Scott et al. Parasites & Vectors (017) 10:390 DOI 10.1186/s13071-017-34-0 Parasites & Vectors PESQUISA Eficácia de sarolaner (Simparic ) contra infestações induzidas de Amblyomma cajennense em cães acesso público Fabio Scott 1, Lilian Franz *, Diefrey Ribeiro Campos 1, Thaís Ribeiro Correia Azevedo 1, Daise Cunha, Robert H. Six 3, Steven Maeder 3 e Travis Cree 3 Resumo Introdução: Amblyomma cajennense é o principal vetor de Rickettsia rickettsii, que causa a febre maculosa brasileira. Este carrapato adulto infesta com predileção cavalos e capivaras, porém apresenta pouca especificidade para hospedeiros durante seus estágios imaturos, desta maneira impondo uma ameaça aos seres humanos e cães. Neste estudo, a eficácia de sarolaner (Simparic /Simparica, Zoetis) administrado oralmente aos cães uma única vez a uma dose de mg/kg foi avaliada em relação a infestações induzidas de ninfas de A. cajennense por até 35 dias após o tratamento. Métodos: Com base nas contagens de carrapatos pré-tratamento, 0 cães foram aleatoriamente designados ao grupo de tratamento com sarolaner (Simparic ) a uma dose de mg/kg de peso corporal ou ao grupo placebo no Dia 0 do estudo. Foram realizadas infestações artificiais utilizando ninfas de A. cajennense cultivadas em laboratório nos dias -, 5, 1, 19, 6 e 33 do estudo. A eficácia foi determinada em 48 horas após o tratamento ou após a infestação em cada ponto de tempo em comparação às contagens dos cães que receberam placebo. Resultados: Não foram observadas reações adversas ao tratamento. Uma única dose de sarolaner (Simparic ) proporcionou % de eficácia nos dias, 7 e 14 do estudo; e 99,6% nos dias 1, 8 e 35. As médias geométricas das contagens de carrapatos vivos no grupo de sarolaner foram significativamente menores do que as do grupo placebo em todos os dias (P < 0.0001). Conclusões: Sob as condições do presente estudo, sarolaner (Simparic ) administrado a uma dose única de mg/kg proporcionou % de eficácia contra infestações existentes e 99,6% de eficácia em 48 horas contra desafios semanais de A. cajennense por pelo menos 35 dias após o tratamento. Descritores: Amblyomma cajennense, Febre maculosa brasileira, Cão, Eficácia, Isoxazolina, Oral, Rickettsia rickettsii, Sarolaner, Simparic, Simparica, Carrapato. Introdução Amblyomma cajennense ou carrapato estrela é uma espécie de carrapato ixodídeo de três hospedeiros e de pouca especificidade de hospedeiro durante seus estágios imaturos. Esta espécie é o principal vetor de Rickettsia rickettsii, que causa a febre maculosa brasileira, também conhecida como febre maculosa das montanhas rochosas (FMMR) [1]. Outras espécies de carrapatos, como o Rhipicephalus sanguineus (sensu lato) [] e Amblyomma aureolatum [3], já foram identificados como estando possivelmente envolvidos no ciclo de transmissão, porém em menor grau. O agente da FMMR, a R. rickettsii, é altamente virulenta tanto para os seres humanos quanto para os cães [4]. Vários casos de infecções humanas foram precedidos por FMMR em cães nos Estados Unidos [4 6], enquanto quatro óbitos de humanos foram relatados no estado do Espírito Santo, em 1991 [7]. * Autora correspondente: lilian.franz@zoetis.com Zoetis, Veterinary Medicine Research and Development, Rua Luiz Fernando Rodriguez, Campinas, SP 1701, Brasil A relação completa de informações dos autores está disponível no final deste artigo A sorologia de cães saudáveis no Brasil indica infecções prévias por R. rickettsii [3, 8] e tem ajudado a identificar várias áreas endêmicas no país. A prevalência estimada de anticorpos contra R. rickettsii em cães variou de 4,1 a 64% [9] tendo demonstrado aumentar com a idade [10]. A baixa especificidade do teste sorológico impede uma estimativa epidemiológica mais precisa. Algumas das áreas endêmicas no Brasil, de onde R. rickettsii foi isolada do carrapato A. cajennense, incluem os estados de Minas Gerais [1], São Paulo [11], Bahia, Goiás, Rio Grande do Sul [1] e Espírito Santo [7]. Cães infectados com R. rickettsii podem apresentar sinais clínicos não específicos, incluindo febre, depressão, anorexia, lesões oculares, petéquias hemorrágicas, anemia e trombocitopenia [13]. Todos estes sinais também estão presentes na erliquiose monocítica canina (EMC) causada por outro agente (Ehrlichia canis). Portanto, vários casos clínicos de febre maculosa brasileira podem estar sendo diagnosticados incorretamente como EMC [4]. Os Autores. 017 Acesso Público Este artigo é distribuído de acordo com os termos da Licença Internacional Creative Commons Attribution 4.0 (http://creativecommons.org/ licenses/by/4.0/), que permite seu uso, a distribuição e reprodução irrestritos em qualquer meio, desde que o devido crédito seja dado ao(s) autor(es) original(is) e à fonte, seja fornecido um link para a licença Creative Commons, e que se indique se foram efetuadas alterações. A renúncia do Creative Commons Public Domain Dedication (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) se aplica aos dados disponibilizados neste artigo, a menos que declarado em contrário.
