AÇÃO DE ANTIOXIDANTES NA MANUTENÇÃO DA VIABILIDADE ESPERMÁTICA DE SÊMEN BOVINO CRIOPRESERVADO

AÇÃO DE ANTIOXIDANTES NA MANUTENÇÃO DA VIABILIDADE ESPERMÁTICA DE SÊMEN BOVINO CRIOPRESERVADO Natalia do Carmo Silva 1, Karen Martins Leão 2, Thaisa Campos Marques 3, Rossane Pereira da Silva 4, Moraima Castro Rodrigues 4 1 Zootecnista, Instituto Federal de Educação Ciência e Tecnologia Goiano, Câmpus Rio Verde, Goiás, Brasil (nataliazootec@hotmail.com) 2 Doutora, Docente Instituto Federal de Educação Ciência e Tecnologia Goiano, Câmpus Rio Verde, Goiás, Brasil 3 Médica Veterinária Autônoma 4 Zootecnistas, Instituto Federal de Educação Ciência e Tecnologia Goiano, Câmpus Rio Verde, Goiás, Brasil. Recebido em: 30/09/2013 Aprovado em: 08/11/2013 Publicado em: 01/12/2013 RESUMO Os antioxidantes são substâncias que retardam a velocidade da oxidação através da inibição da produção ou dos efeitos deletérios dos radicais livres. Sendo estes radicais livres moléculas que quando submetidas a um estresse se tornam instáveis devido à perda de elétrons. Entretanto a molécula ao se estabilizar leva a um aumento dos radicais tornando o ambiente instável, resultando em um estresse oxidativo. Diversos antioxidantes vêm sendo adicionados aos diluentes de congelação de sêmen bovino no intuito de minimizar os efeitos deletérios causados a membrana dos espermatozóides pelos radicais livres. Dentre os antioxidantes mais comumente utilizados estão: Glutationa, selênio, catalase, vitamina E e cisteína. PALAVRAS-CHAVE: Espermatozoide, Criopreservação, Viabilidade espermática, Radicais Livres. ACTION OF ANTIOXIDANTS IN MAINTENANCE OF SPERM VIABILITY OF BOVINE SEMEN CRYOPRESERVED ABSTRACT Antioxidants are substances that retard the rate of oxidation by inhibiting the production or the deleterious effects of free radicals. Since these molecules radicals when subjected to stress become unstable due to loss of electrons. However stabilize the molecule leads to a radical increase in making the unstable environment, resulting in oxidative stress. Several antioxidants have been added to the diluents for freezing bovine semen in order to minimize the deleterious effects of ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.9, n.17; p. 17 2013

sperm membrane by free radicals. Among the most commonly used antioxidants are: glutathione, selenium, catalase, vitamin E and cysteine. KEYWORDS: Cryopreservation, Free radicals, Sperm, Sperm viability. INTRODUÇÃO A inseminação artificial é uma biotécnica bastante difundida e possui algumas vantagens como: redução na disseminação de doenças pela monta natural, utilização de sêmen de touros de alto valor genético, melhoramento do rebanho em menor tempo com menor custo e utilização de sêmen de touros que estão impossibilitados de realizarem a monta. Portanto, estas inúmeras vantagens tornam a relação custo/beneficio lucrativa. Com os avanços da biotecnologia da reprodução animal, a utilização de sêmen criopreservado na inseminação artificial se destaca como importante ferramenta para o melhoramento genético de várias espécies animais, principalmente na bovinocultura. A criopreservação permite o armazenamento de sêmen por longo período, mantido em nitrogênio líquido e viabiliza o uso do sêmen criopreservado em outras biotécnicas da reprodução. Um dos principais aspectos da criopreservação é a manutenção da qualidade e fertilidade do sêmen após o processamento, estocagem e inseminação. Para isso, a tecnologia da criopreservação vem sendo aprimorada, buscando novas técnicas e diluidores, na tentativa de minimizar a perda de células viáveis durante esses processos. O sucesso da criopreservação de sêmen depende da redução das crioinjúrias causadas aos espermatozóides, mantendo assim sua morfologia e potencial fertilizante. Os danos causados nos espermatozóides durante o processo de criopreservação promovem a redução da motilidade e da integridade morfológica dos espermatozóides, devido à produção excessiva das espécies reativas de oxigênio (TIRELLI et al., 2005). Os radicais livres podem reagir com várias biomoléculas, subtraindo elétrons para sua estabilização, os substratos mais frequentes são os ácidos graxos, proteínas entre outros. A atuação dos radicais nos espermatozóides causa o declínio da motilidade em consequência do estresse oxidativo na membrana da célula, devido à susceptibilidade do espermatozóide a peroxidação lipídica em razão da alta concentração de ácidos graxos (AITKEN & BAKER, 2004). Os antioxidantes são substâncias que retardam a velocidade da oxidação através da inibição da produção ou dos efeitos deletérios dos radicais livres (DUARTE-ALMEIDA et al., 2006). Diversos antioxidantes têm sido adicionados aos diluentes de congelação com o intuito de minimizar os efeitos lesivos as membranas dos espermatozóides pelos radicais livres. O aprimoramento da técnica de criopreservação de sêmen é constante, visando melhorar a viabilidade espermática pós-descongelação, utilizando diferentes diluentes, protocolos de congelação e descongelação e até mesmo adicionando antioxidantes aos diluentes. Desta forma objetivou-se realizar uma revisão de literatura com enfoque na utilização de antioxidantes para criopreservação de sêmen bovino. ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.9, n.17; p. 18 2013

