DESENVOLVIMENTO DE BIOSSENSORES POTENCIOMÉTRICOS PARA CONTROLE DA ESTABILIDADE DO BIODIESEL
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1 DESENVOLVIMENTO DE BIOSSENSORES POTENCIOMÉTRICOS PARA CONTROLE DA ESTABILIDADE DO BIODIESEL João Pedro P. Guilherme Faculdade de Química CEATEC Renata K. Mendes Valente Metrologia Química, Quimiometria e Química Analítica CEATEC renatavalente@puc-campinas.edu.br Resumo: O uso de uma fonte energética renovável, proveniente da biomassa e que se tornou uma excelente opção aos combustíveis derivados do petróleo, que tem recebido bastante atenção atualmente se refere ao biodiesel. Este biocombustível apresenta algumas características importantes ao motor do veículo, mas, principalmente, possui a vantagem de diminuir a geração de gases responsáveis pelo efeito estufa. No entanto, para garantir o controle da qualidade deste biocombustível, a Agência Nacional do Petróleo e Biocombustiveis (ANP), estabelece limites considerados adequados para manter suas características químicas e físico-químicas. Um dos problemas relacionados ao biodiesel está relacionado a sua estocagem, pois pode haver degradação do composto, gerando produtos ou subprodutos que são indesejáveis, como a formação de peróxido de hidrogênio, que pode trazer danos a algumas peças do sistema automotivo. Atualmente, a técnica cromatográfica é a mais utilizada para a determinação dos níveis dos produtos e/ou contaminantes no biodiesel. Porém, é conhecido que métodos cromatográficos são bastante dispendiosos, de custo elevado para a compra e manutenção, além da necessidade de treinamento intenso de pessoal para realização das medidas. O uso de biossensores (sensores químicos que possuem como elemento de reconhecimento um material biológico) é uma alternativa interessante para o controle da qualidade dos biocombustíveis, devido a sua relativa simplicidade de utilização, possuir alta seletividade e grande sensibilidade nos resultados. Neste contexto, este trabalho tem como objetivo a quantificação de peróxido de hidrogênio no biocombustível, usando um biossensor eletroquímico modificado com a enzima peroxidase extraída de extratos vegetais. Palavras-chave: biossensor eletroquímico, biodiesel, peroxidase Área do Conhecimento: Ciências Exatas e da Terra Química CNPq. 1. INTRODUÇÃO O biodiesel produzido por meio de biomassa não polui o meio ambiente e também traz vantagens econômicas, pois sua produção e o cultivo de matériasprimas contribuirão para a criação de milhares de novos empregos na agricultura familiar. Nota-se que uma atenção recente tem sido focada para os efeitos da oxidação causados pelo contato do biocombustível com o ar ambiente (autoxidação), reduzindo sua qualidade durante o armazenamento. Assim sendo, manter a qualidade do biodiesel e suas misturas com combustíveis destilados do petróleo durante o longo período de estocagem é um consenso entre produtores, fornecedores e usuários do combustível [1]. A estabilidade à oxidação é, portanto, um parâmetro de grande importância para o controle da qualidade do biodiesel. O processo de degradação oxidativa do biodiesel formando peróxido de hidrogênio depende da natureza dos ácidos graxos utilizados na sua produção associado, principalmente, ao grau de insaturação dos ésteres que o compõe, além da umidade, temperatura e absorção de luz [2]. A técnica mais utilizada para análise de contaminantes em amostras de biocombustível tem sido a cromatografia. No entanto, é conhecido que a técnica requer profissional capacitado, demanda tempo para análise e tem custo elevado tanto para a medida quanto de manutenção do equipamento. Uma alternativa a técnicas de alto custo e que sejam destrutivas se refere ao uso de biossensores. Os biossensores são sensores modificados com material biológico intimamente ligado à superfície de um transdutor. Quando este material é uma enzima, estes sensores são denominados biossensores enzimáticos, que, entre outros, podem fazer uso da atividade enzimática como sinal analítico a ser monitorado [3]. A grande aplicabilidade está relacionada às vantagens referentes aos biossensores, podendo-se destacar: sensibilidade, respostas rápidas e baixo custo, alta especificidade, detecção de baixas concentrações do analito, número variável de enzimas disponíveis comercialmente, além de uma variedade de metodologias empregadas na construção destes
