Renata Kelly Mendes Valente Metrologia Química, Quimiometria e Química Analítica - CEATEC

Transcrição

1 DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS UTILIZANDO UM BIOSSENSOR VOLTAMÉTRICO A BASE DE LACCASE E NANO- COMPÓSITO HÍBRIDO USANDO PLANEJAMENTO DE EXPERIMENTOS Beatriz Silva Arruda Faculdade de Química CEATEC arruda.beatriz@gmail.com Renata Kelly Mendes Valente Metrologia Química, Quimiometria e Química Analítica - CEATEC renatavalente@puc-campinas.edu.br Resumo: Um dos contaminantes mais importantes se refere a alguns compostos fenólicos, que podem ser extremamente tóxicos para animais e plantas. A busca por procedimentos analíticos para monitoramento destes compostos em amostras de interesse ambiental tem estimulado a produção de uma grande variedade de trabalhos na área. Desta maneira, os biossensores são considerados poderosas ferramentas analíticas para este fim, pois fazem uso do bioreconhecimento, que resulta em respostas rápidas e sensíveis, combinando a seletividade das reações bioquímicas com a simplicidade operacional. O uso da nanotecnologia associada à construção de biossensores tem se destacado devido às suas propriedades químicas e físicas. Além disso, o uso de biopolímero, como a quitosana, na construção de sensores é uma alternativa para tornar o meio biocompatível permitindo a manutenção da atividade biológica da biomolécula. Assim, este trabalho tem como premissa básica a detecção de compostos fenólicos, incluindo a possibilidade futura de miniaturização do sistema, utilizando-se nanocompósitos híbridos formados pela associação de nanopartículas e quitosana para imobilização da biomolécula. Palavras-chave: Biossensor, compostos fenólicos, nanocompósitos híbridos, quitosana. Área do Conhecimento: Ciências Exatas e da Terra Química CNPq. 1. INTRODUÇÃO Compostos fenólicos contaminam e poluem o meio ambiente durante a produção, transporte e/ou utilização em diversos tipos de indústrias, causando danos à fauna e à flora. [1]. Seus efeitos tóxicos nos seres humanos incluem permeabilidade celular e coagulação citoplasmática, irritação da pele, distúrbios gastrointestinais, mau funcionamento dos rins, falha no sistema circulatório e até edemas pulmonares. Além de possuir uma propriedade de proporcionar bioacumulação nas cadeias alimentares [2]. Com isso, a pesquisa e o desenvolvimento de métodos seletivos e sensíveis para a detecção destes poluentes tem uma demanda continuamente crescente [1]. Apesar de já existir métodos conhecidos para sua determinação, como a cromatografia e espectrometria de massas, por exemplo, essas requerem pessoas capacitadas para manipulação, além de possuírem alto custo e grande consumo de reagentes [3]. Uma alternativa mais simples se refere ao uso de biossensores. A tecnologia do biossensor é considerada uma ferramenta de grande importância devida à minimização na geração de resíduos, capacidade de monitoramento imediata, alta seletividade e sensibilidade. Nesta perspectiva, o uso de biossensores na detecção de compostos fenólicos em meio ambiente utilizando enzimas como elemento de reconhecimento aumentou nos últimos anos. A seleção de enzimas e suas fontes têm uma grande influência sobre a confiabilidade final do dispositivo [4]. Para fenóis uma enzima bastante apropriada é a laccase, pois é mais estável e tem a vantagem de não usar peróxido de hidrogênio e nem cofatores para exercer sua função [1]. Dentre os componentes que compõem os biossensores o transdutor é o maior responsável pelo custo final do aparato. Os transdutores eletroquímicos são os mais utilizados, pois possibilitam a construção de sensores com maior versatilidade em relação ao tamanho e formato, além de ser de baixo custo [3]. Porém, para que a seletividade dos biossensores eletroquímicos seja mantida, a enzima tem que ser imobilizada eficientemente no eletrodo. Esta etapa pode ser realizada usando ligação covalente e, neste caso, a nanopartícula deve ser funcionalizada e o biopolímero quitosana é uma maneira eficiente para esta realização, pois além de fornecer os grupos terminais amino (-NH 2 ) ainda é um meio biocompatível, que contribui para a manutenção da atividade