CONSIDERAÇÕES GERAIS ESTRUTURA DOS ESPERMATOZOIDES O espermatozóide é uma célula altamente polarizada e especializada que perde a habilidade de biossíntese, reparo, crescimento e divisão celular durante a fase final da espermatogênese (YOSHIDA, 2000). Os espermatozóides podem ser divididos em duas estruturas distintas: cabeça e cauda. A cabeça, cuja forma, tamanho e estrutura variam entre as espécies e possui duas regiões: acrossomal e pós-acrossomal (SIQUEIRA, 2004), como pode ser visto na figura 1. A característica principal da cabeça do espermatozóide é o núcleo achatado de forma oval, contendo a cromatina altamente compacta. A extremidade anterior do núcleo espermático recoberta pelo acrossoma, uma fina cobertura com dupla camada de membranas que envolvem intimamente o núcleo. (HAFEZ, 1995). A cauda do gameta masculino é composta pelo colo, peça intermediária principal e terminal. A região da cauda entre o colo e o annulus é a peça intermediária. A parte central da peça intermediaria junto com o comprimento total da cauda forma o axonema, onde ocorre a transformação de energia química em mecânica. Contudo, esse conjunto é recoberto externamente por varias mitocôndrias dispostas em forma de hélice, que geram a energia necessária para a motilidade espermática (BEDFORD & HOSKINS, 1990). A membrana plasmática é responsável por envolver todo o espermatozoide e é composta por camadas lipídicas e de proteínas as quais contém fosfolipídeos, colesterol, glicolipídeos, e diferentes tipos de proteínas (ALBERTS et al., 1997). FIGURA 1. Estrutura de um espermatozoide de bovino Fonte: Hafez, 2004. ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.9, n.17; p. 19 2013

As membranas exercem um papel fundamental na manutenção da capacidade fertilizante do espermatozoide. A membrana plasmática é responsável pela manutenção do equilíbrio osmótico, atuando como uma barreira entre o meio intra e extracelular. Lesões nessa estrutura podem levar a perda da homeostase, levando à morte celular (FLESH & GADELLA, 2000). Três lipídeos fazem parte das membranas: fosfolipídeos, glicolipídeos e colesterol, sendo que dentre estes, os fosfolipídios são os mais abundantes (ALBERTS et al., 1997). Sendo o colesterol o principal esterol presente nos espermatozoides e nas membranas celulares dos mamíferos, possuindo importante papel de modular a fluidez e a estabilidade da bicamada lipídica através da sua interação estérica com os fosfolipídios de membrana (PARKS, 1997). Em geral, quanto maior a quantidade de colesterol presente, menos flexível, e/ou menos fluida é a porção da membrana (AMANN & PICKETT, 1987). A resistência ao choque pelo frio é maior nas espécies em que a proporção colesterol: fosfolipídios da membrana plasmática são altos (VALLE & SILVA FILHO, 2001). A membrana plasmática apresenta cerca de 50% de sua massa constituída por proteínas. Portanto, a parte exterior da célula consiste em grande parte de carboidratos, que formam uma cobertura celular, exercendo função primordial na interação com o ovócito (ALBERTS et al., 1997). Nos espermatozoides bovinos a membrana acrossomal externa possui um revestimento de glicoproteínas que possuem afinidades com precursores de enzimas as quais digerem a zona pelúcida para a penetração do espermatozoide no ovócito (CELEGHINI, 2005). CRIOPRESERVAÇÃO A criopreservação de sêmen é uma biotecnologia de grande impacto na reprodução animal. Pois, visa à suspensão do metabolismo espermático e a manutenção de suas características por um tempo prolongado, quando mantido em nitrogênio líquido (PESCH & HOFMAN, 2007). A reprodução animal obteve inúmeros benefícios com a criopreservação, permitindo o maior aproveitamento de animais com alto potencial genético e produtivo, o transporte do sêmen a longas distâncias e formação de bancos de germoplasma, tanto de animais em risco de extinção, como daqueles que não podem ser utilizados na reprodução por razões temporárias ou permanentes (BERTOZOO & ZÚCCARI, 2008). Os processos de criopreservação de sêmen são divididos em: diluição, refrigeração, congelamento, armazenamento e descongelamento. Esses passos estão relacionados com a estrutura funcional e o metabolismo celular das membranas. A manutenção das estruturas espermáticas após o congelamento é devido à interação entre diluidor, crioprotetores e curvas de resfriamento buscando minimizar os danos causados pelo choque frio, desidratação celular e formação de cristais de gelo (CELEGHINI, 2005). Para que o espermatozoide criopreservado possa fertilizar o oócito, deve-se manter alguns atributos, como: motilidade progressiva, metabolismo para a produção de energia, viabilidade das enzimas do acrossoma e proteínas na membrana, sendo importante para a fertilização do oócito e principalmente a ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.9, n.17; p. 20 2013

