Departamento de Microbiologia Instituto de Ciências Biológicas Universidade Federal de Minas Gerais http://www.icb.ufmg.br/mic Estudo macro e microscópico de fungos filamentosos e leveduriformes Objetivos Após a realização desta prática, você deverá estar apto a diferenciar levedura de bolor, executar cultivo em lâmina, executar técnica de lactofenol azul de algodão, descrever os principais aspectos macroscópicos de uma colônia, descrever os aspectos microscópicos dos fungos e executar técnica de coloração de cápsula. Introdução Os fungos constituem um grupo de microrganismos de grande interesse prático e científico. São encontrados em todos os ambientes, na água, no solo, no ar, assim como no organismo dos animais e do homem, nos vegetais, insetos, etc. Devido a sua ubiqüidade, eles se tornam importantes sob o ponto de vista profissional e humano, e a conscientização da importância do seu estudo vem se tornando cada vez mais necessária em vista, dentre outros, dos seguintes motivos: a) Determinar com relativa freqüência, diversas micoses nas várias espécies animais e no homem. b) Confundir clinicamente com outras patologias, exigindo do profissional conhecimento prévio da sua existência e dos recursos laboratoriais existentes para se fazer o diagnóstico diferencial entre elas. Os fungos são divididos em unicelulares e multicelulares. Os unicelulares são as leveduras, que apresentam células arredondadas ou ovais e se dividem por brotamento e raramente por cissiparidade. Os multicelulares são chamados filamentosos, miceliais ou bolores, atualmente conhecidos como oportunistas. Estes apresentam uma estrutura tubular, com parede rígida, a hifa, que pode ser ramificada. O conjunto de hifas é denominado micélio ou talo. A hifa pode apresentar parede transversal (septo) ou não, portanto o micélio pode ser septado ou asseptado. Alguns fungos apresentam em determinadas condições, um micélio filamentoso e em outras condições, um micélio unicelular, como o das leveduras. Como exemplo deste dimorfismo, temos o Paracoccidioides brasiliensis, o Histoplasma capsulatum e o Sporothrix schenckii, importantes agentes de micoses, que na natureza ou em laboratório à temperatura de 25o C, apresentam-se em forma de bolor e quando infectando um hospedeiro ou a 37o C em laboratório, apresentam-se em forma de levedura. O estudo morfológico dos bolores e leveduras é importante para a determinação do gênero e espécie. Para isso são empregados dois métodos básicos: o primeiro consiste no exame macroscópico da colônia, no qual deve ser descrito tamanho, superfície, bordas, pigmentação, etc. O segundo consiste no exame microscópico, que pode ser feito retirando-se um fragmento da colônia que é então colocado entre lâmina e lamínula, para a observação do micélio e tipos de esporos, ou usando-se a técnica de Ridell para microcultivo em lâmina. 1
Fungos Filamentosos O isolamento da flora anemófila é importante na determinação da flora do ar de um determinado ambiente, no estudo da correlação de alergia e infecções com fungos e na obtenção de amostras de interesse industrial. No diagnóstico laboratorial de uma infecção micótica o método mais rápido é o exame direto do material em uma lâmina para se determinar se o fungo está presente, porém para um estudo mais detalhado, no qual são necessárias estruturas intactas e separadas, realiza-se o microcultivo (técnica de Ridell). Com a utilização dessa técnica é possível conservar a continuidade entre os esporos, esporóforos e hifas, porém a sua desvantagem é ser mais demorada. Observação macroscópica: Material: - Placas de ágar Sabouraud previamente expostas ao ar em diferentes ambientes. Peptona Ágar Sabouraud 1 g Extrato de Levedura 0,5 g Glicose 2 g Ágar 1,5 g H 2 O destilada 100 ml ph 6,5 Execução, leitura e interpretação Observação macroscópica das colônias: - Tamanho: as colônias leveduriformes têm crescimento limitado, enquanto que as colônias filamentosas têm crescimento invasor. - Textura ou consistência: Cremosas, Butirosas ou