2 sensores biológicos [4]. A tecnologia atualmente empregada na construção de transdutores eletroquímicos, aliada aos diversos métodos analíticos descritos na literatura, vem colaborando com o fortalecimento desta área específica de biossensores [5]. Neste contexto, o objetivo geral deste trabalho é desenvolver biossensores eletroquímicos baseados na interação enzima-substrato para a detecção de peróxido de hidrogênio em amostras degradadas de biodiesel. 2. METODOLOGIA 2.1. Materiais Os equipamentos utilizados para a execução deste projeto foram: Balança de precisão Shimadzu AW 220, Centrífuga Excelsa II Modelo 206 MP Fanem, Espectrofotômetro UV/Vis HP Agilent 8453, phmetro Digimed DM 20 e Potenciostato PGSTAT 30 da AUTOLAB (Metrohm, Eco Chemie). Os reagentes utilizados foram: Solução Guaiacol 2% (Dinâmica), Peróxido de Hidrogênio P.A (Vetec), Ó- leo Mineral (Mantecorp), Fosfato de sódio bibásico heptahidratado P.A (Synth) e Fosfato de potássio monobásico P.A (Synth), pó de Grafite (Aldrich), Ácido Acético P.A (Nuclear), Clorofórmio P.A (J.T.Baker), Acetato de Sódio Anidro P.A (Dinâmica), Iodeto de Potássio P.A (Nuclear), Iodato de Potássio P.A (Nuclear), Amido Solúvel P.A (Dinâmica), Ácido Sulfúrico P.A (Chemco) e Tiossulfato de Sódio P.A (Nuclear) Obtenção do extrato enzimático As abobrinhas utilizadas foram adquiridas em uma chácara da região de Campinas. Após a lavagem e secagem, 25 g de abobrinhas descascadas foram picadas e homogeneizadas em um liquidificador com 100 ml de tampão fosfato 0,1 mol.l -1 ph 7,0. Em seguida, o extrato foi filtrado em quatro camadas de tecido gaze - e centrifugado a 1800 rpm durante 20 min. A solução sobrenadante foi dividida em diversas alíquotas, armazenadas em freezer a -5 C e usadas como fonte de peroxidase Construção do biossensor de pasta de carbono usando adsorção física. A pasta de carbono foi obtida a partir da homogeneização de 0,375 g de pó de grafite com a quantidade desejada da enzima em µl, em um almofariz com pistilo durante 20 minutos. Em seguida, foram adicionados de 0,1848 g de óleo mineral aglutinante e homogeneizados por mais 20 minutos. A pasta resultante foi inserida em uma seringa com o fundo cortado e após isto, a ponta com a pasta foi polida em uma folha de sulfite e foi colocado na seringa um fio de cobre para o contato elétrico. O pó de grafite foi escolhido devido ao seu baixo custo, baixa capacidade de adsorção de oxigênio e baixas impurezas eletroativas. Para avaliar o desempenho do biossensor em meio contendo o substrato da enzima peroxidase, ou seja, o peróxido de hidrogênio foram realizadas medidas voltamétricas do biossensor (i) apenas em solução tampão fosfato 0,1 mol L -1 e (ii) após adição do peróxido. O aumento da corrente de redução do peróxido de hidrogênio pelo biossensor foi monitorado Estudo da influência da quantidade de peroxidase na resposta do biossensor. Para este estudo foram construídos quatro biossensores diferentes, cada um contendo uma quantidade distinta de peroxidase: 230, 460, 1160 e 1855 U ml -1. Este estudo foi realizado em um potenciostato, para medidas voltamétricas (variação de corrente) em função da quantidade enzimática. Embora o projeto envolva o desenvolvimento de um biossensor que possui como sistema de transdução a potenciometria (medidas de potencial), é conhecido que as análises voltamétricas (medidas de corrente) são mais sensíveis. Assim, para se determinar as condições ótimas do sistema, optou-se por se utilizar uma técnica que seja capaz de distinguir mesmo variações mínimas de resposta. Essa alteração não afeta a resposta final do biossensor, uma vez que a voltametria também se caracteriza como uma medida eletroquímica Estudo da repetibilidade do biossensor O estudo de repetibilidade do sensor foi realizado para se verificar se a mesma medida voltamétrica não decrescia ou aumentava com o tempo. Para isso, construiu-se um biossensor com a quantidade de enzima que se obteve a melhor resposta -1160UmL -1 e mediu-se 5 vezes a resposta voltamétrica em solução tampão fosfato ph 7,0 contendo solução de peróxido de hidrogênio 45 mmol L -1 e guaiacol 3,6 mmol L Estudo da reprodutibilidade do biossensor. A reprodutibilidade do sensor foi avaliada para se verificar se diferentes biossensores em condições similares forneciam os mesmos resultados. Para tanto, 4 biossensores foram construídos e cada um deles foi posto em contato em uma solução tampão fosfato ph 7,0 contendo 45 mmol L -1 de peróxido de hidrogênio e guaiacol 3,6 mmol L -1.