sobrevivência dos espermatozoides dentro do trato reprodutor feminino (AMANN & PICKETT, 1987). Os espermatozoides possuem vários atributos funcionais que devem ser mantidos até a fertilização. Tendo a criopreservação o intuito de manter a integridade e o maior número de células espermáticas viáveis (WATSON, 2000). Mesmo com as melhores técnicas de criopreservação, obtém-se ainda, em média, a manutenção de apenas 50% de viabilidade da população espermática, dependendo de fatores como, qualidade do ejaculado, métodos de congelamento, tipo de diluidor, tipo de envasamento (mini-palheta, palheta média, ampola, pellets) e métodos de congelação (OHASHI, 2001). O processo de criopreservação das células espermáticas resulta na diminuição da fertilidade quando comparada ao sêmen fresco. Esse prejuízo surge da combinação de alguns aspectos, como perda da viabilidade espermática ou danos na capacidade funcional dos espermatozoides, uma vez que a motilidade e a estrutura dos espermatozoides são afetadas de diferentes formas, podendo ocorrer injúrias nas diferentes etapas de congelação e descongelação (WATSON, 2000). A refrigeração representa o início do estresse térmico submetido às células espermáticas durante o processo de criopreservação. Pois a rápida refrigeração do sêmen das diferentes espécies animais induz a um estresse letal conhecido como choque frio (STORNELLI et al, 2005). A sensibilidade espermática ao choque frio é influenciada pela composição dos fosfolipídeos e pela relação colesterol/fosfolipídeos de membrana, que é particularmente menor em espécies mais sensíveis ao choque frio e a criopreservação (MORAES et al., 2010). O choque frio caracteriza-se pela queda irreversível da motilidade espermática e alterações na estrutura da membrana, pois ocorre um rearranjo dos fosfolipídeos passando do estado líquido para gel levando ao aumento da permeabilidade da célula. As principais injúrias do choque frio ocorrem entre 15 a 5ºC, temperatura a qual o sêmen bovino é mais sensível (STORNELLI et al., 2005). A criopreservação também causa estresse físico e químico alterando a membrana dos espermatozoides, diminui irreversivelmente a motilidade espermática, provoca aumento da degeneração do DNA e liberação intracelular de enzimas, lipídeos e proteínas (BRANDÃO et al, 2006). Durante a criopreservação e descongelação, ocorrem danos como a formação de cristais de gelo intracelular, aumento da concentração intracelular de soluto, e modificações, resultantes da desidratação celular durante a congelação. As lesões celulares podem ser causadas diretamente, afeta estruturas celulares (ruptura de membranas), ou indiretamente, com alteração nas funções celulares através do processo metabólico (HOLT, 2000). A formação de cristais de gelo, durante o processo de congelação implica a um aumento na quantidade de sais que são prejudiciais aos espermatozoides. Essa alta concentração de sais provoca lesões na membrana plasmática, desnaturação de proteínas e danos irreversíveis (AMANN & PICKETT, 1987). Durante o congelamento os espermatozoides são submetidos à produção de EROS que podem induzir a mudanças na estrutura e nas funções espermáticas (BALL et al., 2001), e também o sistema de defesa dos antioxidantes (BILODEAU et al., 2000). Existem diferenças na composição lipídica da membrana plasmática entre as espécies, raças e ainda indivíduos da mesma espécie, o que pode explicar o maior ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.9, n.17; p. 21 2013

ou menor efeito protetor do diluente ao espermatozoide de um determinado indivíduo (HOLT, 2000). A aqueles em que o sêmen tolera os efeitos da criopreservação são denominados de bons congeladores (WATSON, 2000). A velocidade de congelamento é importante, pois as temperaturas de aquecimento dependem diretamente da velocidade da congelação. Se a congelação for lenta, a descongelação também deve ser lenta permitindo assim a fusão dos cristais de gelo extracelulares. A descongelação dos cristais provoca diluição dos solutos e ocorre lentamente a reidratação das células. Se o sêmen for descongelado rapidamente, os cristais de gelo extracelulares descongelam-se muito rapidamente e a água invade bruscamente as células, causando ingurgitamento e danos à membrana plasmática (HOLT, 2000). Os diluentes de congelação de sêmen são compostos com uma ampla variedade de substâncias quimicamente diferentes entre si (açúcares, substâncias tampões, antibióticos), que têm a finalidade de manter os espermatozoides viáveis até o momento de serem introduzidos no trato genital da fêmea (FERREIRA et al., 2005). A composição dos meios diluidores apresenta grande influência sobre a sobrevivência espermática durante o processamento, observando-se uma importante interação entre os componentes do meio e as curvas de refrigeração/congelação (CHAVEIRO et al., 2006). Além da técnica de criopreservação, o tipo de crioprotetor também influencia diretamente no resultado da congelação do sêmen. No caso da espécie bovina, o glicerol vem sendo bastante utilizado e tem apresentado boa eficiência, porém possui influência da curva de congelação utilizada. Recentemente tem sido adicionadas amidas nos meios de diluição de sêmen equino com êxito, entretanto são poucos os trabalhos que utilizam esses crioprotetores com sêmen bovino (MEDEIROS, 2003). SANTOS (2003) destaca que os espermatozoides são altamente sensíveis a efeitos tóxicos dos crioprotetores e estes efeitos dependem principalmente da concentração utilizada e do período de exposição das células a esse agente. Dos componentes essenciais aos meios de criopreservação estão as substâncias iônicas e não iônicas responsáveis pela manutenção da osmolaridade e tamponamento dos diluentes, sendo os crioprotetores como glicerol, etilenoglicol e DMSO (dimetilsulfóxido), fontes de lipoproteínas de alto peso molecular necessárias para prevenção do choque frio. A gema de ovo é bastante utilizada como agente crioprotetor não permeável nos diluidores de criopreservação, atuando na proteção espermática contra o choque frio (MOUSSA et al., 2002). Como fonte de energia utiliza-se açúcares como, glicose e frutose, além de aditivos como antibióticos, antioxidantes, enzimas e detergentes (VISHWANATH & SHANNON, 2000). Os açúcares simples representam a principal fonte de energia presente nos diluentes, oferecendo suporte à manutenção celular e ao movimento espermático. Os antibióticos no diluente de congelação têm uma importante função no controle de crescimento microbiano do sêmen (GRIFFIN, 2004). ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.9, n.17; p. 22 2013

ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO (EROS) Radicais livres são substâncias que apresentam número impar de elétrons, altamente energéticos e instáveis, devido à ação direta de uma fonte de luz e o contato com oxigênio. Essa energia ao atingir o átomo faz com que ocorra a perda de um elétron tornando essa molécula instável. Entretanto, a molécula ao se estabilizar leva a um aumento dos radicais, tornando o ambiente totalmente instável, sendo esse desequilíbrio chamado de estresse oxidativo (NORDBERG & ARNER, 2001). O estresse oxidativo pode ser causado por diversos fatores relacionados com o aumento da produção de EROS e/ou a redução da disponibilidade de antioxidantes, a nutrição inadequada, a permanência dos animais em condições de estresse, inflamações leucocitárias causadas por insuficiências de antioxidantes, a colheita do sêmen e o mais comum é a geração de quantidades excessivas de EROS pelos próprios espermatozoides (PENA et al., 2009). Em condições fisiológicas, um a três porcento de elétrons presentes na cadeia de transporte dos elétrons determinam a formação das EROS (GUERIN et al., 2001). O estímulo a formação de EROS induzido pela congelação pode estar relacionado com alterações na respiração celular e ou estado de repouso das células e também por células espermáticas defeituosas que já morreram durante o processo de criopreservação (BAILEY et al., 2000). Como a membrana plasmática possui grande quantidade de ácidos graxos poliinsaturados, os espermatozoides são células potencialmente susceptíveis aos efeitos deletérios causados pelas EROS (AURICH, 2005). Os antioxidantes são substâncias que agem direta ou indiretamente nas células reduzindo os efeitos tóxicos causados pelos radicais livres. Existem compostos com funções antioxidantes, sendo elas vitamina A, C, E, glutationa, catalase, selênio, zinco e entre outros (INEU, 2007). O principal fator associado ao declínio na motilidade e fertilidade do sêmen estocado a 5 C é o estresse oxidativo que ocorre co mo consequência normal do metabolismo espermático, resultando na queda irreversível da qualidade do sêmen refrigerado (ÇOIAN et al., 2010). Entretanto, as amostras mantidas sob baixa temperatura mesmo com a redução do metabolismo espermático não impedem a formação das EROS, especialmente importante sob condições de aerobiose (KRZYZOSIAK et al., 2001). O impacto do estresse oxidativo durante o processo de estocagem seria minimizado através da suplementação dos meios diluidores com agentes antioxidantes, garantindo maior qualidade ao sêmen refrigerado (MICHAEL et al., 2009). Nesse sentido, diversos antioxidantes como Vitamina C e E, aminoácidos como cisteína, hipotaurina, e enzimas como superóxido dismutase e glutationa peroxidase têm sido utilizados como estratégia para melhorar a viabilidade dos diluidores de criopreservação (GRAAF et al., 2007). Estudos têm confirmado que o espermatozoide e os leucócitos presentes no sêmen são capazes de gerar quantidades controladas de espécies reativas de oxigênio (EROS) e que a susceptibilidade do espermatozoide aos danos oxidativos causados pelas EROS decorrem da alta quantidade de ácidos graxos poliinsaturados presentes na sua membrana plasmática (BAUMBER et al., 2002). BILODEAU et al. (2000) sugeriram que o balanço entre a produção de EROS e a desintoxicação dos mesmos, pode ser um importante fator de sobrevivência e ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.9, n.17; p. 23 2013

funcionalidade dos espermatozoides antes, durante e após sua criopreservação, exercendo influência direta sobre a fertilidade. Estes autores observaram que as principais enzimas antioxidantes envolvidas na desintoxicação das EROS no sêmen bovino são glutationa peroxidase, superoxido dismutase e a glutationa que é um cofator das enzimas, também possui papel antioxidante. Estudos evidenciaram que pequenas quantidades de peróxido de hidrogênio e ânion de hidrogênio são necessárias para a capacitação espermática, reação acrossomal, hiperatividade da motilidade e fusão dos gametas nos bovinos (O FLAHERTY et al., 2003), e eqüinos (BAUMBER et al., 2003). KRZYOSIAK et al. (2000) observaram efeito deletério do H 2 O 2 na motilidade e na viabilidade do espermatozoide bovino durante a incubação à temperatura do ambiente por nove dias. Observaram também aumento na susceptibilidade à desnaturação do DNA espermático. BILODEAU et al. (2001) observaram efeito negativo de H 2 O 2, na motilidade espermática de bovinos. ANTIOXIDANTES Durante o processo da criopreservação do sêmen ocorre redução da motilidade, integridade acrossomal, viabilidade espermática e potencial fertilizante em função da peroxidação lipídica desencadeada pelas EROS, tendo em vista que o espermatozoide dos mamíferos possui altos níveis de fosfolipídeos e ácidos graxos saturados e poliinsaturados (BALL, 2008). Antioxidantes são substâncias que retardam a velocidade da oxidação inibindo a produção ou os efeitos deletérios dos radicais livres (DUARTE-ALMEIDA et al., 2006). Com o objetivo de reduzir danos oxidativos causados pelas EROS, pesquisadores têm adicionado substâncias antioxidantes aos diluentes de sêmen eqüino (BAUMBER et al., 2005), suíno (GADEA et al., 2005), e bovino (BILODEAU et al., 2001). As células somáticas contêm antioxidantes dentro do citoplasma, porém o espermatozoide perde a maioria do seu citoplasma na maturação, dessa forma falta mecanismo que regule e realize as defesas enzimáticas (BAUMBER et al., 2005). Para proteção dos efeitos letais da formação excessiva de EROS, a célula possui um sistema de defesa antioxidante enzimático e um não enzimático, sendo o enzimático composto pelas enzimas: superóxido dismutase (SOD); catalase (CAT), peroxiredoxinas (Prx), glutationa (GSH), glutationa redutase (GR) e glutationa peroxidase (GPx), e os não enzimáticos, que são compostos de baixo peso molecular, que inclui as vitaminas C e E, diferentes compostos de selênio, ubiquinonas (coenzima Q), ácido úrico e ácido lipóico (NORDBERG & ARNÉR, 2001). Os antioxidantes bloqueiam os radicais evitando a peroxidação lipídica dos espermatozoides que causa danos irreversíveis as células (BAUMBER et al., 2000). O controle da concentração das EROS ocorre pela inclusão de antioxidantes aos meios de refrigeração ou pelo uso de condições que reduzem a oxidação durante o congelamento (AGARWAL et al., 2004). BALL et al. (2001) avaliaram o efeito de antioxidantes na manutenção da integridade da membrana a 5ºC, por 72 a 96 horas e mostraram que em alguns casos houve efeito sobre a manutenção da viabilidade espermática de garanhões. ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.9, n.17; p. 24 2013

