Georgia Ribeiro Martini

Georgia Ribeiro Martini IMUNOEXPRESSÃO DO LIGANTE DO RECEPTOR DO ATIVADOR DO FATOR NUCLEAR KAPPA B E DA OSTEOPROTEGERINA EM LESÕES CENTRAIS E PERIFÉRICAS DE CÉLULAS GIGANTES Dissertação submetida ao Programa de Pós Graduação em Odontologia, área de concentração Diagnóstico Bucal da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do Grau de mestre em 2017. Orientador: Prof. Dr. Rogério de Oliveira Gondak Coorientadora: Profª. Drª. Elena Riet Correa Rivero Florianópolis 2017

Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor através do Programa de Geração Automática da Biblioteca Universitária da UFSC.

Georgia Ribeiro Martini IMUNOEXPRESSÃO DO LIGANTE DO RECEPTOR DO ATIVADOR DO FATOR NUCLEAR KAPPA B E DA OSTEOPROTEGERINA EM LESÕES CENTRAIS E PERIFÉRICAS DE CÉLULAS GIGANTES Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre e aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós graduação em Odontologia. Florianópolis, 15 de fevereiro de 2017 Banca Examinadora: Profª Izabel Cristina Santos Almeida, Drª. Coordenadora do Curso Prof. Rogério de Oliveira Gondak, Dr. Orientador Universidade Federal de Santa Catarina Prof. Filipe Modolo Siqueira, Dr. Membro Universidade Federal de Santa Catarina

Prof. Filipe Ivan Daniel, Dr. Membro Universidade Federal de Santa Catarina Profª. Grasieli de Oliveira Ramos, Drª. Membro Universidade do Oeste Catarinense

Este trabalho é dedicado à minha amada família pelo carinho e apoio.

AGRADECIMENTOS À Deus por sempre guiar e iluminar meu caminho e me colocar no lugar certo, com as pessoas certas. Aos meus pais, Darley e Marisa por sempre acreditarem nos meus sonhos; eu jamais chegaria ao dia de hoje sem o apoio deles. Ao meu irmão, Rafael, por ser meu exemplo, minha referência, meu muito obrigada por ser um grande incentivador na minha vida acadêmica. À minha cunhada Carolina Mozzini, por toda ajuda e conselhos durante este período. Ao meu noivo, Giovani, pelo amor, carinho e paciência e também pelas palavras de incentivo durante esse período do mestrado, foi fundamental. À família Knolseisen pelo carinho e por compreenderem a minha ausência em muitos momentos importantes. Meus sinceros agradecimentos ao meu orientador Rogério Oliveira Gondak pela dedicação e todos os ensinamentos passados, pela paciência, compreensão, infinita disponibilidade, pela confiança em mim depositada na condução do meu trabalho e pelo incentivo contínuo neste período. À profª Elena, minha coorientadora, por toda atenção e ensinamentos dispensados, pela clareza e objetividade, por estar sempre pronta a me ouvir e esclarecer minhas dúvidas e pela colaboração inestimável neste trabalho. Á profª Liliane, por ser minha referência, obrigada pela oportunidade de trabalhar ao seu lado e por ser a maior incentivadora na superação dos meus limites. Ao prof Filipe Modolo por todo o aprendizado e confiança depositada durante a rotina do laboratório, com toda certeza fez diferença durante este período. Á prof Maria Inês Meurer, por ser meu exemplo de docente, por todos os ensinamentos e a palavras amigas. Aos professores Filipe Ivan Daniel, Felipe Perozzo Daltoé, Inez Beatriz Ratt, Etiene Munhoz, Alessandra Camargo, Rodrigo Alves de Lima, e Marcio Corrêa por compartilharem seus conhecimentos. Aos meus colegas: Emanuely, Jussara, Caroline Zimmerman, Angélica, Fernanda, Rúbia, Mariah, Mariana e Diogo pela amizade e troca de conhecimento. Vocês fizeram esse período mais leve e divertido. As minhas irmãs de coração Luana, Dessana e Maria Hilda por todas as palavras de incentivo e conforto nesse período.

Aos meus amigos que me acompanharam nessa etapa, que compreenderam a minha ausência e torceram pelo meu sucesso. Aos funcionários da Universidade Federal de Santa Catarina por serem sempre solícitos. Á CAPES, Coordenação de Aperfeiçoamento de Nível Pessoal, pela concessão da bolsa de estudos. Á Universidade Federal de Santa Catarina, que pela segunda vez me recebeu, pela oportunidade de ampliar meus conhecimentos através do PPGO. À todos que diretamente ou indiretamente contribuíram para este trabalho, meus sinceros agradecimentos.

Um sonho que se sonha só, É só um sonho que se sonha só, Mas sonho que se sonha junto, é realidade (Raul Seixas)

RESUMO As lesões centrais e periféricas de células gigantes são processos proliferativos não-neoplásicos caracterizados pela presença de numerosas células gigantes multinucleadas, que apresentam características histológicas similares, mas com comportamento clínico distinto. O ligante do receptor ativador kappa-b (RANKL) e a osteoprotegerina (OPG) são importantes proteínas correlacionadas a osteoclastogênese e sua expressão pode estar envolvida na patogênese dessas lesões. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão de RANKL e OPG em lesões periféricas de células gigantes (LPCG) e lesões centrais de células gigantes (LCCG), e quantificar o número de células gigantes multinucleadas (CGM) bem como seus núcleos em cada grupo de lesões. Vinte casos de cada lesão foram selecionados do Laboratório de Patologia Bucal da Universidade Federal de Santa Catarina. A imunoexpressão de RANKL e OPG assim como a contagem de CGM e núcleos foi avaliada com o software Image J 1.45s. Não houve diferença estatística na quantificação de CGM por mm², no entanto, o número de núcleos por CGM foi maior em LCCG (P= 0,010). A expressão de RANKL foi notadamente maior nas LCCG que nas LPCG (P= 0,042). Entretanto, não houve diferença estatística entre as duas lesões na expressão de OPG. Nossos achados demonstraram maior expressão de RANKL e número de núcleos nas LCCG o que pode explicar a diferença de comportamento clínico entre as duas lesões e também a patogênese. Palavras chaves: Imuno-histoquímica. NF-Kappa B. Osteoprotegerina. Células gigantes..

ABSTRACT The central and peripheral giant cell granulomas are non-neoplastic proliferative processes characterized by the presence of numerous multinucleated giant cells having similar histologic features but distinct clinical behavior. The receptor activator of nuclear factor Kappa-B ligand (RANKL), and osteoprotegerin (OPG) are the important proteins correlated to osteoclastogenesis, whose expression may be involved with the pathogenesis of these lesions. The aim of this study was evaluate immunohistochemically the expression of RANKL and OPG in peripheral giant cell granulomas (PGCG) and central giant cell granulomas (CGCG) and quantify the number of multinucleated giant cell (MGC) and their nuclei. Twenty cases of each lesion were selected from the Oral Pathology Laboratory of the Federal University of Santa Catarina. The immunoexpression of RANKL and OPG as well as quantification of MGC and nuclei was performed with the software Image J 1.45s. No statistic difference were found in the quantification of the MGC for mm², however the number of nuclei of the MGC was higher in CGCG (P = 0.010). RANKL expression in CGCG was higher than PGCG (P = 0.042). In contrast, there was no statistic difference between two lesions for OPG expression. Our findings showed a higher expression of RANKL and number of nuclei in CGCG which may explain the difference in the clinical behavior between these lesions and their pathogenesis. Key words: Immunohistochemistry. NF-Kappa B. Osteoprotegerin. Giant cells.

