EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO DE CISTEAMINA AO MEIO DE MATURAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS EQÜINOS

Transcrição

1 EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO DE CISTEAMINA AO MEIO DE MATURAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS EQÜINOS Autor(es): Apresentador: Orientador: Revisor 1: Revisor 2: Instituição: LEON, Priscila Marques Moura; SANTOS, Elisa Caroline da Silva; RAMBO, Gissele; LUCIA JR, Tomaz; DESCHAMPS, João Carlos Priscila Marques Moura de Leon João Carlos Deschamps Marta Gonçalves Amaral Tiago Collares UFPel EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO DE CISTEAMINA AO MEIO DE MATURAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS EQÜINOS LEON, Priscila Marques Moura 1 ; SANTOS, Elisa Caroline da Silva 2 ; RAMBO, Gissele 1 ; LUCIA Jr., Thomaz 3 ; DESCHAMPS, João Carlos 3 1 Mestranda em Medicina Veterinária/UFPel; 2 Mestranda em Biotecnologia Agrícola, FAEM/UFPel; 3 Prof. Dep. Patologia-Faculdade de Veterinária/UFPel Centro de Biotecnologia - UFPel Campus Universitário CEP primleon@hotmail.com 1. INTRODUÇÃO O processo de maturação, que deve conferir ao oócito a capacidade de ser fertilizado assim como a de desenvolvimento embrionário, ocorre em duas fases. A primeira de crescimento, com síntese de proteínas e formação de organelas, e a segunda com modificações nucleares e citoplasmáticas (Fissore et al., 2002; Fernades, 2004). As taxas de maturação in vitro (MIV) de oócitos eqüinos são baixas, quando comparadas as de outras espécies, obtêm-se entre 40 a 60% de oócitos atingindo o estágio de metáfase II (Dell Aquila et al., 1997). As razões para a falha dos oócitos eqüinos em completar a meiose durante a MIV são desconhecidas, podendo estar ligadas a alterações na cascata bioquímica envolvida na meiose (Goudet et al., 1998; Fernandes, 2004). Uma grande variedade de meios de cultivo vem sendo utilizada para avaliar o efeito de diferentes componentes do soro, macromoléculas, hormônios, fatores de crescimento e adição de células somáticas na MIV em eqüinos (Carneiro, 2002). Os compostos tióis de baixo peso molecular, como a cisteamina e b-mercaptoetanol, quando presentes na MIV de oócitos bovinos e ovinos, estimulam a síntese de glutationa (GSH), aumentando os índices de desenvolvimento embrionário (Matos et al., 1996; Matos et al., 2003).

2 Resultados similares foram obtidos em suínos (Grupent et al., 1995) e búfalos (Gasparrini et al., 2003). Pois, o GSH presente nas células de mamíferos tem um importante papel de proteção contra o dano oxidativo (Meister & Tate, 1976). O presente estudo teve como objetivo examinar o efeito da suplementação de cisteamina ao meio de maturação in vitro, através da análise da viabilidade de membrana e taxa de maturação de oócitos eqüinos. 2. MATERIAL E MÉTODOS Foram utilizados 80 ovários coletados em abatedouro de Pelotas/RS, no período de julho a agosto de Os ovários foram transportados em solução de NaCl 0,9% por aproximadamente 1 hora à 32-35ºC até o laboratório de Reprodução Animal/UFPel, onde foi realizado o experimento. Os complexos cumulus-oócito (COC) foram coletados por aspiração dos folículos entre 10 a 30 mm de diâmetro e mantidos em fluído folicular até o momento da maturação. A maturação in vitro foi realizada em placa de petri (Nunc, Dinamarca) contendo 20 oócitos em cada gota de 200µl de TCM 199 (Sigma, St. Louis), adicionado de 10UI de FSH (Foltropin V, Vetepharm, Canadá), 10UI de LH (Lutropin V, Vetepharm, Canadá), 10% de soro fetal bovino (Sigma, St. Louis), sulfato de amicacina e cisteamina (Nutricel, Brasil). Os 227 oócitos coletados foram divididos aleatoriamente em três grupos durante a MIV: a) controle (meio não suplementado); b) suplementado com 50 µm de cisteamina; c) suplementado com 100 µm de cisteamina. Depois de 40 horas de incubação, a 38,7ºC em atmosfera de 7% de CO 2, foi realizada a retirada das células do cumulus por pipetagem em solução de 80 UI de hialuronidase (Sigma, St. Louis). Para avaliação da viabilidade de membrana e do estágio de maturação, os oócitos foram transferidos para solução contendo 10 µg/ml Hoechst (Sigma, St. Louis), 1 µg/ml de diacetato de fluoresceína (Sigma, St. Louis) e 50 µg/ml de iodeto de propídio (Sigma, St. Louis) e incubados durante 10 min a 38,7ºC. Para posterior montagem das lâminas e observação em luz UV no microscópio de epifluorescência. Na avaliação da maturação nuclear os oócitos podem ser classificados em: vesícula germinativa (VG), apresentando núcleo esférico localizado central ou perifericamente no ooplasma; quebra de vesícula germinativa (QVG), núcleo com carioteca irregular ao redor da cromatina condensada ou dispersa; metáfase I (MI), cromossomos arranjados na placa metafásica na periferia do ooplasma; e metáfase II (MII), cromossomos metafisários na periferia do ooplasma e corpúsculo polar no espaço perivitelínico (Fernades, 2004). Quanto a viabilidade de membrana, os oócitos que apresentam algum dano de membrana aparecem em vermelho, pois são corados pelo iodeto de propídio, sendo a intensidade da coloração proporcional a lesão. Já os oócitos que estão íntegros são corados pelo diacetato de fluoresceína, então são observados em verde. E o material nuclear é corado de azul pelo Hoechst 33342, tanto oócitos íntegros como lesionados (Somfai et al., 2006). Os resultados foram submetidos ao teste Qui-quadrado do programa Statistix RESULTADOS E DISCUSSÃO