Entretanto, BALL (2008) relata que a adição de antioxidantes ao sêmen equino criopreservado não mostrou efeito positivo sobre a motilidade pós-descongelação. O estresse oxidativo pode ser reduzido pela adição de antioxidantes ao plasma seminal e aos meios de diluição. Alguns resultados são contraditórios em virtude da concentração e do tipo de antioxidante utilizado, bem como seus mecanismos de ação (BAUMBER, 2005). GLUTATIONA A glutationa (GSH) atua como antioxidante e removedor de radicais livres, como o peróxido de hidrogênio, o qual lesa as células espermáticas, reduz a viabilidade e seu poder fertilizante. É considerada um dos agentes mais importantes do sistema de defesa antioxidante protegendo as células das lesões causadas por radiação, luz ultravioleta e outros fatores (NORDBERG & ARNÉR, 2001). A glutationa é uma enzima antioxidante selênio-dependente, que catalisa a redução do peróxido de hidrogênio na presença da glutationa reduzida (GSH). As EROS são atacadas pela GSH pela facilidade da interação entre as enzimas associadas, tais como a glutationa redutase e glutationa peroxidase (GPx). A glutationa possui outras funções como o metabolismo de prostaglandinas e leucotrienos, síntese de desoxirribonucleotídeos, estocagem e transporte de cisteína, função imune e proliferação celular. A catalase e a GPx os principais varredores enzimáticos de EROS (LUBERDA, 2005). A glutationa está presente em todas as células vivas aeróbicas, sendo o antioxidante mais abundante no meio intracelular. Serve para destoxificar compostos via conjugação em reações catalisadas pela glutationa S-transferase ou diretamente, como é o caso com o peróxido de hidrogênio na reação catalisada pela glutationa peroxidase (NORDBERG & GARNÉR, 2001). A evolução da glutationa indica a correlação entre ela e o metabolismo aeróbico, mostrando que essa molécula evoluiu para proteger as células contra a toxicidade causada pelo oxigênio (LUBERBA, 2005). OLIVEIRA (2011) avaliou o efeito in vitro da adição de glutationa em cincos concentrações, (Controle, 2,5; 5,0; 7,5 e 10 mm) e concluiu que a adição de 2,5 mm de glutationa ao diluente de congelação foi eficiente para preservar a motilidade total e incrementar a integridade e a motilidade progressiva do sêmen equino. Porém, as concentrações superiores a 2,5 mm causaram danos aos espermatozoides. SELÊNIO O selênio é um precursor da glutationa, a qual protege as células dos efeitos dos radicais livres, por meio da destruição de peróxidos de hidrogênio que lesam as células levando a morte celular. A deficiência de selênio reduz a atividade dessa enzima resultando em exposição das células as EROS, alterando assim suas estruturas de proteínas, lipídios e outras moléculas (NICOLODI, 2010). O selênio, micronutriente essencial, e precursor de enzimas antioxidantes que protegem o organismo contra a ação das espécies reativas de oxigênio, também é responsável pelas repostas imunológicas, locomoção dos espermatozoides e metabolismo de ácidos graxos (HADDAD & ALVES, 2006). ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.9, n.17; p. 25 2013