LISTA DE FIGURAS Figura 1- Sistema RANKL/OPG... 32 Figura 2- Microfotografia de LCCG e LPCG e imuno-histoquímica de RANKL e OPG... 55 Figura 3- Proporção dos casos de lesão periférica de células gigantes e lesão central de células gigantes relacionados ao gênero... 57 Figura 4- Localização anatômica dos casos lesão periférica de células gigantes e lesão central de células gigantes... 59 Figura 5- Quantificação de núcleos das CGM de LPCG e LCCG... 61 Figura 6- Análise comparativa da imunoexpressão de RANKL em lesões periféricas e centrais de células gigantes... 63 Figura 7- Correlação positiva entre os imunomarcadores RANKL e OPG em LCCG e PLCG... 65

LISTA DE TABELAS Tabela 1- Características clínicas, microscópicas e imuno-histoquímicas das lesões central e periférica de células gigantes... 53

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ATPS - Aminopropyltriethoxysilene CEPSH - Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos c-fos- Fator de transcrição ativador do complexo de proteína 1 CGM Células gigantes multinucleadas DAB - Diaminobenzidina DP- Desvio Padrão FA Fibroma ameloblástico H&E Hematoxilina e eosina Ig2 Imunoglobulina 2 IL1 Interleucina 1 LCCG Lesão central de células gigantes LPB Laboratório de patologia bucal LPCG - Lesão periférica de células gigantes M-CSF Fator estimulante de colônia de macrófagos MO Mixoma odontogênico NFATc1 Fator nuclear de células T ativadas NF-KB- Fator nuclear kappa B OCIF Fator inibitório da osteoclastogênese OMS Organização mundial de saúde OPG Osteoprotegerina PBS Tampão fosfato salina PTH Paratormônio RANK Receptor fator nuclear kappab RANKL - Ligante do receptor do fator nuclear kappab TOA Tumor odontogênico adenomatóide TOCC- Tumor odontogênico cístico calcificante TOCE Tumor odontogênico calcificante epitelial TCG- Tumor de células gigantes TNF - Fator de necrose tumoral TNFα Fator de necrose tumoral alfa TRAF6 Fator associado ao receptor fator de necrose tumoral UFSC Universidade Federal de Santa Catarina

α Alfa µm Micrômetro LISTA DE SÍMBOLOS

SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO... 25 1.1 LESÃO PERIFÉRICA DE CÉLULAS GIGANTES... 25 1.2 LESÃO CENTRAL DE CÉLULAS GIGANTES... 26 1.3 SISTEMA RANK/RANKL/OPG... 30 1.3.1 RANK... 32 1.3.2 RANKL... 33 1.3.3 OPG... 33 1.4 EXPRESSÃO DE RANKL/OPG EM DOENÇAS ÓSSEAS... 34 2. JUSTIFICATIVA... 37 3. OBJETIVOS... 39 3.1 OBJETIVO GERAL... 39 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 39 4. ARTIGO... 41 5. CONCLUSÕES... 67 REFERÊNCIAS... 69 ANEXO A TERMO CONSUBISTANCIADO DO CEPSH.. 79 APÊNDICE A- METOLOGIA EXPANDIDA... 83 ANEXO B- GUIA DE INFORMAÇÕES DO AUTOR... 87

25 1.INTRODUÇÃO 1.1 LESÃO PERIFÉRICA CÉLULAS GIGANTES (LPCG) A lesão periférica de células gigantes (LPCG) é uma lesão reativa benigna com etiologia e patogenia incerta (Florez-Moreno et al., 2008, Chaparro-Avendano et al., 2005). Em um estudo realizado por Naderi et al. (2012) de 2068 casos de lesões reativas, a LPCG foi a mais prevalente com 30,12%. A lesão pode ocorrer em qualquer idade, sendo mais comum entre a 5º e 6ª décadas de vida (Naderi et al., 2012, Lester et al., 2014). A mandíbula é mais acometida que a maxila (Dayan et al., 1990, Shadman et al., 2009, Motamedi et al., 2007, Lester et al., 2014). Clinicamente a LPCG apresenta-se como um aumento de volume nodular, de inserção séssil ou pediculada, de coloração que varia de rósea, semelhante à mucosa, a vermelho-púrpura e ocorre exclusivamente em gengiva ou rebordo alveolar. A LPCG raramente afeta o osso adjacente, mas em alguns casos pode causar uma erosão superficial ao osso subjacente (Motamedi et al., 2007, Chaparro- Avendano et al., 2005, Salum et al., 2008). A dor não é uma característica comum, a menos que a lesão esteja ulcerada por trauma e/ou se torne infectada (Gandara-Rey et al., 2002, Lester et al., 2014). Para o diagnóstico diferencial da LPCG devem ser incluídos o fibroma ossificante periférico, granuloma piogênico e o fibroma de irritação (Zhang et al., 2007). A LPCG não é considerada uma neoplasia verdadeira e sim uma lesão reativa que tem sua origem do ligamento periodontal e mucoperiósteo do rebordo alveolar, decorrente de uma irritação ou trauma local como extração dentária, impacção alimentar, restaurações dentárias não satisfatórias, próteses desadaptadas, trauma crônico, doença periodontal, presença de cálculo, e aparelhos ortodônticos (Dayan et al., 1990, Motamedi et al., 2007, Chaparro-Avendano et al., 2005, Houston, 2005). Histologicamente, a LPCG é caracterizada pela presença de células gigantes multinucleadas (CGM) entremeadas por células mononucleares (fibroblastos, monócitos-macrófagos) dispersas em um estroma de fibras colágenas de densidade variável. É revestida por epitélio pavimentoso paraceratinizado, e caracteriza-se por ser bem vascularizada com numerosos capilares, áreas hemorrágicas e hemossiderina. Também

26 apresenta infiltrado inflamatório crônico, evidenciado pela presença de linfócitos, plasmócitos e histiócitos ou agudo composto por células polimorfonucleares. Também pode apresentar tecido mineralizado do tipo lamelar, cementóide ou calcificação distrófica (Dayan et al., 1990, Florez-Moreno et al., 2008, Flaitz, 2000, Lester et al., 2014). O tratamento consiste em remoção cirúrgica com extensa curetagem da base da lesão para evitar recidivas. A recorrência descrita na literatura está entre 1,4% e 12 % (Motamedi et al., 2007, Bhaskar et al., 1971). 1.2 LESÃO CENTRAL DE CÉLULAS GIGANTES (LCCG) Definida pela Organização Mundial da Saúde (OMS) (Barnes, 2005) como uma lesão intraóssea caracterizada pela presença de tecido conjuntivo fibroso com múltiplas CGM, focos de hemorragia e ocasionalmente trabeculado ósseo. A lesão central de células gigantes (LCCG) é uma lesão intraóssea benigna de etiologia controversa e corresponde a 7% de todas as lesões benignas dos maxilares (de Lange et al., 2004). A LCCG pode ocorrer em qualquer idade, mas tem predileção por pacientes jovens, abaixo dos 30 anos de idade e acomete duas vezes mais as mulheres que homens. A mandíbula é mais afetada que a maxila (de Lange et al., 2004, Sun et al., 2009, Gungormus & Akgul, 2003, de Lange et al., 2007, Motamedi et al., 2007), sendo comum na região anterior (de Lange et al., 2007, Reddy et al., 2012). O comportamento clínico varia de crescimento lento e aumento de volume assintomático a destruição óssea local, reabsorção e/ou descolamento dos dentes adjacentes (de Lange et al., 2004, Stavropoulos & Katz, 2002). Chuong et al (1986) descreveu duas variantes de comportamento das LCCG denominadas agressivas e não agressivas de acordo com os sinais e sintomas. As lesões agressivas são caracterizadas por apresentarem dor, parestesia, tamanho maior de 5 cm, crescimento rápido, recidiva após curetagem cirúrgica, afilamento ou perfuração da cortical óssea, deslocamento ou reabsorção de dentes adjacentes. Atualmente não se encontram na literatura marcadores moleculares e imuno-histoquímicos que diferencie os dois subtipos (Itonaga et al., 2003). Reddy et al. (2012) em um estudo histomorfométrico avaliaram a

27 quantidade de CGM em lesões agressivas e não agressivas, e em lesões agressivas observaram uma maior quantidade de CGM como também uma maior quantidade de núcleos nessas células nas lesões agressivas. Radiograficamente, a LCCG apresenta descrições variadas, podendo ser unilocular ou multilocular, de aspecto radiolúcido ou com focos radiopacos, ser bem delimitado ou de limites imprecisos, podendo assim apresentar descontinuidade da cortical, deslocamento ou reabsorção dos dentes adjacentes à lesão (Sun et al., 2009, Aghbali et al., 2013). Os achados radiográficos não são específicos para a LCCG, pois podem mimetizar uma variedade de outras lesões dos maxilares tais como cistos, tumores odontogênicos, lesões fibro-ósseas, malformações vasculares e lesões malignas, como lesões ósseas metastáticas (De Lange & Van den Akker, 2005, Kruse-Losler et al., 2006). Microscopicamente a LCCG é caracterizada por múltiplas CGM e células mononucleares em um estroma rico em fibras colágenas (Florez- Moreno et al., 2008, Aghbali et al., 2013), sendo histologicamente idêntica a LPCG. Em um estudo realizado por Agbhali et al.(2013), os autores observaram a quantidade de núcleos por célula gigante foi maior em LCCG que nas LPCG, sendo uma hipótese para diferenciar o comportamento clínico destas lesões. A LCCG tem sua histologia idêntica a outras lesões que acometem os ossos gnáticos, como o tumor marrom, decorrente do hiperparatireoidismo (Di Daniele et al., 2009, Shetty et al., 2015), o querubismo (Jain & Sharma, 2006); Barnes L,2005) cisto ósseo aneurismático (Urs et al., 2014) e o tumor de células gigantes (Werner, 2006). O tumor marrom do hiperparatireoidismo é o resultado de uma desordem metabólica que afeta ossos longos, costelas e pelve (Chowdhury et al., 2013). A produção excessiva do paratormômio (PTH) causa um desequilíbrio na atividade osteoclástica resultando na destruição óssea (Rubin et al., 2001). A doença é mais comum em adultos, com média de idade de 50 anos e afeta três vezes mais mulheres que homens (Chowdhury et al., 2013). O envolvimento dos ossos gnáticos é raro, mas, quando ocorre, a mandíbula é mais acometida (Jebasingh et al., 2008). A literatura refere uma frequência do tumor marrom de 1,5% a 1,75% no hiperparatireoidismo primário e 3 a 4% no hiperparatireoidismo secundário. Radiograficamente e histologicamente o tumor marrom é idêntico a LCCG, sendo assim necessários exames laboratoriais como dosagem sérica de cálcio, fosfatase alcalina, níveis PTH para definir o diagnóstico (Shetty et al., 2015).