3 A média de recuperação foi de 2,82 oócitos/ovário, e a taxa de maturação do grupo controle foi de 44,3% de oócitos em MII, resultados estes compatíveis aos já citados por Dell aquila et al. (1997); Carneiro (2002) e Fernades (2004). A tabela 1 mostra o estágio de maturação dos oócitos avaliados, e a análise da viabilidade de membrana de acordo com o tratamento de MIV está representada na tabela 2. Tabela 1 - Estágio de maturação dos oócitos maturados in vitro sem a suplementação de cisteamina ao meio (controle), suplementado com 50µM cisteamina e suplementado com 100 µm cisteamina. Tratamento VG QVG MII Total controle 34 (43%) a 10 (12,7%) a 35 (44,3%) a 79 50µM cisteamina 26 (46,4%) a 7 (12,5%) a 23 (41,1%) a µm cisteamina 23 (26,1%) b 16 (18,2%) a 49 (55,7%) b 88 Total Tabela 2 - Viabilidade de membrana dos oócitos maturados in vitro sem a suplementação de cisteamina ao meio (controle), suplementado com 50µM cisteamina e suplementado com 100 µm cisteamina. Tratamento Lesionado Pequena lesão Intacto Total controle 8 (10,1%) a 10 (12,7%) a 61 (77,2%) a 79 50µM cisteamina 5 (8,9%) a 8 (14,3%) a 43 (76,8%) a µm cisteamina 23 (26,1%) b 18 (20,5%) a 47 (53,4%) b 88 Total A adição de 100µM de cisteamina ao meio de maturação melhorou a taxa de maturação quando comparada ao grupo controle (p<0,05) e suplementado com 50µM de cisteamina (p<0,05). Porém, a viabilidade de membrana foi menor no grupo de oócitos suplementados com 100µM de cisteamina quando comparado com o controle (p<0,05), e com oócitos suplementados com 50µM de cisteamina (p<0,05). A presença da cisteamina durante a maturação de oócitos imaturos de camundongos adultos melhorou significativamente a maturação nuclear até o estágio de metáfase II. Além disso, a maturação não foi afetada por um curto período de incubação em ambiente seco e deficiente de CO 2 (Matos et al., 2003). As células do cumulus são capazes de promover a maturação e síntese de GSH em presença de cisteamina (Matos et al., 1997; Sutton et al., 2003, Bing et al., 2002). A adição de cisteamina ao meio de maturação também tem mostrado melhora na maturação, fertilização e desenvolvimento embrionário de oócitos maturados in vitro de bovinos (Bing et al., 2002) e suínos (Chen et al., 2005). A melhor concentração de cisteamina usada nestes estudos foi de 100 µm. 4. CONCLUSÕES