Scott et al. Parasites & Vectors (017) 10:390 Página de 5 O estágio adulto do A. cajennense preferencialmente se alimenta do sangue de cavalos e capivaras (Hydrochoerus hydrochaeris) [14]. Com a aceleração da urbanização, estes animais silvestres são encontrados em vários ambientes não rurais, adaptando-se facilmente e impactando a biologia e a ecologia dos vetores artrópodes, aumentado o risco de exposição de cães a patógenos transmitidos por vetores [15]. O ciclo de vida do A. cajennense tem duração de um ano, com picos populacionais em estações distintas no Brasil, sendo que as larvas são mais comumente encontradas de março a julho. O estágio de ninfa é encontrado frequentemente durante os meses de julho a outubro, enquanto que as formas adultas são mais comuns durante os meses mais quentes, entre setembro e março [16]. As larvas de A. cajennense podem ficar sem se alimentar por 6 meses no ambiente e, quando aderidas a um hospedeiro, elas se alimentam por aproximadamente 5 dias e deixam o hospedeiro em busca de abrigo no solo para então se transformarem em ninfas. Isto pode levar 5 dias, mas pode durar até 1 ano. Depois de encontrar seu segundo hospedeiro, este estágio se alimenta por 5 a 7 dias, e então deixa o hospedeiro para passar por sua segunda muda. A forma adulta fica no hospedeiro por aproximadamente 10 dias, e então a fêmea ingurgitada se solta para botar de 5 a 8 mil ovos e iniciar uma nova geração [17]. A transmissão de R. rickettsii pode ser transovariana e transestadial. Isto permite que o carrapato permaneça infectado pela bactéria durante toda a sua vida e a transmita para as próximas gerações [1]. O controle efetivo de A. cajennense em cães é vital devido a vários aspectos de seu ciclo biológico e seu papel em doenças potencialmente fatais, como a febre maculosa brasileira. A maioria dos produtos de controle de carrapatos em cães está disponível na apresentação tópica, na forma de coleira, xampu, banho de imersão ou aplicações tipo spoton. Recentemente, algumas alternativas orais também foram introduzidas, potencialmente trazendo mais conveniência para o proprietário do cão, levando a uma maior adesão ao tratamento. Sarolaner é um acaricida e inseticida que pertence ao novo grupo das isoxazolinas, disponível na forma de comprimido mastigável (Simparic, São Paulo, Brasil). Ele inibe a função dos receptores do neurotransmissor ácido gama-aminobutírico (GABA) e dos receptores de glutamato, agindo na junção neuromuscular em carrapatos e pulgas, e, desta forma, proporcionando excelente controle de pulgas e carrapatos por pelo menos 1 mês após uma dose única oral [18]. Simparic provou ser eficaz contra uma ampla variedade de carrapatos encontrados ao redor do mundo [18 3]. Nenhum estudo havia sido conduzido anteriormente para avaliar a eficácia de sarolaner contra infestações de A. cajannense em cães. O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia de sarolaner contra infestações existentes de A. cajannense e re-infestações semanais por um período de 5 semanas após o tratamento com uma dose única. Métodos Este foi um estudo laboratorial mascarado, de controle negativo, randomizado e de comparação de eficácia conduzido no Laboratório de Quimioterapia Experimental em Parasitologia Veterinária (LQEPV) da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, no Brasil. Os procedimentos do estudo estavam de acordo com as diretrizes da Associação Mundial para o Avanço da Parasitologia Veterinária (WAAVP, na sigla em inglês) para a avaliação da eficácia de antiparasitários para o tratamento, prevenção e controle de infestações de pulgas e carrapatos em cães e gatos [4], e obedeceram aos princípios das Boas Práticas Clínicas [5]. O mascaramento do estudo se deu através da segregação de funções. Todas as pessoas que conduziam as observações ou que cuidavam dos animais ou realizavam as infestações e contagens eram mascaradas quanto à designação do tratamento. Animais Vinte cães da raça beagle (10 machos e 10 fêmeas) de 10 meses a 7 anos de vida e pesando entre 8 e 15 kg foram incluídos no estudo. Cada cão foi identificado com um transponder eletrônico e submetido a um período de retirada de no mínimo 60 dias para garantir que