Exercício 2 DNA e Eletroforese Você já aprendeu sobre as enzimas de restrição e como elas clivam o DNA em fragmentos. Você também deve ter notado que, em alguns mapas de restrição, uma enzima pode produzir muitos fragmentos de DNA. Para realizar a digestão com enzimas de restrição, basta acrescentar ao DNA a enzima desejada e deixa-la agir num tempo e temperatura apropriados. Antes de a reação começar, a mistura no tubo parece um fluido claro. Ao término da reação, a mistura continua clara! Olhando apenas para o tubo, como você pode dizer que aconteceu alguma coisa? Para verificar o produto de uma reação de digestão com enzimas de restrição, você deve ser capaz de visualizar os diferentes fragmentos produzidos. Existem corantes químicos que coram o DNA, mas obviamente não é bom adicionar estes corantes à mistura no tubo. No laboratório, os cientistas utilizam um processo chamado eletroforese em gel para separar os fragmentos de DNA de modo que eles podem visualizar o resultado de uma digestão (além de outros procedimentos). A eletroforese em gel utiliza a natureza química do DNA para separar os fragmentos. Sob circunstâncias normais, os grupos fosfato na cadeia do DNA são carregados negativamente. Então, as moléculas de DNA são muito mais atraídas pelo que é carregado positivamente. No gel de eletroforese, as moléculas de DNA são colocadas em um campo elétrico (o qual tem um pólo positivo e um pólo negativo) e vão migrar para o pólo positivo. O campo elétrico faz com que as moléculas de DNA se movam, mas para que elas se separem e sejam distinguidas umas das outras, todo o processo ocorre em um gel (daí vem o nome eletroforese em gel). Para separar o DNA, são utilizados diferentes tipos de gel. O gel mais freqüentemente utilizado na eletroforese de DNA é chamado de agarose e se comporta como uma gelatina comestível, porém sem açúcar e sem cor. Para fazer um gel para DNA (ou para moldar um gel), você deve dissolver a agarose em pó em um tampão fervente, colocar em um recipiente apropriado e deixar resfriar. Enquanto isto esfria, solidifica. Para aplicar o DNA no gel de agarose, utiliza-se um pente apropriado na agarose ainda líquida e já disposta no recipiente. Quando a agarose se solidifica e o pente é retirado, permanece uma fila de pequenos orifícios no gel. As amostras de DNA são colocadas nos poços antes do início da eletroforese.
Para a eletroforese, todo o gel é colocado em uma cuba de eletroforese com um tampão (água sal). É aplicada uma corrente elétrica, a qual vai fluir através do tampão e do gel. Quando a corrente é aplicada, as moléculas de DNA começam a migrar para o pólo positivo do campo elétrico (Figura 2). Fonte de energia DNA Cuba de eletroforese com solução salina Figura 2. Na eletroforese, o gel é colocado em uma cuba com solução salina e é aplicada uma corrente elétrica. O DNA carregado negativamente migra para o pólo positivo. Todo o DNA migra para o pólo positivo, mas o material do gel torna a migração mais difícil para as moléculas de DNA maiores do que para as menores. Então, em um mesmo período de tempo, um fragmento pequeno de DNA pode migrar muito mais longe do que um fragmento grande. Você pode pensar no gel de eletroforese como uma pista de corrida onde os corredores (as moléculas a serem separadas) se separam como atletas em uma corrida real (Figura 3). As moléculas menores correm mais rápidas. Duas moléculas do mesmo tamanho vão correr exatamente juntas. Figura 3. Na eletroforese, os DNAs pequenos sempre ganham.