2 enzimática. A associação de nanomateriais a polímeros produz os chamados nanocompóitos e, como o polímero tem origem biológica, o nanocompósito é denominado de híbrido. Assim, a formação de um nanocompósito híbrido entre um nanomaterial inorgânico a base de óxidos metálicos incorporado a biopolímeros naturais para o uso de imobilização do reconhecedor na superfície sensora, permite que dispositivos mais estáveis e com melhor seletividade possam ser construídos. Em suma, o objetivo proposto é desenvolver um biossensor de laccase/quitosana/nanopartículas de ZnO para a aplicação na determinação de fenol em amostras de águas residuais. 2. MATERIAIS E MÉTODOS Os equipamentos utilizados para executar este trabalho foram: balança de precisão Shimadzu AW 220, phmetro Digimed DM 20 e micropotenciostato AUTOLAB PGSTAT 101. Os reagentes utilizados foram: Clorofenol (aldrich), Óleo Mineral Nujol (Mantecorpo), Fosfato de sódio bibásico e heptahidratado P.A (Synth) e Fosfato de potássio monobásico P.A (Synth), Pó de grafite (Aldrich), Hidroquinona (Synth). 2.1 Construção de um biossensor Para construção do biossensor, as nanopartículas de ZnO foram lavadas com solução tampão fosfato 0,1 mol L -1, ph 7,0. Após, acrescentou-se 200 µl da solução de quitosana e colocou-se na geladeira por mais 15 minutos com agitação a cada 5 minutos, para formação do nanocompósito, A seguir, adicionouse 10 µl da solução enzimática 1 mg ml -1. Agitou-se por um minuto e o Eppendorf foi colocado na geladeira por 30 minutos. Após completar o tempo, acrescentou-se a solução do Eppendorf ao pó de grafite à mistura. Por fim, a solução foi adicionada ao pó de grafite para finalização da pasta e, assim, serem embutidas no tubo de vidro fazendo contato elétrico com o fio de Ni/Cu. 2.2 Estudo da concentração da enzima e do tempo de interação entre a enzima e o nanocompósito Para este estudo, utilizou-se Planejamento de Experimentos 2 2 com ponto central para otimização das condições. Os níveis máximos de concentração e tempo avaliados foram: 60 minutos e 5 mg.ml -1 de laccase na pasta. Os níveis mínimos foram: 5 minutos e 1 mg.ml -1 de enzima. Estes níveis foram avaliados em duplicata. Além disso, o ponto central, que foi realizado em triplicata, foi: 30 minutos e 2,5 mg.ml -1 de enzima. Logo, construíram-se os diferentes biossensores para determinar a melhor condição do sistema, monitorando a corrente obtida em cada caso Estudo do efeito da concentração e do tempo de recobrimento da nanopartícula pela quitosana Foram produzidos nanocompósitos contendo diferentes concentrações de quitosana: 1, 2, 3 e 4 mg ml -1. O tempo e a concentração da enzima a ser adicionada na pasta de foram estabelecidos no estudo anterior. O valor de corrente de cada ensaio foi obtido em solução tampão fosfato, após adição de 100 µl do composto fenólico 20 mmol.l -1 com o auxílio de um potenciostato. Com a concentração da quitosana estabelecida, variou-se o tempo de recobrimento da mesma sobre as nanopartículas de ZnO. Os tempos avaliados foram: 5, 15, 25, 45 minutos. A corrente de cada biossensor foi obtida em solução tampão, após adição de 100 µl de fenol 20 mmol.l -1 com o auxílio de um potenciostato. 2.4 Análise do clorofenol em amostra de interesse ambiental Neste último estudo, uma amostra de água residual industrial foi contaminada com 1, mol.l -1 de clorofenol e o biossensor foi inserido nessa solução para realização de medida, juntamente com um eletrodo de referência de Ag/AgCl e um contra eletrodo de platina, usando a técnica de voltametria de pulso diferencial para obtenção das medidas, que foram realizadas em triplicata. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Avaliação da resposta do biossensor com nanocompósito Para verificar se a construção do biossensor a base de nanocompósito híbrido era eficiente, foram avaliados três biossensores distintos: (i) um contendo apenas a enzima laccase; (ii) outro contendo a laccase imobilizada diretamente sobre as nanopartículas de ZnO (ii) e um terceiro contendo a enzima imobilizada sobre a superfície de nanocompósito, formado pelo recobrimento das nanopartículas pela quitosana. A corrente obtida em cada biossensor foi monitorada na solução contendo o composto fenólico e a Figura 1 representa os resultados. Observando a Figura 1 é possível verificar que o biossensor contendo apenas pó de grafite e a enzima é o que apresenta menores valores de corrente. Um aumento significativo é observado quando se adiciona nanopartículas de ZnO ao sistema. Isso porque é conhecido que as nanopartículas possuem alta rela-

3 ção área/volume, permitindo que maior quantidade de biomolécula seja imobilizada. E também podem contribuir para o aumento da taxa de transferência de elétrons, que é importante em se tratando de biossensores eletroquímicos. Porém, quando o biossensor é produzido por nanocompósito observa-se um aumento de corrente, indicando uma elevação da sensibilidade do sistema. 3.3 Estudo da concentração e do tempo da quitosana Para se estudar a influência da concentração da quitosana na resposta do biossensor, foram construídos quatro dispositivos com diferentes concentrações do biopolímero. A Tabela 2 indica o desempenho dos biossensores e as correntes obtidas. Tabela 2. Valores obtidos no estudo de concentração e tempo da quitosana Figura 1. Voltamograma referente à avaliação da resposta dos três biossensores 3.2 Estudo da concentração da enzima e do tempo de reação entre a enzima e o nanocompósito Para analisar estes dois efeitos, simultaneamente, utilizou-se Planejamento de Experimentos 2 2 com ponto central O estudo foi realizado em solução tampão fosfato contendo 100 µl do composto fenólico 20 mmol.l -1, com o auxílio de um potenciostato para medidas das correntes obtidas em cada ensaio. A Tabela 1 mostra os resultados obtidos. Tabela 1. Valores do tempo e concentração. De acordo com a Tabela 1, o resultado que teve melhor desempenho com relação ao tempo foi o ensaio 1, com 5 minutos de interação e concentração mínima de 1 mg.ml -1. Aumentando-se a concentração da laccase e do tempo de reação é possível verificar uma diminuição do sinal eletroquímico. Nestes casos pode ocorrer um aumento da espessura da camada de laccase no eletrodo, dificultando o transporte de substrato até a superfície. Observado a Tabela 2 é possível verificar um aumento linear da corrente com a concentração de quitosana. Concentrações superiores não foram testadas devido ao fato da solução ficar saturada e difícil de trabalhar. Assim, a concentração de 4 mg ml -1 foi selecionada para os experimentos posteriores 3.4 Estudo da reprodutibilidade e repetibilidade de medidas do biossensor Este estudo tem como finalidade investigar se o método de construção dos biossensores está sendo reprodutível, em outras palavras, se o método de preparação está gerando sensores que apresentam medidas similares si, com a mesma proporção de constituintes e mesmo tempo de homogeneização. Então, construíram-se cinco biossensores distintos e realizou-se uma medida eletroquímica para cada um. Os resultados mostraram que o desvio padrão relativo (DPR) das medidas foi de 1,7%, sendo considerada muito boa. A repetibilidade de resposta é importante, pois investiga se a medida eletroquímica do sensor se mantém constante ou com pouca variação durante um procedimento, o que certamente prejudicaria a confiabilidade do aparato. Para este estudo, foram obtidas doze medidas na presença do composto fenólico, sem a troca da pasta ou da solução. O DPR encontrado foi de 3,1%, para 12 medições, sendo considerado excelente, uma vez que até 5% para biossensores é considerado analiticamente aceitável. 3.5 Determinação de compostos fenólicos em amostras de interesse ambiental via biossensor Após otimização das condições experimentais, o biossensor já se encontra apto para teste em amostras reais. A análise de amostras se deu inicialmente pela construção da curva de calibração.