28 O querubismo é uma doença fibro-óssea, genética e autolimitada que afeta os ossos gnáticos. Caracteriza-se pela substituição de osso normal por uma proliferação de tecido fibrovascular contendo CGM, causando um aumento de volume bilateral da mandíbula e maxila. Desenvolve- se em pacientes com idade entre 1 a 7 anos (Jain & Sharma, 2006). Microscopicamente o querubismo é indistinguível da LCCG. A correlação com os dados clínicos-radiográficos pode ser uma ferramenta útil para distinguir o querubismo da LCCG (Barnes,2005). O cisto ósseo aneurismático é descrito pela OMS como uma lesão osteolítica, expansiva, caracterizado por ser uma cavidade cheia de sangue e pela presença de tecido conjuntivo contendo material osteóide e CGM. É uma lesão rara, sendo a maioria dos casos envolvendo ossos longos, como fêmur e tíbia, apenas 2 % dos casos ocorrem nos ossos gnáticos (Urs et al., 2014). O tumor de células gigantes (TCG) é uma lesão agressiva, com tendência à recidiva, e que acomete os ossos longos raramente ocorrendo nos maxilares. Histologicamente é caracterizado por apresentar numerosas CGM e numerosos núcleos por células gigantes distribuídas em um estroma altamente celularizado e com a presença de necrose. Radiograficamente apresenta-se como uma lesão osteolítica, agressiva e de limites imprecisos (Murphey et al., 2001). A cirurgia é a modalidade de tratamento mais aplicada em LCCG. Lesões não agressivas tendem a responder com sucesso a enucleação e curetagem dessas lesões, especialmente em pacientes jovens (Triantafillidou et al., 2011). No entanto em lesões agressivas a taxa de recidiva com tratamento cirúrgico tem sido entre 37,5 a 70% (de Lange et al., 2007). A ressecção em bloco tem sido uma alternativa para diminuir a chance de recidiva, porém os danos funcionais e cosméticos são expressivos (Bataineh et al., 2002); (Infante Cossio et al., 2007) (Tosco et al., 2009). Terapias medicamentosas têm sido sugeridas para diminuir a morbidade causada pela cirurgia, reduzindo o tamanho da lesão e consequentemente a necessidade de uma ampla ressecção. Medicamentos como calcitonina, injeção intralesional com corticosteroides e interferon α-2a são descritos como alternativas para lesões agressivas, contudo mais estudos randomizados são necessários para comprovar a eficácia desses tratamentos (Suarez-Roa Mde et al., 2009). A calcitonina foi sugerida por Harris em 1993, depois de confirmar através de imuno-histoquímica, que as células gigantes encontradas nessas lesões reagem com anticorpo monoclonal específico para osteoclastos inibindo a ação destes nos ossos. Desde então tem se

apresentado como uma terapia não cirúrgica para o tratamento de lesões agressivas (Allon et al., 2009, Harris, 1993), sendo a forma de spray nasal mais indicada (de Lange et al., 2006). Tem sido sugerido na literatura que a calcitonina seja utilizada em associação com a injeção intralesional de corticosteroide, diminuindo assim o chamado fenômeno de escape da calcitonina, que tem seu efeito diminuído se utilizada por um longo período (Vered et al., 2006; Rachmiel et al., 2012). A injeção intralesional de corticosteroide foi descrito pela primeira vez por Jacoway em 1988 (Jacoway JR,1988). Os esteroides são utilizados por possuírem capacidade de inibir a reabsorção óssea mediada pelas proteases lisossomais das células gigantes e também por induzirem a apoptose dos osteoclastos (Carlos & Sedano, 2002, Abdo et al., 2005). As recomendações para esse tipo de medicamento é que sejam realizadas injeções intra-lesionais uma vez por semana, por 6 semanas, em múltiplos sítios da lesão (Vered et al., 2008, Kurtz et al., 2001). Não é descrito na literatura efeitos colaterais do uso desse medicamento usado localmente, como quando utilizado de forma sistêmica (El Hadidi et al., 2015). A ação da calcitonina e dos corticosteroides deve-se, em partes, aos receptores de calcitonina e glicocorticoides presentes nas CGM (Tobon-Arroyave et al., 2005). Vered et al (2006) sugeriram que fosse realizada uma análise imuno-histoquímica das CGM para avaliar a presença desses receptores e decidir qual a melhor estratégia terapêutica. Outra associação descrita na literatura é a utilização dos corticosteroides concomitantemente com bifosfonatos, medicamentos amplamente utilizados em condições como osteoporose, doença de Paget e tumores metastáticos por apresentar propriedades que inibem a osteólise (da Silva et al., 2012). Os mesmos autores relaram um caso onde utilizaram alendronato sódico, um tipo de bifosfonato, concomitante com o uso de injeções intralesionais de triancinolona em um caso de LCCG agressivas e obtiveram a remissão total da lesão, sem a necessidade de complementação cirúrgica, com acompanhamento de 4 anos, sem sinal de recidiva da lesão. No entanto, mais estudos clínicos são necessários para comprovar a eficácia dessa associação. O interferon α-2a também é um medicamento indicado como terapia adjuvante no tratamento cirúrgico de LCCG agressivas, e foi utilizado pela primeira vez em 1999 por Kaban et al (1999). Tem sido proposto por apresentar propriedades anti-angiogênicas e também por estimular a diferenciação de células mesenquimais em osteoblastos, otimizando a neoformação óssea (Abukawa et al., 2006). No estudo de 29

30 De Lange et al (de Lange et al., 2006) o interferon α-2a quando utilizado no tratamento primário estabilizou o rápido crescimento lesional e reduziu o seu tamanho. No entanto, os efeitos colaterais desse medicamento são pouco tolerados pelos pacientes, tais como fadiga, dores de cabeça e febre (Goldman et al., 2005). O imatinib, inibidor de tirosina quinase, é um medicamento utilizado para o tratamento de subtipos de leucemia mielóide crônica e tumores gastrointestinais, e por inibir a ação dos osteoclastos, desregulam o Fator ativador de receptor nuclear KB (RANK), um regulador da atividade óssea. Tem sido sugerido seu uso para tratamento de LCCG agressivas em associação com o interferon α-2a (de Lange et al., 2009). O Denosumab é um anticorpo monoclonal (Ig2) capaz de inibir a lise óssea bloqueando o ligante do fator receptor ativador nuclear KB (RANKL), uma proteína fundamental para diferenciação e maturação dos osteoclastos, e como consequência inibindo a reabsorção óssea (Branstetter et al., 2012, Gupta et al., 2015). 1.3 SISTEMA RANK/RANKL/OPG O tecido ósseo está em constante remodelação pela atividade dos osteoclastos, que atuam na reabsorção da matriz óssea, e dos osteoblastos, que sintetizam o tecido ósseo (Boyle et al., 2003). Os osteoclastos são derivados de precursores monoclonais das células hematopoiéticas que também dão origem aos macrófagos (Karsenty & Wagner, 2002). O entendimento deste processo que regula a atividade dos osteoclastos teve um avanço significativo nas últimas décadas com a descoberta do sistema RANK/RANKL/OPG (Boyce & Xing, 2007). O sistema RANK/RANKL/OPG é um dos mecanismos que regulam essa atividade no organismo e mantém o funcionamento dos osteoclastos e osteoblastos em equilíbrio, garantindo a integridade do tecido ósseo. Em situações patológicas a expressão desses marcadores pode estar alterada (Wada et al., 2006). A elucidação desse sistema iniciou pela descoberta da osteoprotegerina (OPG) por dois grupos independentes, e de forma inesperada. Simonet et al (Boyle et al., 2003) estavam investigando moléculas relacionadas aos receptores do fator de necrose tumoral (TNF) que pudessem exercer atividade terapêutica utilizando ratos transgênicos que superexpressavam vários receptores dos TNF

