DESENVOLVIMENTO DE TRÊS BIOSSENSORES A BASE DE TIROSINASE E DIFERENTES NANOPARTICULAS PARA DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS.

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1 DESENVOLVIMENTO DE TRÊS BIOSSENSORES A BASE DE TIROSINASE E DIFERENTES NANOPARTICULAS PARA DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS. Eliana Rezende Kray de Almeida Faculdade de Química Ceatec elianakrayalmeida@hotmail.com Renata Kelly Mendes Valente Metrologia Química,Quimiometria e Química Analítica-Ceatec renatavalente@puc-campinas.edu.br RESUMO: A utilização de nanopartículas no desenvolvimento de biossensores permite uma amplificação da resposta eletroquímica e, consequentemente, elevação da sensibilidade do dispositivo. Na literatura, há diversos estudos mostrando este efeito, mas não há um estudo comparativo entre os diferentes tipos de nanopartículas e sua influência na resposta avaliada. Neste contexto, o trabalho tem como objetivo o estudo da influência do uso de diferentes nanopartículas na resposta de um biossensor para a determinação de compostos fenólicos em amostras de interesse ambiental. Palavras-chave: Biossensores, compostos fenólicos, nanopartículas. Área do Conhecimento: Ciências Exatas e da Terra Química - CNPq 1. INTRODUÇÃO Fenol e seus derivados são encontrados em diversos processos industriais, como produção de: plásticos, corantes, tintas, drogas, polímeros sintéticos, resinas, detergentes, desinfetantes, refinaria de petróleo, mas principalmente de papel e celulose, sendo também responsáveis pelas propriedades organolépticas de flores e frutas. Mesmo em baixa concentração, os compostos fenólicos são preocupantes, devido sua alta toxicidade bem como gosto e odor desagradáveis em águas de abastecimento público [1]. Para proteção ambiental e controle destes efluentes industriais, estão sendo cobradas medidas rápidas e eficientes por órgãos governamentais ou pesquisadores ligados à área de poluentes e contaminação ambiental. Neste contexto, estudos envolvendo o uso de biossensores para esta finalidade têm aumentado a cada ano devido às suas características interessantes, tais como análises precisas, exatas, seletivas envolvendo simplicidade e rapidez associadas a baixos custos de obtenção. Um biossensor pode ser definido como um dispositivo analítico que incorpora um elemento biológico, como enzima, tecido animal ou vegetal, microorganismo, antígeno ou anticorpo, ácidos nucleicos, entre outros, com um transdutor analítico que produz um sinal proporcional à concentração da espécie de interesse. O transdutor converte a reação entre o material biológico e o substrato em uma resposta mensurável, como corrente elétrica, no caso se sensores eletroquímicos [2]. Dentre os biossensores, os mais utilizados são os que usam enzima como bioreconhecedor e denominados de enzimáticos, devido à especificidade da medida analítica e versatilidade na obtenção do dispositivo [3]. Podem ser utilizados vários tipos de enzimas, no caso do trabalho foi a tirosinase extraída do inhame, que por sua vez foi designado o melhor vegetal para detecção de compostos fenólicos em efluentes industriais [4]. No entanto, na construção de biossensores, uma das etapas mais críticas se refere à imobilização do bioelemento na superfície, de maneira que haja manutenção da atividade enzimática por um período longo de resposta. O uso de nanopartículas no processo de imobilização é uma metodologia que tem sido destacada, pois há comprovação de que os nanomateriais aumentam a área superficial, permitindo que quantidades maiores de material biológico sejam incorporadas à superfície sensora, consequentemente, incrementando a sensibilidade do aparato, que permite análises de fenóis com menores limites de detecção [5]. Neste contexto, o trabalho teve como objetivo avaliar a influência de diferentes nanopartículas (Fe 2 O 3, ZnO e SiO 2 ) na resposta de biossensores para a determinação de compostos fenólicos em amostras de á- guas residuais, a fim de selecionar aquela que apresentou os melhores resultados analíticos.