Após algum tempo, a corrente elétrica é cortada e o gel é colocado em uma solução corante. Após a coloração, o DNA pode ser visualizado. O método mais utilizado pelos pesquisadores é a coloração com brometo de etídio. Quando o brometo de etídio se liga ao DNA, este fluoresce sob luz ultravioleta (UV). (Obs: O brometo de etídio é mutagênico e requer extrema cautela durante a sua utilização e recipientes adequados para descarte). O padrão observado é uma série de riscos (bandas) no gel; cada banda é composta por moléculas de DNA de um tamanho. Na verdade, existem milhões de moléculas de DNA em uma mesma banda, mas elas são do mesmo tamanho (ou de tamanhos muito próximos). Após a digestão com enzimas de restrição, o gel deve apresentar uma banda para cada fragmento de tamanho diferente produzido na digestão. O fragmento menor será aquele que migrou mais longe do poço onde foi colocado a amostra e o fragmento maior será aquele que migrou menos (Figura 4). A B 8.000 2.000 3.000 4.000 9.000 Amostras 9.000 (Não há amostras 8.000 no restante do gel) 1. Digestão com enzima de restrição 2. Eletroforese 3. Visualização e análise do gel 4.000 3.000 2.000 Figura 4. Uma das finalidades da eletroforese em gel é separar produtos de digestão com enzimas de restrição. (A) Mapa de restrição com o tamanho dos fragmentos em pares de base. (B) Esquema de um gel após a eletroforese.
Atividade Nas próximas páginas, você tem três representações de uma molécula de DNA (Apêndice 1) e o esquema de um gel de eletroforese (Apêndice 2). No Apêndice 1 estão representados os sítios de três enzimas de restrição diferentes na mesma molécula de DNA. Você vai simular a digestão deste DNA com cada uma das três enzimas e então vai simular a eletroforese dos fragmentos de restrição em um gel de agarose. 1. Corte as três figuras da molécula de DNA. 2. Simule a atividade da enzima de restrição EcoRI na molécula de DNA que mostra os sítios da EcoRI, cortando a faixa nas linhas verticais que representam os sítios da EcoRI. Após ter digerido a molécula com a EcoRI mantenha os seus fragmentos de restrição. 3. Agora você vai digerir a segunda molécula de DNA com a BamHI. Preserve os fragmentos de restrição obtidos. 4. Faça o mesmo com a última molécula de DNA, utilizando a enzima HindIII. 5. Em seu gel de eletroforese imaginário, você vai separar os fragmentos da EcoRI, BamHI e HindIII como se você tivesse aplicado estas amostras em poços diferentes e adjacentes no gel. Arrume os seus fragmentos como se eles estivessem sido separados através de eletroforese em gel de agarose. (Os fragmentos maiores devem ficar mais próximos dos poços onde as amostras foram aplicadas). 6. Agora, separe os fragmentos BamHI e coloque-os adjacente aos fragmentos EcoRI. Certifique-se de ter ordenado cada fragmento EcoRI corretamente pelo tamanho com relação aos fragmentos BamHI que você já havia disposto. 7. Repita o mesmo procedimento para os fragmentos HindIII. Agora você deve ter três grupos de fragmentos dispostos na sua frente. 8. Agora olhe para o esquema de um gel de eletroforese dado no Apêndice 2. Note que ele tem uma escala de tamanho dado em pares de bases disposta à esquerda dos poços do gel. Utilizando esta escala como um guia, desenhe o padrão obtido com a digestão que você realizou. Utilize um poço para a digestão com EcoRI, outro para a digestão com BamHI e um terceiro para a digestão com HindIII. 9. Utilize as informações obtidas nas fitas de papel que você recortou para desenhar as bandas representando os fragmentos de restrição em pares de bases.
Todos os fragmentos menores no gel estão na frente dos fragmentos maiores? Você notou que o tamanho da escala parece não ter intervalos regulares? Isto ocorre porque os fragmentos de tamanhos diferentes se comportam de forma diferente no gel de agarose. Apêndice 1 Você tem a representação de três moléculas de DNA com 15.000 pares de bases. Cada representação mostra a localização de diferentes sítios de restrição (linhas verticais). Os números entre os sítios de restrição mostram os tamanhos (em pares de bases) dos fragmentos que serão gerados após a digestão do DNA com as respectivas enzimas. Sítios de restrição da EcoRI 4.000 3.500 2.500 5.000 Sítios de restrição da BamHI 6.000 4.000 3.000 2.000 Sítios de restrição da HindIII 8.000 4.500 2.500
Apêndice 2 Esquema de um gel de agarose. EcoRI BamHI HindIII Escala de tamanho em pares de bases Amostras 8.000 6.000 4.000 3.000 2.000