata. Este teste, assim como os testes enzimáticos são qualitativos, com o intuito de conhecer a capacidade de bactérias endofíticas em inibir o crescimento de fungos fitopatógenos. Página 4
Identificação pelo gene 16S DNAr Em relação aos processos de caracterização pela técnica de biologia molecular, através da extração de DNA, a mesma foi efetuada com sucesso mostrando o perfil de todas as 54 bactérias isoladas, segundo a figura 4. Para identificar todos os isolados, é necessária a amplificação do material genético de cada isolado pela técnica de PCR e enviar as amostras para sequenciamento o qual identificará especificadamente cada isolado. Figura 3 Gel da extração de DNA dos isolados, primeiro poço REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA AKELLO, J., DUBOIS, T., GOLD, C.S., COYNE, D., NAKAVUMA, J. AND PAPARU, P. Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin as and endophyte in tissue culture banana (Musa spp.). J. Invertebr. Pathol.v.96, p.34-42, 2007. PRAKAMHANG, J., MINAMISAWA, K., TEAMTAISONG, K., BOONKERD, N., TEAUMROONG, N. The communities of endophytic diazotrophic bacteria in cultivated rice (Oryza sativa L.). Applied Soil Ecology, v. 42, p.141-143, 2009. SHI, J., LIU, A., LI, X., FENG, S., CHEN, W. Inhibitory mechanisms induced by the endophytic bacterium MGY2 in controlling anthracnose of papaya. Biological Control, v. 56, p. 2-4, 2010. WANG, H., WEN, K., ZHAO, X., WANG, X., LI, A., HONG, H. The inhibitory activity of endophytic Bacillus sp. strain CHM1 against plant pathogenic fungi and its plant growthpromoting effect. Applied Soil Ecology, v. 28, p. 634-635, 2009. AGRADECIMENTOS O presente trabalho foi realizado com o apoio da UFT. Página 5