2 2. METODOLOGIA 2.1 Materiais e Equipamentos Os equipamentos utilizados para a execução do projeto foram: Balança de precisão Shimadzu AW 220, Centrífuga Excelsa II Modelo 206 MP Fanem, Espectrofotômetro UV/Vis HP Agilent 8453, phmetro Digimed DM 20 e Potenciostato PGSTAT 101, Metrohm. Os reagentes utilizados foram: Solução Guaiacol 2% (Dinâmica), Óleo Mineral Nujol (Mantecorp), Fosfato de sódio bibásico heptahidratado P.A (Synth) e Fosfato de potássio monobásico P.A (Synth), Peróxido de Hidrogênio (Dinâmica), Pó de Grafite (Aldrich).Nanopartículas de Fe 2 O 3,ZnO e SiO 2 (cedidas pela Prof. Elizabeth F. de Souza) 2.2 Obtenção do extrato enzimático Após a lavagem e secagem, 25 g de inhame descascado foram picados e homogeneizados em um liquidificador com 100 ml de tampão fosfato 0,1 mol.l -1 ph 6,5 e ph 7,0 - devido ao fato da enzima ser sensível a variações de ph do meio e estas ocasionando a desprotonação de seus sítios ativos e a conseqüente inutilização da enzima. Em seguida, o extrato foi filtrado em quatro camadas de tecido gaze - e centrifugado a 25000xg 1800 rpm durante 20 min, a 4 o C. A solução sobrenadante foi dividida em diversas alíquotas, armazenadas em freezer a 5 o C e usadas como fonte de tirosinase Preparação do biossensor usando partículas magnéticas de Fe 2 O 3 Antes de se adicionar as nanopartículas à pasta de carbono, deve-se lavá-la com uma solução tampão adequada. A lavagem foi feita com a adição de 100 µl de tampão a 50 µl da nanopartícula em um frasco Eppendorf. Agitou-se a mesma por um minuto e, com o auxílio de um ímã, separou-se as partículas da água de lavagem, umas vez que as mesmas são magnéticas e, portanto, atraídas pelo imã [6]. Repetiuse a lavagem por três vezes. Após a lavagem, adicionou-se 200 µl de enzima às partículas. Agitou-se por um minuto e o Eppendorf foi colocado na geladeira por 30 minutos e a cada cinco minutos, agitou-se para garantir que a enzima interagisse com as nanopartículas. Após completar-se o tempo, separaram-se as partículas do líquido enzimático e adicionaram-se as mesmas ao pó de grafite. A pasta de carbono foi obtida a partir da homogeneização de 0,1875 g de pó de grafite com a partícula modificada com a enzima, em um almofariz com pistilo durante 20 minutos. Em seguida, foram adicionados três gotas de óleo aglutinante Nujol e homogeneizados por mais 20 minutos. A pasta resultante foi inserida em um tubo de vidro e após isto, a ponta com a pasta foi alisada em uma folha de sulfite e foi colocado na extremidade superior do tubo de vidro um fio de cobre para o contato elétrico. O pó de grafite foi escolhido devido ao seu baixo custo, baixa capacidade de adsorção de oxigênio e baixas impurezas eletroativas Preparação do biossensor usando nanopartículas de ZnO ou de SiO 2 A imobilização foi feita da seguinte maneira: em um Eppendorf, colocou-se 200 µl de nanoparticulas e 200 µl da enzima tirosinase, agitou-se por um minuto. O Eppendorf foi colocado na geladeira por 30 minutos e a cada cinco minutos agitou-se para garantir que a enzima interagisse com as partículas. Após completar-se o tempo, adicionaram-se as mesmas ao pó de grafite. A pasta de carbono foi obtida da mesma maneira descrita na seção Estudo da repetibilidade de medidas dos biossensores O estudo de repetibilidade foi realizado a fim de verificar qual nanopartícula construía biossensores que apresentava respostas eletroquímicas mais estáveis, ou seja, que não decresciam com o tempo nas mesmas condições experimentais. Para se realizar o estudo, construiu-se o biosssensor com a melhor quantidade de nanopartícula e realizou cinco medições na mesma solução, em sequencia, sem a necessidade de troca da pasta. O estudo foi realizado para biossensores contendo, cada um, nanopartícula de Fe 2 O 3, ZnO e SiO 2, respectivamente, em solução com 5 ml do tampão fosfato 0,1 mol.l -1 ph 7,0 e 1,8 mmol.l -1 de guaiacol. 2.6 Estudo da reprodutibilidade de preparação dos biossensores O estudo de reprodutibilidade é necessário para verificar se o procedimento de preparação dos dispositivos está sendo realizado corretamente e não causa variações significativas nas medições quando usados dispositivos preparados em momentos diferentes. Para isso, foram construídos três biossensores para cada nanoparticula avaliada (Fe 2 O 3, ZnO e SiO 2 ) e realizou uma medida eletroquímica para cada sensor em solução tampão fosfato ph 7,0 contendo solução de guaiacol 1,8 mmol.l -1. Com isso, pode-se averiguar qual nanopartícula prepara biossensores com