31 relacionados ao cdna. Durante o experimento observaram que ratos que superexpressavam um cdna específico desenvolveram osteopetrose por apresentarem deficiência de osteoclastos no tecido ósseo, posteriormente, a proteína relacionada a esse fenômeno foi denominada de osteoprotegerina, pois demonstrava proteger o tecido ósseo de reabsorções excessivas, indicando que a OPG exercia um papel importante na regulação da osteoclastogênese (Simonet et al., 1997). Independentemente a isso, pesquisadores do Snow Brand Milk Group identificaram uma molécula idêntica ao testarem a hipótese de Rodan-Martin (definiam o osteoblasto como fator central de controle da osteoclastogênese e na reabsorção óssea), os autores estavam investigando fatores que inibissem e ativassem os osteoclastos e reportaram o fator inibitório da osteoclastogênese (OCIF), que posteriormente foi reconhecido ser idêntico a proteína descoberta pelo primeiro grupo (Yasuda et al., 1998b). Assim que a OPG foi identificada, ambos os grupos identificaram seu ligante, denominado inicialmente como ligante de OPG e fator de diferenciação dos osteoclastos, e observaram ser idêntico a um membro da família de ligantes do TNF, o Ligante do Receptor Ativador Nuclear Kappa B (RANKL), fator conhecido por estimular células dendríticas (Yasuda et al., 1998b, Lacey et al., 1998). Após o reconhecimento do ligante da OPG, foi observado que o seu receptor era idêntico a um fator já revelado anteriormente, o receptor fator nuclear-kb (RANK) (Anderson et al., 1997). O processo de ativação e maturação dos osteoclastos requer uma cascata de eventos complexos que ainda não estão totalmente compreendidos, envolvendo o sistema RANK/RANKL e o fator estimulante de colônias de macrófago (M-CSF), que está presente em osteoblastos e células do estroma são necessários para diferenciação e ativação dos osteoclastos, no entanto o M-CSF sozinho não é capaz de complementar esse processo (Boyce & Xing, 2008, Boyce & Xing, 2007). A ligação de RANKL, expresso em osteoblastos e células do estroma, ao RANK, expresso em precursores de osteoclastos e osteoclastos maduros recruta uma proteína adaptadora (TRAF6) ativando fator nuclear kb, esse último é responsável por aumentar a expressão da proteína c-fos que interage com NFATc1 (Fator nuclear de células T ativadas) para ativar a transcripção dos genes da osteoclastogênese. A OPG inibe esse processo se ligando a RANKL e, assim, inibe a cascata de eventos responsável pela ativação e maturação

32 dos osteoclastos, impedindo a reabsorção óssea (Boyce & Xing, 2008, Khosla, 2001). (Figura1) Figura 1. Mecanismo de diferenciação e ativação dos osteoclastos. Adaptado de Boyce & Xing, 2007. Em condições patológicas, citocinas com propriedades proreabsortivas como o fator de necrose tumoral alfa (TNFα) e a Interleucina 1 (IL1) interferem nesse sistema primeiramente por estimularem a produção de M-CSF e também por aumentarem a expressão de RANKL (Boyce e Xing, 2008). 1.3.1 RANK O Receptor Ativador Nuclear Kappa B (RANK do inglês Receptor Activator of Nuclear factor Kappa- B) é um receptor transmembrana, de superfície celular, do tipo 1 da família do TNF que está presente em células precursoras de osteoclastos, osteoclastos maduros, células dendríticas, fibroblastos e células T (Anderson et al., 1997). É caracterizado por ser um peptídeo de 616 aminoácidos e sua ativação se faz pela ligação com RANKL (Receptor Ativador Nuclear Kappa b ligante) induzindo a maturação dos pré-osteoclastos e ativação

33 dos osteoclastos maduros (Wada et al., 2006). A expressão de RANK também tem sido encontrada em glândulas mamárias (Fata et al., 2000) e em algumas células tumorais como no câncer de mama e de próstata, ou seja, tipos de tumores com alto potencial de desenvolver metástase óssea (Wittrant et al., 2004). 1.3.2 RANKL O Receptor Ativador Nuclear Kappa B ligante (RANKL do inglês Receptor Activator of Nuclear factor Kappa-B ligand) é uma proteína transmembrana tipo II, expressa na superfície de membrana celular e também como proteína secretada por diversos tipos celulares, como linfócitos T e osteoblastos. É um peptídeo de 317 aminoácidos pertencendo à família do TNF (Boyce & Xing, 2008, Hofbauer, 2006, Tyrovola et al., 2008). No tecido ósseo a expressão de RANKL é encontrada em osteoblastos e células do estroma, e também é observado na medula óssea e nos tecidos linfáticos (linfonodos, timus, baço). Sua expressão também é observada em células epiteliais mamárias durante a gestação (Wada et al., 2006, Fata et al., 2000). O RANKL também tem sido associado à resposta imune, ativando células T e inibindo a apoptose de células dendríticas (Wong et al., 1997). Assim como o RANK, o RANKL também é expresso em algumas células tumorais malignas, e tem como função estimular a proliferação das células tumorais pela sinalização autócrina ou parácrina, se produzidas por células vizinhas como células T ativadas (Kim et al., 2006). Experimentos in vivo demonstraram que roedores com deficiência de RANKL apresentaram osteopetrose e defeitos na erupção dentária, e ainda apresentaram deficiência na diferenciação de células T e B, e deficiência nos linfonodos, concluindo que RANKL é crucial para o metabolismo ósseo e formação do sistema imune (Kong et al., 1999). 1.3.3 OPG A osteoprotegerina foi assim definida por ser considerada uma protetora do tecido ósseo, impedindo a sua reabsorção. Atua como antagonista de RANKL, pois a ligação de OPG com RANKL impede a ativação e diferenciação dos osteoclastos, inibindo a lise óssea. É um peptídeo de 380 aminoácidos que pertence à família de receptores do TNF sendo secretada como proteína solúvel (Simonet et al., 1997, Yasuda et al., 1998a).

34 A OPG é expressa em diferentes tipos celulares, como os osteoblastos, as células do tecido linfático, vascular e medula óssea (Simonet et al., 1997, Yasuda et al., 1998a). Tem sido sugerido que a presença de OPG protege vasos sanguíneos calibrosos de calcificações, prevenindo complicações oriundas da aterosclerose (Bucay et al., 1998). A expressão de OPG é regulada por muitos fatores que induzem a expressão de RANKL por osteoblastos, no entanto, em condições patológicas observa-se um aumento da expressão de RANKL e uma baixa expressão de OPG, favorecendo a osteoclastogênese (Boyce & Xing, 2007). Em um estudo in vivo em roedores foi observado que uma depleção de OPG resultou em severa osteoporose, um aumento na formação de osteclastos e consequentemente um aumento da reabsorção óssea. E ainda nesse mesmo estudo foi observada uma intensa calcificação das artérias mais calibrosas (Bucay et al., 1998, Mizuno et al., 1998). 1.4 EXPRESSÃO DE RANKL/OPG EM DOENÇAS ÓSSEAS É conhecido que o desequilíbrio desse sistema altera o metabolismo ósseo e alguns distúrbios ósseos estão sendo relacionadas a essa alteração, como a falha na erupção dentária, doença periodontal e doenças mais graves como a osteopetrose, doença de Paget, osteoporose, artrite reumatóide (Boyce & Xing, 2007). Com isso a expressão desses marcadores tem sido muito investigada para melhor compreensão das doenças e com a finalidade de descobrir um futuro alvo nas terapias antitumorais. Dentre os tumores que acometem os maxilares Da Silva et al. (da Silva et al., 2008) avaliaram a expressão de RANK, RANKL e OPG em tumores odontogênicos ceratocísticos, ameloblastomas e cistos dentígeros e observaram uma maior expressão de RANK e RANKL em ameloblastomas sólidos quando comparados ao cisto dentígero. Também observaram que os ameloblastomas tanto tipo sólido como unicístico apresentaram maior expressão de RANKL do que OPG, diferentemente dos casos avaliados de tumores odontogênicos ceratocísticos e dos cistos dentígeros que apresentaram maior expressão de OPG quando comparados a RANKL. Em outro estudo também avaliando a expressão de RANK, RANKL e OPG em ameloblastomas sólidos/multicísticos recorrentes foi