Mucóides; Cotonosas; Aveludadas; Serosas; Camurças; Granulosas; Pulverulentas; Membranosas ou Coriáceas; Verrucosas. - Pigmentação da superfície e do verso: Alterada ou Inalterada. - Superfície: Lisa, Fissurada, Rugosa. - Bordas: Regulares, Irregulares, Radiadas. - Topografia: Plana, Convexa, Umbilicada, Pregueada, Cerebriforme. - Cor da colônia: Branca, Preta, Verde, Vermelha, etc. - Aspecto: Brilhante, Opaco, Seco, Ùmido. - Pigmento: presença ou ausência, cor do pigmento, difuso ou restrito à colônia. - Tempo de crescimento: A velocidade de crescimento é variável, podendo ser rápida (< 7 dias), intermediária (8 a 14 dias) ou lenta (> 15 dias), e importante para a identificação presuntiva do fungo. - Diâmetro da colônia. Observa-se aspecto filamentoso dos fungos. 2
Observação microscópica não detalhada Material: - Cultura de Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Curvularia. - Lâminas e lamínulas de microscopia. - Alças de platina em anel, gancho e estilete. - Tubos com salina estéril. - Frascos com lactofenol e azul de metileno. - Bateria de corantes de Gram. - Lâminas preparadas. Fenol Ácido Lático Glicerina Azul de metileno (ou de algodão) Água destilada Lactofenol 20 g 20 g 40 g 0,05 g 20 ml - Solubilizar os cristais de fenol em banho-maria e juntar - Esperar 24 h e filtrar Lacto... clarificação Fenol... fungicida Azul de metileno... corante Execução: - Colocar sobre a lâmina duas gotas de lactofenol (azul de algodão ou azul de metileno). - Retirar com alça de platina em gancho, um pequeno fragmento das colônias dos fungos filamentosos e colocar sobre a lâmina contendo o corante. - Abrir as estruturas com auxílio de estilete e gancho. Cobrir com lamínula e observar com objetivas de 10 e 40 vezes. Leitura e interpretação Observar as estruturas visualizadas - Micélio vegetativo: Clamidoconídio ou artroconídio. Tipo de hifa: septada ou asseptada. - Micélio reprodutivo: esporos endógenos em esporangióforos e esporos exógenos conídios em conidióforos. Conídias: forma e tamanho Tratamento As Clamídias são suscetíveis às tetraciclinas, como doxicilina e a macrolídeos, como eritromicina e azitromicina. A penicilina não é efetiva. A droga de escolha para doenças sexualmente transmissíveis por C. trachomatis é a azitromicina. Prevenção Além do uso de preservativos, principal método para prevenção de DST s, a melhor medida para limitar a transmissão de C. trachomatis é o tratamento correto do paciente e do parceiro sexual, inclusive de indivíduos assintomáticos. 3
Observação microscópica detalhada: Microcultivo Material - Placas de Petri estéreis, montadas com suporte de vidro em forma de V, lâmina, lamínula e algodão hidrófilo; - Água destilada estéril; - Alça de platina, pinça; - Placa contendo meio de ágar Sabouraud ou ágar Fubá divida em cubos; - Corante lactofenol-azul-algodão; - Lâminas de microcultivo de Aspergillus, Penicillium, Rhyzopus, Curvalaria, Cladosporium, M. canis, M. gypseum, T. mentagrophytes, E. floccosum, E. pedrosi, S. schenckii, Rhinocladiellla, Paracoccidioides brasilienses. Fubá Tween 80 Agar Bacteriológico Água destilada Água destilada Agar Fubá 20 g 5 ml 15 g 500 ml 20 ml - Adicionar o fubá em 250 ml de água e ferver até borbulhar. Filtrar o fubá em gaze dobrada em quatro. Dissolver o ágar em 250 ml de água. Restaurar o volume da infusão de fubá para 250 ml, com água quente, juntar as suspensões, ajustar o ph para 6,6 6,8 e adicionar o Tween 80. Esterilizar em autoclave a 120 C por 15 minutos e distribuir em placas de Petri estéreis. Execução - A cultura fúngica a ser utilizada deve ser recente e cultivada em meio sólido; - Transferir um bloco do ágar com o auxílio de uma pinça estéril para a lâmina montada sobre o suporte de vidro (tubo em L) contido dentro de uma placa de Petri, sob condições de assepsia (Figura 1); - Retirar pequenas porções da colônia e semear nos quatro lados do bloco de meio; - Cobrir o bloco com uma lamínula estéril, com cuidado; - Molhar o algodão com água destilada estéril (cerca de 2 ml). A placa funcionará como uma câmara úmida; - Incubar as placas a temperatura ambiente até a observação do crescimento da cultura; - Quando houver desenvolvimento satisfatório, submeta à ação do formol (0,5 ml durante 1 hora), retirar a lamínula do microcultivo, transferindo-a para uma nova lâmina contendo o corante lactofenol azul de algodão em quantidade suficiente para corar o material fúngico aderido na lamínula. Alternativamente pode-se utilizar a lâmina do microcultivo (se houver crescimento). Figura 1: Microcultivo em lâmina para a visualização de estruturas fúngicas. 4