não restasse nenhuma eficácia ectoparasiticida residual de qualquer tratamento anterior. Os cães foram alojados em canis externos individuais com paredes e chão de cimento em cumprimento às diretrizes aceitas de bem-estar animal, garantindo a impossibilidade de contato direto entre os cães. Os cães foram aclimatados a estas condições por pelo menos 14 dias antes do tratamento. Os cães eram alimentados com ração de manutenção apropriada seca de marca comercial durante todo o período do estudo. Água estava disponível ad libitum. Todos os cães passaram por exames físicos para garantir que estivessem gozando de boa saúde no momento da admissão e que eram adequados para inclusão no estudo. Observações de saúde em geral eram realizadas pelo menos uma vez ao dia durante todo o período do estudo. Desenho O estudo seguiu um desenho completo em blocos randomizados. Vinte cães foram classificados de acordo com suas contagens de carrapatos pré-tratamento no Dia - em blocos de, e, dentro de cada bloco, os cães foram aleatoriamente alocados ao tratamento com placebo ou sarolaner, resultando em 10 cães em cada grupo de tratamento. Os cães foram infestados com carrapatos dias antes do tratamento, e semanalmente subsequentemente, nos dias 5, 1, 19, 6 e 33. As contagens de carrapatos eram conduzidas 48 h após o tratamento ou reinfestação contando-se os carrapatos vivos presentes nos Dias, 7, 14, 1, 8 e 35. Tratamento Os animais foram pesados no Dia - a fim de determinar a dose adequada a ser administrada. No Dia 0, os cães alocados ao grupo T01 receberam placebo, enquanto que os cães
Scott et al. Parasites & Vectors (017) 10:390 Página 3 de 5 do grupo de tratamento T0 receberam sarolaner. Cada dose foi calculada de forma a fornecer a dose recomendada de mg/kg (variação: a 4 mg/kg). As apresentações dos comprimidos de placebo e sarolaner eram semelhantes para fins de manutenção do mascaramento. Todas as doses foram administradas manualmente para garantir a ingestão da dosagem correta e completa. Cada cão foi observado por vários minutos após a administração da dose para comprovação da ingestão do comprimido e de sua saúde geral em 1, 3, 6 e 4 h após a administração do tratamento. Infestação de carrapatos e avaliação Fêmeas adultas ingurgitadas de A. cajennense foram colhidas de cavalos de pasto no Rio de Janeiro e foram cultivadas em laboratório até que atingissem o número adequado de ninfas para infestação artificial ao longo do período do estudo. As infestações foram realizadas utilizando a forma de ninfa, devido à sua baixa especificidade em relação ao hospedeiro. Cada cão foi infestado com aproximadamente 00 ninfas de A. cajennense. Os cães eram imobilizados por aproximadamente 5 minutos enquanto os conteúdos dos frascos contendo as ninfas vivas não alimentadas eram depositadas em seu dorso. Para adequação do hospedeiro e alocação dos cães no grupo de estudo, este procedimento foi realizado no Dia -7 e a contagem dos carrapatos foi feita no Dia -5. Para avaliar a eficácia contra infestações existentes, os cães foram provocados no Dia - ( dias antes do tratamento). As infestações semanais subsequentes ocorreram nos Dias 5, 1, 19, 6 e 33 do estudo. As contagens de carrapatos foram conduzidas 48 h após o tratamento e 48 horas após cada infestação (ou seja, nos dias 7, 14, 1, 8 e 35 do estudo). Para remoção e contagem dos carrapatos, os cães eram sistematicamente inspecionados de forma que toda a superfície do corpo fosse examinada manualmente e com o auxílio de uma escova de cerdas finas. Cada carrapato era manualmente removido e contado. Se nenhum carrapato fosse encontrado, a busca sistemática continuava por mais 5 minutos. Análise estatística Cada cão individualmente representava uma unidade experimental e o desfecho primário era a contagem de carrapatos vivos. Os dados das contagens de carrapatos vivos pós-tratamento (soltos e aderidos) foram sintetizados com médias aritméticas (MA) e geométricas (MG) por grupo de tratamento e ponto de tempo. As contagens de carrapatos foram transformadas por transformação logarítmica (contagem + 1) antes da análise com o objetivo de estabilizar a variância e normalizar os dados. Através do procedimento PROC MIXED (SAS 