35 notada uma alta expressão de RANK no epitélio tumoral enquanto a marcação de RANKL foi predominantemente no estroma. A expressão de OPG foi mais observada em epitélio tumoral que tecido conjuntivo (Siar et al., 2015). Andrade FR et al. (2008) avaliaram a presença desses marcadores em tumor odontogênico cístico calcificante (TOCC), tumor odontogênico adenomatóide (TOA), tumor odontogênico calcificante epitelial (TOCE), mixoma odontogênico (MO), fibroma ameloblástico (FA). A expressão de RANK, RANKL e OPG foi encontrada em todos os casos. No estroma e células mesenquimais do TOEC, MO, FA houve uma maior expressão de RANKL enquanto no TOA e TOCC houve uma maior expressão de OPG. A expressão de RANK/RANKL/OPG também tem sido investigada outras doenças ósseas como em mieloma múltiplo, caracterizada por desenvolver lesões osteolíticas no tecido ósseo acompanhado de dor, hipercalcemia e fraturas patológicas. Giuliani e colaboradores observaram uma maior expressão de RANKL e uma redução de OPG nesses pacientes (Giuliani et al., 2001). Em tumores de células gigantes (TCG), uma doença rara que acomete ossos longos, caracterizada por destruição maciça dos ossos, células derivadas do estroma de TCG apresentaram superexepressão de RANKL, o que explicaria a característica osteolítica da lesão (Wittrant et al., 2004). Em tumores de mama, doença com alto potencial de desenvolver metástase óssea a expressão de RANKL aumentada têm sido relacionada a um pior prognóstico, enquanto que a maior expressão de OPG têm sido associada a um melhor prognóstico e aumento da sobrevida (Cross et al., 2006). Com relação à presença desses marcadores em LCCG e LPCG poucos são os estudos descritos na literatura. Elias et al. (2010)analisaram a expressão de RANKL e OPG em LCCG comparando com o cisto ósseo simples (COS) e a displasia fibrosa (DF) e observaram uma maior expressão de RANKL nas LCCG. Em outro estudo realizado por Fanourakis et al. (2010) foi avaliada a expressão de RANKL e OPG em LPCG e através de uma análise semi-quantitativa foi observado uma alta expressão desses marcadores nas amostras analisadas. Liu et al. (2003) avaliaram através da hibridização in situ a presença de mrna de RANKL e OPG em LCCG e LPCG, e observaram que o mrna de RANKL foi expresso principalmente em células mononucleares enquanto que o mrna de OPG foi encontrada tanto em células mononucleares quanto em CGM.

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37 2. JUSTIFICATIVA A LCCG e a LPCG são processos proliferativos não-neoplásicos com aspectos histológicos similares, mas com características clínicas distintas. Assim, o estudo da atividade osteoclástica mediada pelo sistema RANKL-OPG pode gerar melhor entendimento da histogênese e comportamento clínico destas lesões, além de favorecer o desenvolvimento de futuras ferramentas para prognóstico e tratamento.

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39 3. OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GERAL Avaliar da expressão do RANKL e OPG, e quantificar as CGM e seus núcleos em LPCG e LCCG, diagnosticados no LPB-UFSC no período de 2006 a 2016. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Avaliar os dados sócio-demográficos dos pacientes diagnosticados com LCCG e LPCG pelo LPB-UFSC; Quantificar a população de CGM, bem como seus núcleos em LCCG e LPCG; Avaliar a diferença entre a expressão imuno-histoquímica das proteínas RANKL, OPG no estroma de LPCG e LCCG; Avaliar a relação RANKL/ OPG em LPCG e LCCG; Estabelecer possíveis correlações entre a expressão das proteínas do estudo e os dados clínicos e histológicos de cada lesão.

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41 4. ARTIGO Artigo formatado conforme as normas da revista Oral Diseases (Anexo A), com exceção do idioma. TÍTULO Imunoexpressão do ligante NF-kappa B e osteoprotegerina na diferenciação das lesões centrais e periféricas de células gigantes. RESUMO O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão de RANKL e OPG em LPCG e LCCG, e quantificar as células gigantes multinucleadas (CGM) e seus núcleos nestas lesões. Vinte casos de cada lesão foram selecionados do Laboratório de Patologia Bucal da UFSC, no período de 2006 a 2016. A avaliação da imunoexpressão de RANKL e OPG assim como a quantificação de CGM e núcleos foi realizada com o auxílio do software Image J 1.45s. Não houve diferença estatística na quantificação de CGM por mm², no entanto o número de núcleos por CGM foi maior em LCCG (P = 0,010). A expressão de RANKL foi maior nas LCCG que nas LPCG (P= 0,042). Entretanto, não houve diferença estatística entre as duas lesões na expressão de OPG. Nossos achados demonstraram maior expressão de RANKL e número de núcleos nas LCCG o que pode explicar a diferença de comportamento clínico entre as duas lesões e também a patogênese. Palavras chaves: Imuno-histoquímica. RANKL. OPG. Lesão central de células gigantes. Lesão periférica de células gigantes.

42 INTRODUÇÃO As lesões central e periférica de células gigantes são lesões benignas que afetam os ossos gnáticos e sua etiologia e patogenia são incertas (Florez-Moreno et al., 2008). A lesão periférica de células gigantes (LPCG) é descrita como uma lesão reativa, afetando somente a gengiva e rebordo alveolar, manifestando-se como nódulo vermelho ou roxo. Pode ocorrer em qualquer idade, sendo mais comum na quinta e sexta décadas de vida. Não há predileção por gênero e ocorre tanto em maxila quanto em mandíbula (Motamedi et al., 2007, Lester et al., 2014). Permanece incerto se a LPCG é uma entidade distinta, ou uma variante periférica da lesão central de células gigantes (LCCG). A LCCG é descrita pela OMS como uma lesão intraóssea benigna que afeta principalmente mulheres abaixo dos 30 anos de idade (Barnes, 2005). A LCCG tende a envolver mais a mandíbula que a maxila, e é mais comum na região anterior (de Lange et al., 2007, Reddy et al., 2012). O comportamento clínico varia entre um crescimento lento e ausência de sintomatologia, denominada do tipo não agressiva, à um crescimento rápido associado a dor, reabsorção das raízes de dentes adjacentes, deslocamento dental, denominada tipo agressiva (Chuong et al., 1986). Histologicamente a LPCG e LCCG são caracterizadas pela presença de numerosas células gigantes multinucleadas e células mononucleares em um estroma fibroso e bem vascularizado, podendo apresentar material osteóide (Lester et al., 2014, Aghbali et al., 2013). Apesar das duas lesões apresentarem as mesmas características histológicas, elas apresentam comportamento clínico distinto. Muitos pesquisadores tem tentado explicar a diferença no comportamento clínico através da avaliação citomorfométrica dos núcleos das células gigantes (Aghbali et al., 2013); a expressão de marcadores como da angiogênese (CD34) e de macrófagos (CD68) (Kumar et al., 2016); p53 (gene supressor tumoral), PCNA (antígeno nuclear de proliferação celular), Ki-67 (proteína não histona de proliferação celular) e AgNOR (regiões organizadoras nucleolares argirofílicas) (Souza et al., 2000); ou ainda a expressão de RANK (receptor ativador do fator nuclear kappa- B), GRa (receptor glicocorticoide) e CTR (receptores de calcitonina) (Tobon-Arroyave et al., 2005). Estudos relacionados ao sistema RANK/RANKL/OPG na osteoclastogênese acarretaram em um grande avanço no conhecimento