3 maior repetição de medida, mesmo sendo produzido em períodos distintos. 2.7 Determinação de compostos fenólicos em amostras de interesse ambiental Contaminou-se uma amostra de água residual industrial com solução de guaiacol e mediu se a corrente elétrica desta amostra usando cada um dos biossensores. Então, substituiu o valor desta corrente na equação da reta do respectivo biossensor e encontrou-se o valor da concentração de guaiacol na amostra. Os resultados dos biossensores de cada nanopartícula foram comparados, a fim de se determinar o que produzia análises mais confiáveis. Para este estudo avaliou-se a exatidão no uso dos biossensores com nanopartículas de Fe 2 O 3, ZnO e SiO 2 em amostras de águas residuais contaminadas com compostos fenólicos. Para isso, foi necessário construir uma curva de calibração para cada nanopartícula avaliada. A curva de calibração foi obtida a partir de sucessivas adições de uma solução de guaiacol 1,8 mol.l -1 a 5 ml de tampão fosfato 0,1 mol L -1 ph 7,0. Mediu-se a corrente a cada adição. Com os valores de concentração no eixo x de corrente no eixo y construiu-se a curva de calibração, obtendo-se a equação da reta. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Obtenção da atividade enzimática Foi feito o cálculo da atividade da tirosinase que é uma etapa muito importante do processo, pois a partir dos resultados obtidos, pode-se descobrir se a atividade da enzima se mantém quando a biomolécula é transferida para uma solução aquosa. O resultado da atividade enzimática foi de 4567,5U.mL -1.O resultado obtido está acima do indicado em estudos similares encontrados na literatura para biossensor de extrato vegetal, indicando que o processo usado para extrair as enzimas no inhame e levar a uma solução aquosa foi realizado com eficiência. 3.2 Estudo da resposta de biossensores com e sem partículas de Fe 2 O 3, ZnO e SiO 2 em solução contendo o composto fenólico guaiacol O uso de nanopartículas no processo de imobilização da enzima em biossensores tem como uma das finalidades a amplificação do sinal analítico. Isso porque esse nanomaterial possui a importante propriedade de elevação da área superficial, que acarreta na imobilização de uma maior quantidade de biomoléculas, aumentando as reações bioquímicas e, consequentemente, a resposta do dispositivo. Para testar se a resposta de biossensores em solução contendo composto fenólico está sendo melhorada com o uso de nanopartículas na pasta de carbono, foram realizadas medidas voltamétricas com uma solução contendo apenas tampão fosfato 0,1 mol L -1, ph 7,0 e após a adição de guaiacol 1,8 mmol L -1. A Figura 1 apresenta o resultado obtido para as nanopartículas de ZnO. Figura 1 Comportamento do biossensor, com e sem nanopartículas de ZnO, em relação ao seu substrato. Observando a Figura 1, percebe-se que apenas em solução tampão linha azul não há nenhum pico referente à atividade do biossensor devido à ausência de fenol. Com a adição de guaiacol ocorre o aparecimento dos picos de oxiredução, como visto na linha vermelha. A linha verde, obtida para o biossensor com as nanopartículas de ZnO, apresenta um aumento considerável nos valores de corrente, indicando que maiores quantidades de enzima são imobilizadas na superfície sensora. Este resultado de incremento no sinal analítco do dispositivo foi observado para as outras nanopartículas avaliadas (Fe 2 O 3 e SiO 2 ). No entanto, o biossensor contendo ZnO foi o que apresentou a maior variação na resposta quando comparado com o aparato contendo somente enzima e pasta de carbono. 3.3 Estudo da reprodutibilidade do biossensor e repetibilidade das medidas A repetibilidade do biossensor é um parâmetro importante, pois estuda se a medida eletroquímica de um biossensor decresce com o passar do tempo nas mesmas condições experimentais. Portanto, para o estudo da repetibilidade do biossensor, foram realizadas cinco medições sem a troca da pasta ou da solução, utilizando as nanopartículas de Fe 2 O 3, ZnO e SiO 2, como suporte para tirosinase, em solução tampão 0,1 mol L -1 ph7,0 contendo 1,8mmolL -1 de guaiacol. Com estes resultados foi possível calcular a precisão das medidas obtidas com os diferentes biossensores