4 3.5.1 Construção da curva de calibração A construção da curva de calibração para o sensor se deu através de sucessivas adições da solução de clorofenol em solução tampão fosfato 0,1 mol L -1 ph 7,0 e para cada adição, uma medida eletroquímica. A técnica foi alterada para voltametria de pulso diferencial, que é conhecidamente mais sensível, para garantir a detecção de menores concentrações. A Figura 2 mostra a curva confeccionada. Figura 2. Curva de calibração para as análises de a- mostras Com base na Figura 2, verifica-se que a curva é linear entre as concentrações mol.l -1 a 1, mol.l -1 de clorofenol. O R 2 obtido foi de 0,9949, indicando uma boa linearidade da corrente com o aumento da concentração de fenol no meio e a equação da reta está apresentada na própria Figura Determinação de compostos fenólicos na a- mostra. Construiu-se um biossensor para a análise, colocouse o mesmo em contato com uma amostra de água industrial propositalmente contaminada com 1,2x10-5 mol.l -1 de clorofenol e realizou-se uma medida voltamétrica. A Figura 3 exibe o voltamograma resultante dessa análise. Figura 3. Voltamograma de pulso diferencial referente a determinação de clorofenol na amostra Como foi feito em triplicata, obteve-se a média das correntes de pico obtidas no voltamagrama que foi de 4, A. Este valor foi substituído na equação da reta, obtendo-se como resultado 1, mol.l -1 de clorofenol, valor muito próximo ao adicionado. O erro relativo entre os dois valores é de 3,3%. 4. CONCLUSÕES Pelos resultados obtidos foi possível verificar que o dispositivo se mostrou bastante sensível, conseguindo detectar quantidade em torno de µmol L -1, além de ser preciso, pois o erro relativo das medidas foi baixo e com exatidão, pois a concentração de clorofenol, em água residual industrial propositalmente contaminada, foi encontrada com erro de 3,3%, considerado bem baixo para este tipo de análise. Assim, o biossensor se mostrou uma alternativa interessante para a determinação deste importante contaminante (resistente à biodegradação) em amostras de interesse ambiental. 5. AGRADECIMENTOS A PUC Campinas pela oportunidade de realização da Iniciação Científica e a FAPESP pela bolsa concedida (2014/ ). 6. REFERÊNCIAS [1]. Das, P.; Barbosa, L.; Das, M.; Goswami, P. (2014) Highly sensitive and stable based on amperometric biosensor developed on nanocomposite matrix for detecting pyrocatechol in environmental samples. Sens. Actuat. B, vol. 192, p [2]. Karim, N.; Lee, H.J. (2013) Amperometric phenol biosensor based on covalent immobilization of tyrosinase on Au nanoparticle modified screen printed carbon electrodes. Talanta, vol. 116, p [3]. Amiri, M.; Ghaffari, S.; Bezaatpour, A.; Marken, F. (2012) Carbon nanoparticle-chitosan composite electrode with anion, cation and neutral binding sites: Dihydroxybenzene selectivity. Sens. Actuat. B, vol. 162, p [4]. Oliveira, T.M.B.F; Barroso, M.F.; Morais, S.; Araújo, M.; Freire, C.; Lima-Neto, P.; Correia, A.N.; O- liveira, M.B.P.P; Delerue-Matos, C. (2014) Sensitive bi-enzymatic biosensor based on polyphenoloxidases-gold nanoparticles-chitosan hybrid filmgraphene doped carbon paste electrode for carbamates detection. Bioelectrochem., vol. 98, p

5