4 Os resultados mostram que a suplementação de 100 µm cisteamina ao meio de maturação in vitro de oócitos eqüinos aumenta a taxa de oócitos que atingem o estágio de metáfase II. Porém maiores estudos são necessários para elucidar a diminuição na viabilidade de membrana observada nestes oócitos, já que até o presente momento não é citado o uso da cisteamina na MIV de oócitos eqüinos. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BING, Y. Z.; HIRAO, Y.; IGA, K.; CHE, L. M.; TAKENOUCHI, N.; KUWAYAMA, M. In vitro maturation and glutathione synthesis of porcine oocytes in the presence or absence of cysteamine under different oxygen tensions: role of cumulus cells. Reprod. Fertil. Dev., 14, p , CARNEIRO, G. F. Maturação in vitro de oócitos eqüinos. Ciência e Tecnologia Veterinária, v. 2, n. 2, p , CHEN, N.; LIOW, S. L.; YIP, W. Y., TAN, L. G.; NG, S. C. Influence of cysteamine supplementation and culture in portable dry-incubator on the in vitro maturation, fertilization and subsequent development of mouse oocytes. Theriogenology, 63, p , DELL AQUILA, M. E.; CHOI, Y. S.; MINOIA, P.; TRAINA, V.; FUSCO, S.; LACALANDRA, G. M.; MARITATO, F. Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) versus conventional IVF on abattoir-derived and in vitro-matures equine oocytes. Theriogenology, 47, p , FERNANDES, C. B. Maturação in vitro de ovócitos eqüinos: comparação entre os meios TCM 199, SOFaa e HTF:BME, e avaliação da adição de FSH bovino, FSH eqüino e do hormônio de crescimento eqüino por meio da transferência de ovócitos. Botucatu, 2004, 129 fl, Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária), Pós-graduação em Medicina Veterinária, UNESP, FISSORE, R. A.; KUROKAWA, M.; KNOTT, J.; ZHANG, M.; SMYTH, J. Mechanisms underlying oocyte activation and postovulatory ageing. Reproduction, 124, p , GASPARRINI, B.; SAYOUD, H.; NEGLIA, G.; DE MATOS, D. G.; DONNA, Y. B. I.; ZICARELLI, L. Glutathione synthesis during in vitro maturation of buffalo (Bubalus bubalis) oocytes: effects of cysteamine on embryo development. Theriogenology, 60, p , GOUDET, G.; BELIN, F.; BEZARD, J.; GERARD, N. Maturation-promoting factor (MPF) and mitogen activated protein kinase (MAPK) expression in relation to oocyte competence for in vitro maturation in the mare. Molecular Human Reproduction, 4, p , GRUPENT, C. G.; NAGASHIMA, H.; NOTTLE, M. B. Cysteamine enhances in vitro development of porcine oocytes matured and fertilized in vitro. Biol. Reprod., 53, p , MATOS, D. G.; FURNUS, C. C.; MOSES, D. F.; MARTINEZ, A. G.; MATKOVIC M. Stimulation of glutathione synthesis of in vitro matured bovine oocytes and its effect on embryo development and freezability. Mol. Reprod. Dev., 45, p , MATOS, D. G.; FURNUS, C. C.; MOSES, D. F. Glutathione synthesis during in vitro maturation of bovine oocytes: role of cumulus cells. Biol. Reprod., 57, p , 1997.

5 MATOS, D. G.; HERRERA, C.; CORTVRINDT, R.; SMITZ, J.; VAN SOOM, A.; NOGUEIRA, D. Cysteamine supplementation during in vitro maturation and embryo culture: a useful tool for increasing the efficiency of bovine in vitro embryo production. Mol Reprod. Dev., 62, p.203 9, MATOS, D. G.; NOGUEIRA, D.; CORTVRIND, R.; HERREA, C.; ADRIAENSSENS, T.; PASQUALINI, R. S.; Capacity of adult and prepubertal mouse oocytes to undergo embryo development in the presence of cysteamine. Mol. Reprod. Dev., 64, p , MEISTER, A.; TATE, S.S. Glutathione and the related -glutamyl compounds: biosynthesis and utilization. Ann. Rev. Biochem., 45, p , SOMFAI, T.; DINNYES, A.; SAGE, D.; MAROSAN, M.; CARNWATH, J. W.; OZAWA, M.; K. KIKUCHI, K.; NIEMANN, H. Development to the blastocyst stage of parthenogenetically activated in vitro matured porcine oocytes after Solid Surface Vitrification (SSV). Theriogenology, 66, p , SUTTON, M. L.; GILCHRIST, R. B.; THOMPSON, J. G. Effects of in vivo and in vitro environments on the metabolism of the cumulus oocyte complex and its influence on oocyte developmental capacity. Hum. Reprod. Update, 9, p , 2003.