CATALASE A catalase cataliza a redução do peróxido de hidrogênio em água e oxigênio molecular. É encontrada no fígado, rins, medula óssea e mucosa, sendo sua principal função, diminuir o risco de formação do radical hidroxila a partir do H 2 O 2. (NORDBERG & ARNÉR, 2001). BAUMBER et al. (2002) observaram um efeito benéfico da adição de catalase ao diluidor do sêmen de equinos devido à catalase ter reduzido a geração de H 2 O 2 pelos neutrófilos ativados, previne o declínio na motilidade espermática total. Portanto, os autores concluíram que o estresse oxidativo pode ser minimizado com a adição de catalase. VITAMINA E OU - αtocoferol A vitamina E são compostos lipossolúveis chamados de tocoferóis, o mais encontrado nos alimentos é o α-tocoferol (SOUZA & FERREIRA, 2007). Além de promover à integridade morfológica e funcional dos músculos e vasos, possui papel antioxidante e participa da formação estrutural das membranas biológicas (CARVALHO et al., 2003). A quantidade de α-tocoferol no sêmen, no plasma seminal e nos tecidos é variável e dependem do tipo e da concentração utilizada na dieta (SOUZA & FERREIRA, 2007). A vitamina E é o principal antioxidante da membrana das células e atua na proteção contra os ácidos graxos poliinsaturados evitando a oxidação, impedindo a formação de lipoperóxidos tóxicos e aumentando a resistência das células aos peróxidos de hidrogênio e ainda destruindo os peróxidos livres (NICOLODI et al., 2010). CISTEÍNA A cisteína é um aminoácido e antioxidante não enzimático produzido de forma endógena o qual previne a peroxidação lipídica, sendo também precursora da glutationa e com isso aumenta os níveis da glutationa reduzida (BILODEAU et al., 2001). OLIVEIRA (2011) avaliou o efeito in vitro da adição de císteina em protocolos de refrigeração de sêmen equino e concluiu que a císteina pode reduzir a velocidade da motilidade progressiva e da integridade a partir de 24 horas de refrigeração a 16º C. A concentração de císteina de 1,0 mm mostrou-se mais eficiente para proteção da célula. CONSIDERAÇÕES FINAIS Durante o processo de criopreservação o sêmen é exposto ao oxigênio, luz e vários outros fatores que podem levar a produção das EROS. Entretanto, os espermatozoides podem ser protegidos da peroxidação lipídica, utilizando diluentes acrescidos de antioxidantes. A susceptibilidade ao estresse oxidativo varia entre indivíduos, espécies e ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.9, n.17; p. 26 2013

entre ejaculados sendo que o impacto do estresse oxidativo na fertilidade e estrutura do sêmen é uma questão do grau de estresse e não a presença ou ausência de EROS no sêmen. As propriedades antioxidativas dos diluentes usados para a criopreservação de sêmen são pouco conhecidas e os efeitos da produção excessiva de EROS nesses diluentes também não são bem caracterizados, o que justifica a necessidade de mais estudos relacionados à utilização dos antioxidantes sobre a viabilidade do sêmen bovino. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AITKEN, R. J; BAKER, M. A. Oxidative stress and male reproductive biology. Reproduction, fertility and development, v. 16, p.581-588, 2004. ALBERTS, B.; BRAY, D.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WATSON, J.D. Biologia Molecular da célula. 3 ed. Editora Artes Médicas, 1997, 1294p. AGARWAL, A.; NALLELLA, K. P.; ALLAMANENI, S. S.; SAID, T. M. Role of antioxidants in treatment of male infertility: an overview of the literature. Reproductive Biomedicine online, v.8, n.6, p.616-627, 2004. AMANN, R. P.; PICKETT, B. W. Principles of cryopreservation and review of cryopreservation of stallion spermatozoa. Journal of Equine Veterinary Science, v.7, p. 145-173, 1987. AURICH, C. Factors affecting the plasma membrane function of cooled-stored stallion spermatozoa. Animal Reproduction Science, v.89, n.1-4, p.65-75, 2005. BAILEY, J. L.; BILODEAU, J. F.; CORMIER, N. Semen preservation in domestic animals: a damaging and capacitating phenomenon. Jounal of Andrology, v.21, n. 1, p.1-7, 2000. BAUMBER, J.; BALL, B. A.; GRAVANCE, C. G.; MEDINA, V.; DAVIEL-MORE, M. C. G. The effect of reative oxygen species on equine sperm motility, viability, acrossomal integrity, mitochondrial membrane potential, and membrane lipid peroxidation. Journal of Andrology, v.21, p.895-902, 2000. BAUMBER, J.; VO, A.; SABEUR, K.; BALL, B. A. Generation of reactive oxygen species by equine neutrophils and their effect on motility of equine spermatozoa. Theriogenology, v. 57, n.3, p.1025-1033, 2002. BAUMBER, J.; SABEUR, K.; VO, A.; BALL, B. A. Reactive oxygen species promote tyrosine phosphorylation and capacitation in equine spermatozoa. Theriogenology, v.60, n.7, p.1239-1247, 2003. BAUMBER, J.; BALL, B. A.; LINFOR, J. J. Assessment of cryopreservation of equine spermatozoa in the presence of enzyme scavengers and antioxidants. American Journal of Veterinary Research, v.57, n. 5, p. 772-779, 2005. ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.9, n.17; p. 27 2013