Leitura e interpretação A cultura cresce na lâmina e lamínula, aparecendo as estruturas intactas quando se retira o quadrado de ágar, permitindo assim, o estudo detalhado da micromorfologia dos bolores. Fungos leveduriformes Leveduras são fungos predominantemente unicelulares que se reproduzem assexuadamente por brotamento ou, raramente, fissão binária e sexuadamente pela produção de ascosporos e basidiósporos. Podem filamentar dependendo das condições ambientais, produzindo micélio verdadeiro ou pseudo-micélio. A identificação tradicional das leveduras é baseada na observação de características morfológicas e assimilação de provas bioquímicas como a fermentação de carboidratos (zimograma) e a utilização de fontes de carbono e nitrogênio (auxonograma). As técnicas utilizadas para a observação microscópica dependerão do objetivo do estudo, pode-se observar a estrutura fúngica diretamente com o preparo de lâmina, ou fazendo-se o microcultivo, sendo que o primeiro método é o mais utilizado, visto que o segundo é utilizado quando se necessita observar as pseudo-hifas e esporos produzidos pelas leveduras. Há também a técnica para a coloração de cápsula, essa é feita para permitir a visualização das leveduras capsuladas. Observação macroscópica A observação é feita seguindo o mesmo princípio da observação em fungos filamentosos, para a qual é necessária uma placa de Petri previamente exposta no ambiente. Observa-se um aspecto cremoso das colônias. Material - Culturas de Candida, Rhodotorula e Cryptococcus. - Lâminas e lamínulas de microscopia. - Alças de platina em anel. - Tubos com salina estéril. - Frascos com tinta da china a 50%. - Bateria com corantes de Gram. - Lâminas preparadas. Execução - Fazer esfregaço fino a partir de cultura de Rhodotorula ou Candida, espalhando, com movimentos circulares, o inóculo com a alça de platina em anel sobre uma gota de salina previamente colocada na lâmina; - Corar pelo GRAM; - Examinar com objetiva de imersão; - Observar as estruturas visualizadas, células arredondadas ou esféricas, GRAM positivas, e brotamento ou gemulação. Coloração de cápsula ou Método de Burri: - Colocar pequena porção da cultura de Cryptococcus laurentii entre lâmina e lamínula com duas gotas de tinta da china (1:1 em água destilada). - Examinar ao MO com aumento de 10X e 40X. 5
Leitura e interpretação - As leveduras são células arredondadas ou ovaladas, fortemente Gram positivas. Podem ou não apresentar pseudo-micélio, artrosporos e clamidósporos. A reprodução assexuada se dá por brotamento ou gemulação, com formação de blastosporos. - A cultura de Candida sp é cremosa, esbranquiçada com o verso inalterado. As células são fortemente Gram positivas, sem artrosporos, podendo apresentar clamidosporos ou não e podem apresentar pseudomicélio in vivo (na lesão). - A cultura de C. laurentii é mucóide, castanho claro e com o verso inalterado. A presença de cápsula é visível, por refringência, nas preparações com tinta da china (coloração negativa). As células são ovais ou elípticas, apresentando blastosporos. Este método deve ser realizado quando se necessita de estudo morfológico detalhado das leveduras. È possível estudar as características das células vegetativas das leveduras, como também a formação de pseudo-hifas e dos esporos por multiplicação vegetativa (clamidoconídio, artroconídio e blastoconídio). 6
Literatura sugerida Apostilas de aulas práticas dos cursos de Graduação de Enfermagem, Medicina, Fisioterapia, Veterinária, Odontologia, Ciências Biológicas e Farmácia da UFMG. '