43 sobre o turn over ósseo. O receptor ativador do fator nuclear Kappa-B (RANK), expresso em precursores de osteoclastos se liga ao ligante do receptor ativador do fator nuclear Kappa-B (RANKL), expresso na membrana de superfície de osteoblastos e células do estroma promovendo a diferenciação e ativação dos osteoclastos. A osteoprotegerina (OPG) inibe esse processo ligando-se ao RANKL. O aumento da expressão de RANK/RANKL tem sido observado em diversas doenças ósseas como osteoporose, metástase óssea e tumores odontogênicos. (Andrade et al., 2008, Siar et al., 2015, da Silva et al., 2008) e em situações com aumento da atividade osteolítica (Wada et al., 2006). O objetivo deste estudo foi avaliar através de imuno-histoquímica a expressão de RANKL e OPG em LCCG e LPCG, uma vez que não foram encontrados estudos prévios na literatura que avaliassem a expressão desses marcadores nessas lesões; e também quantificar as CGM, bem como seus núcleos nestas lesões, a fim de contribuir para um melhor entendimento da patogênese dessas duas lesões. MATERIAIS E MÉTODOS Seleção da amostra Os casos avaliados neste estudo foram selecionados dos arquivos do Laboratório de Patologia Bucal, da Universidade Federal de Santa Catarina, no período de 2006 a 2016. Foram selecionados 20 casos de LPCG e 20 de LCCG. Dados demográficos como idade, gênero e localização anatômica foram coletados das fichas de biópsias. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa em seres humanos da Universidade Federal de Santa Catarina sob o parecer nº 1.468.638 de 29/03/16 (Apêndice A). Quantificação das células gigantes e seus núcleos Para avaliação histológica foram obtidos cortes de 5 µm e corados com hematoxilina e eosina (H&E). A análise foi realizada por dois avaliadores calibrados e cegados utilizando microscópio óptico binocular (Axiostar Plus, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha), acoplado a um sistema de aquisição de imagem digital (A620, Cannon, Lake Success, NY, EUA. Foram capturados 5 campos de cada caso, com aumento de 400x, selecionados da área central da lesão com a maior

44 prevalência de células gigantes multinucleadas (CGM). A quantificação das CGM e seus respectivos núcleos foi realizada através do software Image J 1.45s (Maryland, EUA). Os parâmetros incluídos foram: CGM e número de núcleos/mm² de tecido conjuntivo. Imuno-histoquímica Das amostras fixadas em formol e emblocadas em parafina foram obtidos cortes de 3 µm, estendidas em lâminas de vidro silanizadas (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EUA). As amostras foram desparafinadas com xilol seguidas de reidratação em concentrações decrescentes de álcool. O bloqueio da peroxidase endógena foi realizado com peróxido de hidrogênio a 6% diluído em álcool metílico em dois banhos de 20 e 10 minutos cada, em temperatura ambiente. A recuperação antigênica foi realizada com imersão das amostras em solução de tampão citrato, ph 6,0 a 96 C por 40 minutos. Os cortes foram incubados com anticorpo monoclonal primário de rato anti- RANKL (N-19, diluição 1:200, Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA) e anti-opg (N-20, diluição 1:200, Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA) em câmara úmida a 4-8 C, por 18 horas. Após esse período, as amostras foram imersas em tampão fosfato salina (PBS) e em seguida realizado a incubação do anticorpo conjugado de biotina anti-cabra de frango de diluição 1:500 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA). As reações foram visualizadas com o kit Vectastain ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA) e reveladas com DAB (Dako Cytomation, Glostrup, Dinamarca). Os controles negativos foram obtidos através da omissão do anticorpo primários. Em relação aos controles positivos, e de acordo com os fabricantes dos anticorpos primários, foram utilizadas amostras teciduais ricas em CGM. Análise Imuno-histoquímica A imunoexpressão de RANKL e OPG foi analisada utilizando o software Image J 1.45s (Maryland, EUA). A análise foi feita em 5 campos com aumento de 400x para cada caso, capturados com câmera (Cannon A620, Ōita, Japão) utilizando microscópio óptico binocular (Axiostar Plus, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha). Para a avaliação foram selecionadas áreas hot spots, sem artefatos ou alta concentração de hemossiderina. A imunoreatividade para RANKL e OPG foi caracterizada pela marcação citoplasmática acastanhada e os valores

45 foram expressos por porcentagem de área marcada em cada amostra. Também foi mensurada a relação RANKL/OPG para cada grupo. Análise Estatística Para a análise estatística dos achados clínicos, reações imunohistoquímicas, quantificação das células gigantes e núcleos foi aplicado o teste exato de Fischer e Mann-Whitney, utilizando o software SPSS 18.0 (SPSS Inc.,Chicago,IL, EUA). As correlações foram analisadas utilizando o teste de Spearman. Os resultados foram expressos pela média ± DP (desvio padrão) considerando o nível de significância de 5% (P <0.05). RESULTADOS Análise Clínica Dos 20 casos estudados de LPCG 12 (60%) ocorreram nos pacientes do gênero masculino, enquanto que nas LCCG 14 (70%) ocorreram no sexo feminino (Figura 3). A média de idade dos pacientes afetados pela LPCG foi de 37, 05 ± 23,89 anos enquanto a LCCG foi de 24,1± 17,67 anos. Nos dois grupos estudados o sitio anatômico mais acometido foi a mandíbula (Figura 4, Tabela 1). Análise Histológica Não foi encontrada diferença estatística na quantificação de CGM por mm² entre as LPCG e LCCG (P =0,245). No entanto o número de núcleos das células gigante foi evidentemente maior nos casos de LCCG (P = 0.010), sendo o número médio de núcleos de CGM/mm 2 de 230,3 para LPCG e 336,7 para LCCG (Figura 2 A-B, Figura 5, Tabela 1). Análise Imuno-histoquímica A imunomarcação das proteínas RANKL e OPG foi evidenciada em citoplasma e membrana plasmática das células gigantes multinucleadas, e células mononucleadas do estroma como linfócitos e células endoteliais. A marcação de células mononucleares foi observada em todos os componentes da amostra, no entanto, em alguns casos, não

46 foi constatada a marcação de CGM, tanto para RANKL quanto OPG (Figura 2C-F). A expressão de RANKL foi maior em LCCG que em LPCG (P= 0,042) (Figura 6). No entanto não foi encontrada diferença significativa entre as duas lesões na expressão de OPG (P= 0,091), mesmo que a média de marcação tenha sido maior em LCCG (9,16) quando comparada a LPCG (4,65). A razão de RANKL/OPG não apresentou diferença estatística entre os dois grupos, mas foi observada uma correlação positiva entre RANKL e OPG em LCCG e LPCG (r = +0,638, P = 0,002 e r = + 0,792, P = 0,001 respectivamente) (Figura 7). DISCUSSÃO No presente estudo foram avaliadas lesões centrais e periféricas de células gigantes. Ambas são descritas como lesões benignas que afetam os tecidos gnáticos e, apesar de apresentarem as mesmas características histológicas, observa-se um comportamento clínico distinto. A LPCG é mais comum que a LCCG (Florez-Moreno et al., 2008), ambas podem ocorrer em qualquer idade. Em nosso estudo foi observado uma prevalência de pacientes jovens, de acordo com outros estudos descritos na literatura ( Motamedi et al., 2007, Sun et al., 2009, Aghbali et al., 2013). A respeito da distribuição de gênero, nossos resultados apresentaram uma predileção pelo sexo masculino em LPCG, diferentemente da LCCG onde foi encontrada maior prevalência do sexo feminino, concordando com outros dados encontrados na literatura (Motamedi et al., 2007, Zarei et al., 2007, Salum et al., 2008, Sun et al., 2009, Reddy et al., 2012, Aghbali et al., 2013). Sobre o sítio anatômico mais afetado, nosso estudo encontrou predileção pela mandíbula em ambas as lesões, assim como descrito por outros autores (Motamedi et al., 2007, Shadman et al., 2009, Sun et al., 2009, Florez-Moreno et al., 2008). Sobre os aspectos microscópicos, foi encontrado no presente estudo um número maior de núcleos por CGM nas LCCG quando comparada a LPCG, consistente com outros estudos (Aghbali et al., 2013, Florez-Moreno et al., 2008). Apesar de essas lesões apresentarem características histológicas similares, elas apresentam comportamento clínico distinto. Muitas pesquisas têm sido realizadas para tentar explicar essa diferença como a avaliação citomorfométrica no número de CGM e de núcleos por célula gigante. Aghbali et al (2013) analisaram os aspectos microscópicos dessas lesões e observaram que a