3 2.6. Extrações das amostras de biodiesel planejamento experimental Para a avaliação de peróxido de hidrogênio no biodiesel, o mesmo foi extraído da matriz, pois se o eletrodo for utilizado no óleo, a pasta de carbono irá se dispersar no mesmo. Assim, foi necessário otimizar alguns parâmetros de ensaio, a fim de selecionar aquele em que o H 2 O 2 era mais eficientemente extraído. Para tal foi feito um planejamento experimental, tendo como fatores concentração de ácido acético em mol.l -1 (1) e número de extrações (2). Foram feitos 4 ensaios, como exibido na Tabela 1. Foram pesados 2,5 g da amostra de biodiesel e preparada a solução extratora usando-se 9 ml de ácido acético da concentração desejada e 6 ml de clorofórmio. O biodiesel foi contaminado com 750µL da solução de peróxido de hidrogênio, homogeneizado e posto em um funil de separação e adicionou-se a solução extratora. Agitou-se o sistema e separou-se a fase orgânica da aquosa. Repetiu-se a extração pelo número de vezes desejado. A fase aquosa foi colocada num erlenmeyer de 250 ml e adicionou-se ao mesmo 0,5 ml da solução saturada de KI e 0,5 ml da solução de H 2 SO 4 e titulou-se até ficar amarelo pálido. Adicionou-se então 0,5 ml da solução de amido e prosseguiu-se com a titulação até o desaparecimento da coloração azul. Cada ensaio foi realizado em duplicata, para se encontrar uma média dos volumes gastos na titulação. A quantidade de peróxido recuperada pode ser determinada pelo volume de tiossulfato de sódio gasto na titulação. Tabela 1. Planejamento experimental das extrações de H 2O 2 do biodiesel. [HAc] indica a concentração de ácido acético. Ensaio [HAc] mol L -1 Número de Extrações 1 0, , , , Determinação de peróxido de hidrogênio em amostras de biodiesel via biossensor Uma etapa anterior a aplicação do biossensor em amostras de biodiesel envolveu a construção de uma curva de calibração para o biossensor. Assim, concentrações crescentes de H 2 O 2 foram adicionados a uma solução tampão formada por ácido acético/acetato de sódio ph 6,5 e a resposta da corrente, a cada adição, foi monitorada. Foi construída uma curva de calibração, contendo no eixo y corrente em µa microampéres - e no eixo x, concentração de peróxido de hidrogênio em mmol.l -1. Após a obtenção da curva analítica, o biossensor foi adicionado a fase aquosa obtida no processo de extração do H 2 O 2 do biodiesel. Antes, no entanto, precisou ajustar o ph que estava em torno de 3,0 para 6,5 com adições de acetato de sódio. A análise foi feita em triplicata. Com os resultados, foi retirada a média das correntes obtidas e substituído no valor de y na equação da reta obtida via curva de calibração. Foi possível, então, determinar-se a quantidade de H 2 O 2 presente na amostra. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Estudo da resposta do biossensor em relação ao seu substrato. Para testar a resposta do biossensor em relação ao substrato da enzima peroxidase, foram realizadas medidas voltamétricas com o dispositivo apenas em tampão fosfato 0,1 mol.l -1, ph 7,0 e, após a medição do sinal, houve a adição de uma solução de peróxido de hidrogênio e uma nova resposta foi obtida. A Figura 1 exibe os resultados. I / µa presença do substrato solução tampão fosfato ph 7, E / mv Figura 1. Comportamento do biossensor em solução contendo peróxido de hidrogênio Estudo da influência da concentração de peroxidase na resposta do biossensor. Outro parâmetro analítico importante é a concentração da enzima presente na pasta de carbono, pois se ela apresenta-se excessivamente baixa, o transdutor não sentirá a perturbação do meio, já que a reação enzimática não ocorrerá em escala suficiente para detecção. Para se estudar a influência da concentração da enzima na resposta do dispositivo, foram construídos quatro biossensores com quantidades