9.3, Cary NC), as contagens transformadas eram analisadas utilizando-se um modelo linear misto. Os efeitos fixos eram: tratamento, ponto de tempo e interação entre o ponto de tempo e o tratamento por ponto de tempo. Os efeitos aleatórios incluíam o bloco, interação bloco X tratamento e erro. O teste era bilateral, com nível de significância α = 0,05. A avaliação da eficácia em carrapatos vivos foi baseada no percentual de redução nas médias aritméticas e geométricas das contagens de carrapatos vivos em relação ao placebo, de acordo com as recomendações das diretrizes mais recentes da WAAVP para acaricidas sistêmicos [4], e foi calculada utilizando a fórmula de Abbott: % redução = x contagem média (placebo) - contagem média (tratados) / contagem média (placebo) Resultados e discussão Não ocorreram eventos adversos relacionados ao tratamento durante o estudo. Os cães tratados com placebo mantiveram infestações adequadas de carrapatos durante todo o estudo, com contagens de carrapatos que variaram de 4 a 83 (Tabela 1). Para o grupo tratado com sarolaner, não foi encontrado nenhum carrapato vivo em nenhum dos cães nos Dias, 7 e 14. No Dia 1, um carrapato foi encontrado em um cão; no Dia 8, dois dos 10 cães apresentaram um carrapato vivo cada, e, no Dia 35, três dos 10 cães tinham um carrapato cada. Tabela 1: Média geométrica (aritmética) das contagens de A. cajennense vivos e variações em cães tratados com placebo e sarolaner e percentual de eficácia em relação ao placebo para cães tratados com uma dose única oral de comprimido mastigável de sarolaner a uma dosagem de mg/kg no dia 0 para avaliações realizadas 48 h após o tratamento e após reinfestações pós-tratamento. Dia Média Placebo Variação Sarolaner Cães com carrapato Média % EFICÁCIA Variação Cães com carrapato 48 h após o tratamento 48 h após infestação 47 (49,) 7-73 7 50,5 (51,8) 3-68 14 48, (50,6) 8-73 1 54 (56,) 34-83 0,1 a (0,1) 1/10 9,99 8 53, (56,4) 7-80 0,1 a (0,) /10 7,99 35 51,5 (54,8) 4-78 0, a (0,3) 3/10 6,99 a Média geométrica da contagem de carrapatos vivos significativamente menor do que com placebo (P < 0,0001)
Scott et al. Parasites & Vectors (017) 10:390 Página 4 de 5 Portanto, o percentual de redução da média aritmética das contagens de carrapatos vivos em comparação ao placebo foi de % nos Dias, 7 e 14; 99,9% no Dia 1; 99,7% no Dia 8; e 99,6% no Dia 35. As médias geométricas das contagens de cães no grupo do sarolaner foram significativamente mais baixas (t (14,9) = 38,71, P < 0,0001) do que no grupo do placebo em todos os pontos de tempo (Tabela 1). Até onde sabemos, este foi o primeiro estudo apresentado a avaliar a eficácia de um produto acaricida oral contra A. cajennense em cães. A eficácia observada contra A. cajennense neste estudo - % em 48 h após o tratamento de uma infestação existente, e 99,6% em 48 h após a reinfestação semanal, durante 35 dias é comparável às eficácias relatadas para sarolaner contra outras espécies de carrapatos comumente encontradas em cães. Six et al. [1] demonstraram que sarolaner apresentou 99,6% de eficácia em 48 horas de tratamento e 99,6% de eficácia em 48 horas após reinfestações semanais durante um período de 35 dias contra Amblyomma americanum, Amblyomma maculatum, Dermacentor variabilis, Ixodes scapularis e Rhipicephalus sanguineus. Da mesma forma, Geurden et al. [3] demonstraram que sarolaner apresentou 99,7% de eficácia em 48 h de tratamento e 97,5% de eficácia em 48 h após reinfestações semanais por 35 dias contra Dermacentor reticulaus, Ixodes hexagonus, I. ricinus e R. sanguineus. O presente estudo avaliou a eficácia contra ninfas de carrapatos, já que este é o estágio de A. cajennense que infesta mais comumente os cães. Os estudos relatados por Six et al. [18 ] e Geurden et al. [, 3] avaliaram a eficácia contra carrapatos adultos. É interessante observar que a eficácia demonstrada por sarolaner contra carrapatos adultos foi semelhante à observada contra A. cajennense na forma de ninfa, pelo fato de os estágios imaturos serem geralmente considerados como mais suscetíveis do que os adultos [6]. É necessário um período de adesão e alimentação inicial de pelo menos 4 a 48 horas antes que possa ocorrer a transmissão de vários