média de número de núcleos por CGM foi de 9,54 nas LCCG e 8,58 nas LPCG; Florez-Moreno e coautores (2008) encontraram um número maior de núcleos por CGM nas LCCG que nas LPCG. A quantificação de células gigantes presente nessas lesões também tem sido realizada como uma ferramenta com o objetivo de prever o comportamento clínico dessas lesões, assim como no feito por Ficarra et al (1987) que avaliaram 32 casos de LCCG divididos em dois grupos, não agressiva e agressiva e observaram um maior número de núcleos em CGM no grupo das lesões agressivas. Em outro relato, o maior número de núcleos por CGM foi observado no tumor de células gigantes (TCG) quando comparado a LCCG (Auclair et al., 1988). Considerando a expressão de RANKL e OPG em LPCG e LCCG, são poucos os relatos descritos na literatura. Em nosso estudo foi observado maior expressão de RANKL em LCCG comparado a LPCG, este resultado é esperado uma vez que a LCCG é uma lesão intraóssea e apresenta alta atividade osteolítica. A expressão de RANKL em LCCG também foi maior quando comparado a displasia fibrosa (DF) e cisto ósseo simples (COS); a DF e COS apresentaram maior expressão de OPG nas amostras analisadas (Elias et al., 2010). Em outra pesquisa, foi analisada a expressão de RANKL e c-fos, um fator de transcrição ativador do complexo de proteína 1, essencial para osteoclastogênese em LCCG (Ahmed & Dunlap, 2016), e os autores constataram uma forte imunoreatividade para ambos os marcadores, essa marcação foi classificada como difusa, como observada em nosso estudo. Fanourakis et al (2010) avaliaram a expressão de RANKL e OPG em 22 casos de LPCG, e observaram uma alta expressão desses marcadores nas amostras analisadas. O padrão de marcação citoplasmática e de membrana de superfície encontrada em nossas amostras está de acordo com outros estudos descritos na literatura (da Silva et al., 2008, Andrade et al., 2008, de Matos et al., 2013, Ahmed & Dunlap, 2016, Chuang et al., 2009), assim como reação positiva em células mononucleares como as células endoteliais, linfócitos e fibroblastos (da Silva et al., 2008, Andrade et al., 2008, de Matos et al., 2013, Ahmed & Dunlap, 2016, Chuang et al., 2009). Alguns relatos sobre o tumor de células gigantes descrevem que a superexpressão de RANKL em células mononucleares podem representar o verdadeiro componente neoplásico nessas lesões (Atkins et al., 2000, Huang et al., 2000, Branstetter et al., 2012). Devido a LCCG ser uma lesão osteolítica era esperado que se observasse maior expressão de RANKL do que OPG. No entanto, não foi encontrada diferença significativa na expressão destes marcadores na LCCG, assim 47

48 como não houve diferença estatística entre a razão RANKL/OPG quando comparada a LPCG com a LCCG. Estudos relacionados à osteoclastogênese sugerem que as diferenças entre os marcadores RANKL e OPG podem determinar a atividade osteolítica das lesões (Elias et al., 2010, de Matos et al., 2013, Andrade et al., 2008). Os resultados encontrados na corrente pesquisa podem ser justificados provavelmente por outras vias que também interferem diretamente na osteoclastogênese e não somente o sistema RANKL/OPG. Não foram encontrados na literatura estudos prévios que comparassem a expressão de RANKL e OPG em LCCG e LPCG, acarretando na falta de um estudo de referência e para comparação dos nossos resultados. Ainda, diferentes fontes de anticorpos utilizados e métodos de quantificação dificultam a comparação com outros estudos. Além disso, a LCCG e a LPCG são caracterizadas pela presença de grande quantidade de hemossiderina dificultando a análise da reação positiva dessas áreas, devido a isso, essas áreas foram excluídas da nossa avaliação. Ademais, dados incompletos dos pacientes impossibilitam uma melhor correlação entre as características clinicas e os aspectos histológicos. O conhecimento referente a expressão de RANKL e OPG em patologias ósseas tem acarretado em informações novas e válidas para o melhor entendimento dos mecanismos que regulam a osteoclastogênese em situações fisiológicas e patológicas. Nossos achados mostraram uma maior expressão de RANKL em LCCG que pode explicar a diferença de comportamento clínico entre a LCCG e a LPCG e a distinta patogênese dessas lesões. No entanto, mais estudos são necessários para esclarecer e confirmar esses achados.

49 REFERÊNCIAS Aghbali A, Sina M, Vahid Pakdel SM, Emamverdizadeh P, Kouhsoltani M, Mahmoudi SM and Janani M (2013). Correlation of histopathologic features with demographic, gross and radiographic findings in giant cell granulomas of the jaws. J Dent Res Dent Clin Dent Prospects 7: 225-9. Ahmed AA and Dunlap C (2016). Immunohistochemical detection of the receptor activator of nuclear factor Kappa B ligand and c-fos in giant cell granuloma. J Oral Maxillofac Pathol 20: 47-50. Andrade FR, Sousa DP, Mendonca EF, Silva TA, Lara VS and Batista AC (2008). Expression of bone resorption regulators (RANK, RANKL, and OPG) in odontogenic tumors. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 106: 548-55. Atkins GJ, Haynes DR, Graves SE, Evdokiou A, Hay S, Bouralexis S and Findlay DM (2000). Expression of osteoclast differentiation signals by stromal elements of giant cell tumors. J Bone Miner Res 15: 640-9. Auclair PL, Cuenin P, Kratochvil FJ, Slater LJ and Ellis GL (1988). A clinical and histomorphologic comparison of the central giant cell granuloma and the giant cell tumor. Oral Surg Oral Med Oral Pathol 66: 197-208. Boffano P, Benech R, Roccia F, Gallesio C, Garzaro M and Pecorari G (2013). Review of peripheral giant cell granulomas. J Craniofac Surg. United States, pp. 2206-8. Branstetter DG, Nelson SD, Manivel JC, Blay JY, Chawla S, Thomas DM, Jun S and Jacobs I (2012). Denosumab induces tumor reduction and bone formation in patients with giant-cell tumor of bone. Clin Cancer Res 18: 4415-24. Chuang FH, Hsue SS, Wu CW and Chen YK (2009). Immunohistochemical expression of RANKL, RANK, and OPG in human oral squamous cell carcinoma. J Oral Pathol Med 38: 753-8. Chuong R, Kaban LB, Kozakewich H and Perez-Atayde A (1986). Central giant cell lesions of the jaws: a clinicopathologic study. J Oral Maxillofac Surg 44: 708-13. da Silva TA, Batista AC, Mendonca EF, Leles CR, Fukada S and Cunha FQ (2008). Comparative expression of RANK, RANKL, and OPG in keratocystic odontogenic tumors, ameloblastomas, and dentigerous cysts. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 105: 333-41. Dayan D, Buchner A and Spirer S (1990). Bone formation in peripheral giant cell granuloma. J Periodontol 61: 444-6. de Lange J, van den Akker HP and van den Berg H (2007). Central giant cell granuloma of the jaw: a review of the literature with emphasis on

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52

53 Tabela 1- Características clínicas, microscópicas e imuno-histoquímica dos pacientes com lesão central e periférica de células gigantes. LPCG (n=20) LCCG (n=20) P-valor Idade (média ± DP) 37,05 ± 23,89 24,05 ± 17,67 0,168 Gênero Feminino Masculino 8 14 0,057 12 6 Sítio Anatômico Mandíbula Maxila 14 15 0,004* 6 5 CGM/ mm² 39,3 ± 19,1 46,7 ± 20,2 0,245 Núcleos CGM/mm² 230,3 ± 106,1 336,7 ± 144,3 0,010** RANKL (%/área) 4,9 ± 3,1 10,2 ± 8,3 0,042** OPG (%/área) 4,6 ± 2,7 9,1 ± 7,9 0,091 RANKL/OPG 1,16 1,76 0,330 LPCG, lesão periférica de células gigantes; LCCG, lesão central de células gigantes; CGM, células gigantes multinucleadas; RANKL, Ligante do receptor ativador do fator nuclear KB; OPG, osteoprotegerina; DP, desvio padrão; * Teste exato de Fischer; ** Teste Mann-Whitney.