BALL, B. A.; VO, A. T.; BAUMBER, J. Generation of reactive oxygen species by equine spermatozoa. American Journal of Veterinary Research, v.62, n. 4, p.508-515, 2001. BALL, B. A. Oxidative stress, osmotic stress and apoptosis: Impacts on sperm function and preservation in the horse. Animal Reproduction Science, v.107, n. 3, p.257-267, 2008. BRANDÃO, A. C.; ARRUDA, R. P.; MADUREIRA, E. H.; MARTINS, J. F. P.; ASSUMPÇÃO, M. E. O. D.; VISINTIN, J. A. Influência do glicerol e etilenoglicol e da criopreservação sobre o complexo DNA-Proteina de espermatozóides em garanhões. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, Supl, São Paulo, v. 43, p. 68-73, 2006. BEDFORD, J. M. & HOSKINS, D. D. The mammalian spermatozoon: morphology, biochemistry and physiology. In: Lamming, G. E. Marshall's Physiology of Reproduction. v.2. London, Churchill Livingstone, 1990. pp. 379-568. BERTOZZO, B. R.; ZÚCCARI, C. E. S. N. Efeito da adição do colesterol ao meio de incubação do sêmen bovino congelado sobre a integridade das membranas plasmática e acrossomal. 10, 2008. Disponível em: http://www.propp.ufms.br. Acesso em 04 de Out, 2010. BILODEAU, J. F.; SUVRO-CHATTERJEE., SIRARD, M. A. Levels of antioxidant defenses are decrease in bovine spermatozoa after a cycle of freezing and thawing. Molecular Reproduction and Development, v. 55, n. 3, p. 282-288, 2000. BILODEAU, J. F.; BLANCHETTE, S.; GAGNON, C.; SIRARD, M. A. Thiols prevent H2O2-mediated loss of sperm motility in cryopreservation bull semen. Theriogenology, v.56, n. 3, p.275-286, 2001. CARVALHO, F. A. N.; BARBOSA, A. B.; MCDOWELL, L. R. Nutrição de Bovinos à Pasto. 2ed. Belo Horizonte: Papelform, 2003. 438p. CELEGHINI, E. C. C. Efeitos da criopreservação do sêmen bovino sobre a membrana plasmática, acrossomal e mitocondrial e estrutura da cromatina dos espermatozóides utilizando sondas fluorescentes. 2005. 186f. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária e Reprodução Animal) Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, São Paulo. CHAVEIRO, A.; MACHADO, L.; FRIJTERS, A.; ENGEL, B.; WOELDERS, H. Improvement of parameters of freezing protocol for bull sperm using two osmotic Supports. Theriogenology, v.65, n.9, p.1875-1890, 2006. ÇOIAN, K.; BASPINAR, N.; BUCAK, M. N.; AKALIN, P. P.; ATAMAN, M. B.; ÖMÜR, A. D.; GÜNGÖR, S.; KÜRÜKÜNAY, S.; ÖZKALP, B.; SARIÖZKAN, S. Influence of methionine and dithioerythritol on sperm motility, lipid peroxidation and antioxidant capacities during liquid storage of ram semen. Research in Veterinary Science, ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.9, n.17; p. 28 2013

v.89, n.3, p.426-431, 2010. DUARTE-ALMEIDA, J. M.; SANTOS, R. J.; GENOVESE, M. I.; LAJOLO, F. M. Avaliação da atividade antioxidante utilizando sistema-caroteno/acido linoléico e métodos de seqüestro de radicais DPPH. Ciência e tecnologia de alimentos, v.26, n.2, p.446-452, 2006. FERREIRA, F. M.; WENTZ, I.; SCHEID, I. R.; AFONSO, S. B.; GUIDONI, A. L.; BORTOLOZZO, F. P. Comportamento de monta e características seminais de suínos jovens landrace e large white. Ciência Rural, v. 35, p.131-137, 2005. FLESCH, F. M.; GADELLA, B. M. Dynamics of the mammalian sperm plasma membrane in the process of fertilization. Biochemistry and Biophysic, v. 1469, p. 197-235, 2000. GADEA, J.; GARCÍA-VAZQUEZ, F.; MATÁS, C.; GARDÓN, J.C.; CÁNOVAS, S.; GUMBAO, D. Cooling and freezing of boar spermatozoa: Supplementation of the freezing media with reduced glutathione preserves sperm function. Journal of Andrology, v.26, p.396-404, 2005. GRAAF, S. P.; EVANS, G.; GILLAN, L.; GUERRA, M. M. P.; MAXWELL, W. M. C.; O BRIEN, J. K. The influence of antioxidant, cholesterol and seminal plasma on the in vitro quality of sorted and non-sorted ram spermatozoa. Theriogenology, v.67, p.217 227, 2007. GUERIN, P. F.; MOUATASSIM, S.; MENEZO, Y. Oxidative stress and protection against reactive oxygen species in the pre-implantation embryo and its surroundings. Human Reproduction Update, v.7, n. 2, p.175-189, 2001. GRIFFIN, E. M. Development of an extender protocol to enhance the viability of frozen-thawed bovine spermatozoa. 2004. 212f. Dissertação (Mestrado, Área de Concentração: Reprodução Animal) Texas A&M University, Houston/Texas, USA, 2004. HADDAD, C. M.; ALVES, F. V. Novos conceitos e tecnologias na suplementação mineral de bovinos. Congresso Latino Americano de Nutrição Animal. 2ed. 10-13 jun. 2006. HAFEZ, E. S. E.; HAFEZ, B. Capítulo 04. Ciclos reprodutivos. Reprodução Animal. 7 a edição. 499 páginas. Barueri: Manole LTDA, 499 páginas. p: 55-68. 2004. HAFEZ, E. S. E. Preservação e criopreservação de gametas e embriões. In:. Reprodução Animal. 6. ed. São Paulo: Manole, Cap. 24, p. 513-535, 1995. HOLT, W. V. Basic aspects of frozen storage of semen. Animal Reproduction Science, v. 62, p. 03-22, 2000. INEU, R. P. Atividade antioxidante do e-1,1-metiltioselenofenil- 2- pirrolidinonahepteno: um composto orgânico de selênio com baixa toxicidade. Santa Maria, 2007. ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.9, n.17; p. 29 2013