4 Tabela 1 Valores de corrente obtidos para os três biossensores estudados e os respectivos coeficientes de variação obtidos. Medidas Fe 2 O 3 I/A ZnO I/A SiO 2 I/A 1 2,63 x10-6 1,43 x ,75 x ,66 x10-6 1,46 x ,90 x ,63 x10-6 1,46 x ,97 x ,66 x10-6 1,46 x ,12 x ,58 x10-6 1,44 x ,18 x 10-6 CV 1,09% 0,97% 1,02% Conforme observado na Tabela 1, os coeficientes de variação encontrados para os três biossensores estudados foram baixos, indicando uma boa repetibilidade de medidas. Valores até 5% são aceitos para biossensores obtidos a partir de extrato vegetal. No entanto, quando os valores de coeficiente de variação são comparados entre os biossensores, verificase que o contendo as nanopartículas de ZnO foi o que apresentou valor menor e, portanto, é o dispositivo com maior precisão entre suas medidas analíticas. O estudo da reprodutibilidade de preparação é necessário para verificar se o procedimento de preparação dos dispositivos está sendo realizado corretamente e não causa variações significativas nas medições quando usados dispositivos preparados em momentos diferentes. Então foram construídos três biossensores (para cada nanopartícula avaliada) nas mesmas condições experimentais. A finalidade é verificar se dispositivos preparados em dias ou períodos distintos fornecem o mesmo sinal analítico, sem que haja variações consideráveis. As medidas eletroquímicas foram realizadas em solução tampão fosfato ph 7,0 contendo solução de guaiacol 1,8 mmol.l -1 Com a finalidade de calcular a reprodutibilidade desses biossensores, os valores de corrente bem como o cálculo do desvio padrão relativo (DPR) estão apresentados na Tabela 2. Analisando os dados da Tabela 2, verifica-se que os valores de reprodutibilidade de preparação para os três biossensores (Fe 2 O 3 ; ZnO e SiO 2 ) são bons, visto que não se está utilizando enzimas comerciais liofilizadas. No entanto, quando comparados entre si, verifica-se que o dispositivo contendo as nanopartículas de ZnO é que apresentou maior reprodutibilidade de preparação. Tabela 2 Valores de corrente obtidos para o estudo da reprodutibilidade de preparação dos biossensores. Biossensor Fe 2 O 3 I/A ZnO I/A SiO 2 I/A 1 1,85 x10-6 1,43 x10-5 6,42 x ,76 x10-6 1,44 x10-5 6,40 x ,73 x10-6 1,36 x10-5 5,44 x10-6 média 1, ,41x ,08x10-6 desvio padrão 6, ,4x10-7 5,60x10-7 DPR 3,51% 3,09% 9,21% 3.4 Determinação de compostos fenólicos em amostra de interesse ambiental Na etapa final do trabalho, após a otimização dos parâmetros analíticos, o biossensor está pronto para ser aplicado em amostras contaminadas com compostos fenólicos. A análise foi iniciada pela construção da curva de calibração Construção da curva de calibração A construção da curva de calibração para cada biossensor (Fe 2 O 3 ; ZnO e SiO2) foi feita através de sucessivas adições da solução de guaiacol em 5 ml de solução tampão fosfato 0,1 mol L -1 ph 7,0 e para cada adição, uma medida eletroquímica. A Figura 2 apresenta o resultado obtido para o biossensor contendo as nanopartículas de ZnO. Com base na Figura 2, verifica-se que a região linear de guaiacol para o biossensor com nanopartículas de ZnO foi de 1,08 a 7,20 mmol L -1, com equação da reta de y=0, x + 3, (R 2 =0,993525, n=18). Para o biossensor de Fe 2 O 3 a região linear foi de 3,24 a 8,28 mmol L -1 com equação da reta de y=0,027133x (R 2 =0,993801, n=15). Para SiO 2 a região linear foi de 1,44 a 7,20 mmol L -1, levemente inferior aquela encontrada para o biossensor de ZnO, com equação da reta de y=0,019622x + 5, (R 2 =0,990445, n=17).