54

55 A B C D E F Figura 2 A,B Microfotografia apresentando alta proliferação de células gigantes multinucleadas (CGM) em lesão periférica de células gigantes (LPCG) e lesão central de células gigantes (LCCG) respectivamente (hematoxilina & eosina, aumento 400x). Expressão imunohistoquímica do ligante do receptor NF- kappab e osteoprotegerina em CGM e células mononucleares de LPCG (C,E) e LCCG (D,F), respectivamente (aumento original 400x)

56

Figura 3. Proporção dos casos de lesão periférica de células gigantes e lesão central de células gigantes relacionados ao gênero. LPCG- Lesão periférica de células gigantes. LCCG- Lesão central de células gigantes 57

58

Figura 4. Localização anatômica dos pacientes com lesão periférica de células gigantes e lesão central de células gigantes. LPCG- Lesão periférica de células gigantes. LCCG- Lesão central de células gigantes 59

60

Figura 5. Quantificação de núcleos das células gigantes multinucleadas em lesões periféricas e centrais de células gigantes. LPCG- Lesão periférica de células gigantes. LCCG- Lesão central de células gigantes 61

62

Figura 6. Análise comparativa da imunoexpressão de RANKL em lesões periféricas e centrais de células gigantes. LPCG- Lesão periférica de células gigantes. LCCG- Lesão central de células gigantes. 63

64

Figura 7. Correlação positiva entre os imunomarcadores RANKL e OPG em lesões periféricas e centrais de células gigantes. RANKL- Ligante do receptor fator nuclear Kappa B. OPG- Osteoprotegerina. 65

66

67 5. CONCLUSÃO De acordo com o presente estudo, é possível concluir: Houve uma prevalência do sexo feminino nas LCCG e do sexo masculino nas LPCG; A maioria dos pacientes afetados teve idade inferior a 30 anos e a mandíbula foi o sítio anatômico mais acometido em ambas as lesões; A quantidade de núcleos por CGM foi significativamente maior nas LCCG; A expressão de RANKL foi maior nas LCCG quando comparadas a LPCG; Não foi encontrada diferença estatística na expressão de OPG entre a LCCG e a LPCG; Os resultados observados podem complementar o conhecimento sobre a distinta patogênese dessas lesões, bem como a diferença no comportamento clínico entre a LCCG e LPCG.

68

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ANEXO A Parecer Consubstanciado do CEPSH 79

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83 APÊNDICE A - Metodologia Expandida DELINEAMENTO DO ESTUDO O estudo proposto é de natureza básica, observacional descritivo retrospectivo. ASPECTOS ÉTICOS E LEGAIS O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos (CEPSH) da UFSC sob o número 1.468.638. SELEÇÃO DAS AMOSTRAS As amostras deste estudo retrospectivo foram selecionadas nos arquivos do Laboratório de Patologia Bucal (LPB) da UFSC, de 2006 a 2016. A seleção dos casos foi feita com base nas fichas de biópsia, laudos anatomopatológicos e na análise das lâminas coradas no H&E. Foram selecionados 20 casos de Lesões Centrais de Células Gigantes e 20 casos de Lesões Periféricas de Células Gigantes. Como critério de inclusão, os casos de LCCG deveriam conter informação referente ao aspecto radiográfico e as amostras teciduais emblocadas em parafina tinham que conter material suficiente para a aplicação de reações imunohistoquímicas. QUANTIFICAÇÃO DAS CÉLULAS GIGANTES MULTINUCLEADAS, BEM COMO SEUS NÚCLEOS. Todos os casos foram histopatologicamente revisados por meio das lâminas histológicas coradas em hematoxilina & eosina (H&E) e foi realizada a quantificação das CGM, bem como seus núcleos. As lâminas tiveram sua identificação mascarada de forma que a captura das imagens e a análise microscópica fosse feita por um examinador cegado quanto ao grupo a que cada lâmina pertencia. Foram capturados cinco campos de cada lâmina, em aumento de 400x por meio de microscópio óptico binocular (Axiostar Plus, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha), acoplado

84 a um sistema de aquisição de imagem digital (A620, Cannon, Lake Success, NY, USA) e a um microcomputador (HP Compaq 6005, São Paulo, Brasil), onde foram armazenadas as imagens. Em cada lâmina histológica e com o auxílio do software Image J 1.45s (Maryland, USA), foi avaliada a quantificação das CGM (CGM) e de seus respectivos núcleos. Os parâmetros de análise incluiram: número de CGM e dos núcleos identificados por mm 2 de tecido conjuntivo. PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS As amostras foram submetidas à técnica de imunoistoquímica pelo método da estreptavidina-biotina-peroxidase. Todos os procedimentos foram realizados no LPB. Para cada um dos anticorpos foi seguido às orientações do fabricante e padronização, assim como foi incluído controle negativo com omissão do anticorpo primário para cada reação. O controle negativo de todas as reações foi realizado pela omissão do anticorpo primário. Das amostras fixadas em formol e emblocadas em parafina foram obtidos cortes de 3µm de espessura, estendidos em lâminas de vidro preparadas com solução de ATPS,3- aminopropyltriethoxysilene, (Sigma, St. Louis, MO, EUA). Os cortes foram inicialmente fixados na lâmina mantendo-as em estufa a 65ºC, durante 8 horas. Foi realizada a desparafinização com dois banhos de xilol, o primeiro overnight e o segundo durante 20 minutos, e em seguida foi realizada a reidratação dos cortes com 3 banhos de álcool etílico absoluto, 1 banho de álcool a 95%, 1 banho de álcool etílico a 85%, e 2 banhos de água destilada, todos de 5 minutos. Para o bloqueio da peroxidase endógena foi realizado duas imersões de 20 e 10 minutos, respectivamente, em solução de peróxido de hidrogênio a 6% em álcool metílico (80 ml de álcool metílico com 20ml de água oxigenada). A reativação antigênica foi realizada mantendo as lâminas em solução de tampão citrato 0,01M, ph 6,0, em banho-maria a temperatura constante de 96ºC, durante 40 minutos. Após esse período as lâminas foram retiradas do banho maria e aguardou-se até que atingissem a temperatura ambiente. Em seguida foram realizados 2 banhos de 5 minutos de PBS. Para o bloqueio de ligações inespecíficas, foi realizado 40 minutos de incubação em solução de leite desnatado a 5% em PBS (5g de leite desnatado 5% com 100ml de PBS), seguido de dois banhos de PBS de 5 minutos cada. A incubação com os anticorpos primários foi realizada em câmara úmida mantida sob refrigeração (4 a 8 C), durante 18 horas. Os anticorpos primários utilizados foram RANKL (Santa Cruz

85 Biotechnology, CA, EUA), na diluição 1:200; e OPG (Santa Cruz Biotechnology, CA,EUA) também na diluição 1:200. Para amplificação da reação foi utilizado anticorpo secundário (chicken anti-goat IgG-HRP, CA, EUA), na diluição 1:500, pelo período de 45 minutos. Na sequência foi realizado um banho em PBS de 5 minutos, seguido por incubação do anticorpo terciário Vectastain ABC (Vector Laboratories, Burlingame,EUA) sendo uma gota de cada reagente diluído em 5ml de PBS por 45 minutos. Após 2 banhos de PBS de 5 minutos foi realizada a revelação da reação através de solução cromógena, contendo diaminobenzidina (DAB) em tampão Tris-HCl 0,05M, ph 7,4, com exposição de cada corte por 3 minutos e banho de água destilada de 5 minutos. Após a revelação, foi realizada a contracoloração das lâminas com hematoxilina de Harris, por 5minutos. A remoção do pigmento formólico deu-se por rápida imersão das lâminas em solução de hidróxido de amônia 1 % e subsequente lavagem em água corrente durante 2 minutos. Os cortes foram novamente submetidos à desidratação com uma sequência de 1 banho de álcool etílico 85%, 1 banho de álcool etílico 95%, 3 banhos de álcool absoluto, todos por 5 minutos. E para finalizar, foi realizado dois banhos de 20 minutos no xilol. A montagem das lâminas foi realizada com Entellan (Merck, Darmstadt Alemanha). Após essa etapa, as lâminas foram mantidas em estufa (40ºC) por no mínimo 24 horas antes de serem examinadas ao microscópio de luz. ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA Para avaliação das reações foi utilizado o software ImageJ 1.45q (National Institutes of Health) a partir de imagens capturadas com câmera fotográfica (Cannon, A620, San Jose, CA, EUA) acoplada a microscópio de luz (Axiostar Plus, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha). Foram capturados 5 campos equidistantes de cada caso com magnificação de 400X, totalizando um total de área tecidual analisada de 1 mm 2. As áreas hotspots de avaliação corresponderam a maior integridade tecidual, com ausência de artefatos e evidente imunomarcação. Como os anticorpos RANKL e OPG apresentaram padrão de marcação citoplasmática, os valores foram expressos em média de porcentagem (%) de área imunomarcada. Nas lesões periféricas de células gigantes o epitélio de revestimento foi excluído da avaliação.

86 Também foi calculada a relação RANKL/OPG em cada um dos grupos analisados, comparando-os. ANÁLISE ESTATÍSTICA Para a análise estatística dos achados clínicos, quantificação de células gigantes e núcleos, e a reação imunohistoquímica foi aplicado teste exato de Fischer e o teste Mann-Whitney, utilizando o software SPSS, versão 18.0 (SPSS Inc., Chigaco, IL, EUA). As correlações foram avaliadas utilizando o teste de Spearman. Os resultados foram expressos pela média ± DP (desvio padrão) com nível de significância estatística considerado de 5% (P <0.05).

ANEXO B Guia de informações ao autor 87

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