97p. Dissertação (Mestrado em Bioquímica Toxicológica) - Universidade Federal de Santa Maria. KRZYZOSIAK, J.; EVENSON, D.; PITT, C.; JOST, L.; MOLAN, P.; VISHWANATH, R. Changes in susceptibility of bovine sperm to in situ DNA denaturation, during prolonged incubation at ambient temperature under conditions of exposure to reactive oxygen species and nuclease inhibitor. Reproduction Fertility Development, v.12, p.251-261, 2000. KRZYZOSIAK, J.; MOLAN, P.; McGOWAN, L.; VISHWANATH, R. Effect of sperm number and oxygenation state of the storage media on in vitro fertility of bovine sperm stored at ambient temperature. Theriogenology, v.55, p.1401-1415, 2001. LUBERBA, Z. The role of glutathione in mammalian gametes. Reproductive Biology, v.5, p.5-17, 2005. MEDEIROS, A. S. Utilização de vários tipos de amidas como agentes crioprotetores para espermatozóides de garanhões. 2003. 78 f. Dissertação (Mestrado) Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2003. MICHAEL, A. J.; ALEXOPOULOS, C.; PONTIKI, E. A.; HADJIPAVLOU-LITINA, D. J.; SARATSIS, P.; VERVERIDIS, H. N.; BOSCOS, C. M. Effect of antioxidant supplementation in semen extenders on semen quality and reactive oxygen species of chilled canine spermatozoa. Animal Reproduction Science, v.112, p.119 135, 2009. MORAES, E. A.; GRAHAM, J. K.; TORRES, C. A. A.; MEYERS, M.; SPIZZIRI, B. Delivering cholesterol of cholestanol to bull sperm membranes improves cryosurvival. Animal Reproduction Science, v.118, p.148 154, 2010. MOUSSA, M.; MARTINET, V.; TRIMECHE, A.; TAINTURIER, D.; ANTON, M. Low density lipoproteins: extracted from hen egg yolk by an easy method: cryoprotective effect on frozen-thawed bull semen. Theriogenology, v57, p. 1695-1706, 2002. NICOLODI, P. R. S. J.; CAMARGO, E. V.; ZENI, D.; ROCHA, R. X.; CYRILO, F. C.; SOUZA, F. N.; LIBERA, A. M. M. D.; BONDAN, C.; LEAL, M. L. R. Perfil protéico e metabolismo oxidativo de cordeiros experimentalmente infectados pelo Haemonchus contortus e suplementados com selênio e vitamina E. Ciência Rural, Santa Maria, v.40, n.3, p.561-567, 2010. NORDBERG, J.; ARNÉR, E. S. J. Reactive oxygen species, antioxidants and the mammalian thioredoxin system. Free Radical Biology & Medicine, v. 31, n.11, p. 1287-1312, 2001. O FLAHERTY, C.; BEORLEGUI, N.; BECONI, M. T. Participation of superoxide anion in the capacitation of cryopreserved bovine sperm. Journal of Andrology, v.26, p.109-114, 2003. ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.9, n.17; p. 30 2013

OHASHI, O. M. Inseminação Artificial de Bubalinos. In: GONSALUES, P. B., FIQUEIREDO, J. R, FREITAS, V. J. F., Biotécnicas Aplicadas a Reprodução Animal. Livraria Varela, p. 97-110, 2001. OLIVEIRA, R. A. Antioxidantes na Viabilidade do Sêmen Equino Congelado e Resfriado. (Tese de Doutorado em Ciência Animal). Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás. Goiânia, GO. 90f. 2011. PARKS, J. E. Hypothermia and Mammalian gametes, In: KAROW, A.M.; CRITSER, J.K. (Eds.) Reproduction Tissue Banking: scientific principles. San Diego: Academic Press, 1997. p. 229-261. PENA, F. J.; RODRIGUEZ MARTINEZ, H.; TAPIA., J. A.; ORTEGA FERRUSOLA, C.; GONZALEZ FERNANDEZ, L.; MACIAS GARCIA, B. Mitochondria in mammalian sperm physiology and pathology: a review. Reproduction in Domestic Animals, 44(2), 345-349, 2009. PESCH, S.; HOFFMANN, B. Cryopreservation of spermatozoa in veterinary medicine. Journal fur Reproductionsmedizin Endokrinologie, V2, p. 101-105. 2007. SANTOS, O. E. C. Viabilidade in vitro do sêmen de cão submetido a congelação com diferentes diluidores e crioprotetors. Belo Horizonte, MG: UFMG. 60f. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária)- Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais, 2003. SIQUEIRA, J. B. Relação da fertilidade de sêmen bovino congelado com teste de avaliação espermática in vitro. 2004. 91p. Tese (Mestrado) Universidade Federal de Viçosa. SOUZA, J. D. S.; FERREIRA, W. M. O papel da vitamina e na nutrição e reprodução animal: meios de defesa contra os radicais livres. Revista Eletrônica Nutritime [on line], v.4, n.3, p.456-461, 2007. STORNELLI, M. C.; TITTARELLI, C. M.; SAVIGNONE, C. A.; STORNELLI, M. A. Efecto de los procesos de criopreservación sobre la fertilidad seminal. Analecta Veterinária, v.25, n.2, p.28-35, 2005. TIRELLI, M.; BASINI, G.; GRASSELLI, F.; BIANCO, F & TAMANINI C. Cryopreservation of pig granulosa cells: effect of FSH addition to freezing medium. Domestic Animal Endocrinology. v. 28, n. 1, p.17-33, 2005. VALLE, G. R.; SILVA FILHO, J. M. Membrana plasmática do espermatozóide. Cadernos Técnicos de Veterinária e Zootecnia, n. 36, p. 45-53, 2001. VISHWANATH, R.; SHANNON, P. Storage of bovine semen in liquid and frozen state. Animal Reproduction Science, v.62, p.23-53, 2000. WATSON, P. F. The causes of reduced fertility with cryopreserved semen. Animal ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.9, n.17; p. 31 2013

Reproduction Science, v. 60-61, n.2, p.481-492, 2000. YOSHIDA, M. Conservation of sperms: current status and new trends. Animal Reproduction Science 2000; 60-61: 349-355. ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, v.9, n.17; p. 32 2013