5 I / A 2,00E-04 1,80E-04 1,60E-04 1,40E-04 1,20E-04 1,00E-04 8,00E-05 6,00E-05 4,00E-05 2,00E-05 0,00E+00 y = 0,019591x + 0, R² = 0, ,00E+00 1,00E-03 2,00E-03 3,00E-03 4,00E-03 5,00E-03 6,00E-03 7,00E-03 8,00E-03 concentração guaiacol / mol L-1 Figura 2 Curva de calibração obtida para o biosensor contendo nanopartículas de ZnO em solução tampão fosfato 0,1 mol L -1, ph 7,0, com sucessivas adições de guaiacol Determinação de compostos fenólicos em amostras de interesse ambiental. Após obtenção das curvas de calibração para os biossensores avaliados, foi possível a análise do composto fenólico em matriz ambiental. A amostra consistiu de água residual industrial que foi contaminada com solução de guaiacol e mediu se a corrente desta amostra usando cada um dos biossensores. A Figura 3 exibe o voltamograma resultante dessa análise para o ZnO. A corrente máxima obtida na Figura 3 foi de 9, A e a concentração de guaiacol correspondente, u- sando a respectiva equação da reta é de 3, mol L -1. Sabendo-se que a concentração do composto fenólico adicionada à amostra foi de 3, mol L -1, o erro relativo foi de 0,62%. Para o Fe 2 O 3, a corrente máxima obtida foi de 2, A e a concentração de guaiacol correspondente, usando a respectiva equação da reta é de 5, mol L -1. Sabendo-se que a concentração do composto fenólico adicionada à amostra foi de 5, mol L - 1, o erro relativo é de 1,85%. foi de 1, A. Para o biossensor de SiO 2 a concentração de guaiacol correspondente, usando a respectiva equação da reta é de 3, mol L -1. Sabendo-se que a concentração do composto fenólico adicionada à amostra foi de 3, mol L -1, o erro relativo é de 0,92%. Analisando os erros relativos obtidos com os três biossensores, verifica-se que estão excelentes, com valores bem baixos, indicando a boa exatidão dos dispositivos. No entanto, quando os erros são comparados entre os biossensores, constata-se que o contendo nanopartículas de ZnO foi o que apresentou os melhores resultados. Portanto, avaliando os parâmetros estudados no trabalho, este nanomaterial é o mais adequado para a construção de dispositivos sensores, pois fornece sistemas que apresentam boa precisão e exatidão e, além de tudo, confiabilidade nos resultados. 4. CONCLUSÃO No trabalho foram construídos três biossensores que tinham como elemento de reconhecimento a enzima tirosinase, extraída de inhame, imobilizadas sobre distintas nanopartículas: de Fe 2 O 3, ZnO e de SiO 2. Todas as nanopartículas avaliadas produziram dispositivos que apresentaram aumento de sinal analítico quando o nanomaterial estava presente. Além disso, os dispositivos possuíram alta repetibilidade de medidas e reprodutibilidade de construção, indicando sua boa precisão. Quando usados para análise do composto fenólico selecionado, no caso o guaiacol, os erros relativos obtidos foram bem pequenos, atestando sua exatidão. Porém, de todas as nanopartículas avaliadas, as de ZnO foram as que apresentaram os melhores valores em todos os estudos avaliados. Por isso, esse seria um promissor suporte para o preparo de biossensores para uso em detecção de contaminantes em matrizes de interesse ambiental. Figura 3 Voltamograma obtido na determinação de guaiacol em amostras de águas residuais industriais usando o biossensor baseado em nanopartículas de ZnO. AGRADECIMENTO à PUC-Campinas pela oportunidade de realização da Iniciação Científica e bolsa concedida.

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