4 diferentes de peroxidase na pasta 230 U.mL -1, 460 U.mL -1, 1160 U.mL -1 e 1855 U.mL -1 e foi medido o sinal voltamétrico resultante. A Figura 2 exibe os resultados das medições. I / µa U ml U ml U ml U ml -1 desvio padrão relativo foi de 0,028%, mostrando que quando o tempo de homogeneização é respeitado e as quantidades de cada composto também, a resposta dos biossensores é quase constante nas mesmas condições experimentais Curva Analítica Após otimização das condições experimentais, como ph ótimo, quantidade de enzima, proporção ó- leo/grafite, foi construída uma curva de calibração em solução contendo HAc/NaAc, com medidas de correntes em concentrações crescentes de H 2 O 2. A Figura 3 apresenta os resultados obtidos E / mv Figura 2. Voltamogramas obtidos no estudo da influência da concentração da enzima na resposta do biossensor em solução tampão fosfato ph 7,0 contendo solução de peróxido de hidrogênio e guaiacol 3,6 mmol L Estudo da repetibilidade e reprodutibilidade do biossensor A repetibilidade de medida é uma característica importante para um instrumento de medição, tendo em vista que representa a capacidade que este possui de dar a mínima variação no valor de corrente, para mais de uma medida, nas mesmas condições experimentais. A repetibilidade de medida do biossensor foi testada através da reprodução do experimento por cinco vezes nas mesmas condições. Observam-se os resultados na Tabela 2 com os valores de corrente (µa) de cada medida. Tabela 2. Valores das correntes da análise repetida cinco vezes pelo mesmo analista. Medida I / µa 1 20,0 2 19,8 3 19,3 4 19,2 5 19,5 Como o desvio padrão das medidas foi pequeno (1,7%), conclui-se que o biossensor produz medidas bastante precisas. Para o estudo de reprodutibilidade, foram preparados 4 biossensores nas mesmas concentrações de enzima/grafite/óleo mineral. A finalidade é verificar se os biossensores apresentavam a mesma resposta quando preparados em dias diferentes. Neste caso, o Figura 3. Curva de calibração do biossensor obtida em diferentes concentrações de peróxido de hidrogênio com guaiacol constante a 3,6 mmol L -1. Por meio da curva acima foi possível obter a equação da reta: y (A) = 1, , x Determinação de peróxido de hidrogênio em amostra de biodiesel Não foi possível determinar diretamente a quantidade de H 2 O 2 no biodiesel, pois poderia ocorrer a lixiviação da pasta de carbono no óleo combustível. Então, foi proposto um método de extração do peróxido da fase oleosa para transferi-lo para uma fase aquosa. A melhor condição, após estudo, envolveu a extração com ácido acético 0,01 mol L -1 e clorofórmio (3:1). Após extração, foi ajustado o ph para 6,5 usando acetato de sódio, pois a solução inicial tinha ph muito ácido (3,0). Então, foi adicionado guaiacol 3,6 mmol L -1 e mediu-se a corrente relativa ao peróxido. A medida foi realizada em triplicata e, a média dos valores foi substituída na equação da reta, obtendo-se o valor de x (concentração de H 2 O 2 ). Como não havia peróxido neste biodiesel, o mesmo foi contaminado com 21,8 mmol L -1 de H 2 O 2. O valor encontrado pelo biossensor foi de 23,3 mmol L CONCLUSÕES Com o uso do biossensor a base de enzimas obtidas com extrato de vegetais, foi possível determinar de maneira exata a quantidade de peróxido de hidrogê-
5 nio em amostras de biodiesel. Esta análise é de extrema importância para avaliação da estabilidade do biocombustível durante a estocagem. O dispositivo apresentou boa precisão e reprodutibilidade, além de ser bastante simples de se utilizar e de baixo custo. AGRADECIMENTOS Ao Prof. Lauro Kubota (IQ-UNICAMP) e à PUC- Campinas pela bolsa concedida. REFERÊNCIAS [1] Ferrari,R.A; Souza, W.L. (2009) Quim. Nova, Vol. 32, No. 1, p [2] Borsato,D.; Dall Antonia,L.H; Guedes,C.L.B; Maia,E.C.R;De Freitas,H.R; Moreira,I.; Spacino, K.R. (2010) Quim. Nova, Vol. 33, No. 8, p [3] Marques, P.R.B.O.; Yamanaka, H. (2008) Quim.Nova, Vol. 31, p [4] Lopes, F.M.; Batista, K.A.; Batista, G.L.A.; Fernades, K.F. (2012) Ciênc. Tecnol. Aliment., Vol. 32, No. 1, p [5] Vidotti, M.; Carvalhal, R.F.; Mendes, R.K.; Ferreira, D.C.M.; Kubota, L.T. (2011) J. Braz. Chem. Soc. Vol, 22, p
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