patógenos transmitidos por carrapatos [7, 8], e, se os carrapatos forem eliminados dentro deste prazo, pode-se prevenir a transmissão [9]. Os prazos de transmissão de patógenos relatados em estudos que avaliaram especificamente a transmissão de R. rickettsii por vetores carrapatos a hospedeiros mamíferos variam consideravelmente [30]. A variação nos prazos de transmissão relatados nestes estudos deve-se mais provavelmente à variabilidade nas condições do estudo específico, como número de carrapatos infectados aplicados, taxa de infecção nos carrapatos aplicados, e status prévio de alimentação dos carrapatos. Contudo, Hayes et al. [31] demonstraram que D. andersonii infectados com R. rickettsii necessitaram de aquecimento a temperaturas elevadas (37 C) por 4 a 48 h, ou mais de 10 h de alimentação com sangue para que a R. rickettsii se tornasse virulenta. Embora estudos com modelos específicos de transmissão de patógenos sejam necessários para confirmação, os dados existentes parecem respaldar o conceito de que a eliminação de A. cajennense em 48 h deve reduzir o risco de transmissão de R. rickettsii em cães. Conclusões Este estudo confirma a eficácia acaricida de sarolaner (Simparic ) contra infestações existentes de A. cajennense após uma dose única oral de mg/kg e a manutenção do controle por até 35 dias após o tratamento. A conveniente apresentação oral mastigável oferece uma valiosa ferramenta para o tratamento de infestações de carrapatos e potencialmente para a prevenção de doenças transmitidas por carrapatos em cães. Abreviações MA: Média aritmética; EMC: Erliquose monocítica canina; GABA: Ácido gama-aminobutírico; MG: Média geométrica; RMSF: Febre maculosa das montanhas rochosas Agradecimentos Os autores gostariam de agradecer a Fundação de Apoio a Pesquisa Científica e Tecnológica da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ), o CNPq e a CAPES pelo fornecimento de recursos em apoio ao Departamento de Parasitologia Animal do Instituto de Veterinária (DPA-IV) da UFRRJ. Financiamento Este estudo foi financiado pela Zoetis, VMRD- Brasil. Disponibilidade de dados e materiais O conjunto de dados que respalda as conclusões deste artigo está incluído no mesmo. Contribuições dos Autores LF, DC, RHS e SM desenvolveram o protocolo do estudo, realizaram a interpretação dos dados e redigiram este trabalho. TC foi o biométrico responsável pelo desenho do estudo e pela análise estatística. FS foi o investigador do estudo. DRC e TRCA participaram da equipe de investigadores e foram os veterinários responsáveis pela condução do estudo. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final. Aprovação do Comitê de Ética O protocolo foi avaliado e aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro anteriormente à sua implementação. Autorização para Publicação Não se aplica. Conflito de Interesse Este estudo foi financiado pela Zoetis, VMRD -Brasil. LF, RHS e TC são atualmente funcionários da Zoetis. DC é um colaborador contratado pela Zoetis. FS foi contratado pela Zoetis como investigador deste estudo. DRC e TRCA fazem parte da equipe de investigadores e foram os veterinários responsáveis pela condução do estudo.
Scott et al. Parasites & Vectors (017) 10:390 Página 5 de 5 Nota do Editor A Springer Nature assume a posição de neutralidade em relação a processos jurídicos referentes a mapas e afiliações institucionais. Detalhes sobre os autores 1 Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias do Instituto de Veterinária da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, DPA-IV-UFRRJ Br 467, Km 7, Seropédica, Rio de Janeiro, Brasil. Zoetis, Veterinary Medicine Research & Development, Rua Luiz Fernando Rodriguez, Campinas, SP 1701, Brasil. 3 Zoetis, Veterinary Medicine Research and Development, 333 Portage St, Kalamazoo, MI 49007, USA. Recebido em: 4 de março de 017 Aceito para publicação em: 4 de agosto de 017 Publicado on-line em: 17 de agosto de 017 Referências 1. Guedes E, Leite RC, Prata MC, Pacheco RC, Walker DH, Labruna MB. Detection of Rickettsia rickettsii in the tick Amblyomma cajennense in a new Brazilian spotted fever-endemic area in the state of Minas Gerais. 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