DESENVOLVIMENTO DE UM BIOSSENSOR VOLTAMÉTRICO PARA DETECÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS

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1 DESENVOLVIMENTO DE UM BIOSSENSOR VOLTAMÉTRICO PARA DETECÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS João Pedro Penna Guilherme Faculdade de Química CEATEC Renata Kelly Mendes Valente Metrologia Química, Quimiometria e Química Analítica - CEATEC renatavalente@puc-campinas.edu.br Resumo: Compostos fenólicos são muito comuns na natureza e em efluentes industriais. Suas singulares características químicas um anel benzênico com um ou mais substituintes hidroxila oferecem muitos usos, principalmente de seus derivados como cloro, bromo, nitrofenóis e polifenóis. Clorofenóis, por e- xemplo, são usados na indústria de papel para branqueamento das folhas e como precursores de inseticidas e agrotóxicos. Uma característica dos bromofenóis e dos compostos fenólicos em geral também é que estes possuem a capacidade de alterar as propriedades organolépticas das águas de efluentes, mesmo estando em pequenas quantidades, da ordem de ppm. Tais compostos são muito comuns em efluentes na indústria petrolífera. No entanto, existem muitos problemas associados, pois estes são muito tóxicos. Penetram muito facilmente na pele e em membranas celulares, causando danos diversos. No presente momento, as metodologias mais utilizadas para detecção dos mesmos consistem em cromatografia e análises espectrofotométricas. Todavia, estas possuem uma série de desvantagens, como a necessidade de analistas com treinamento, alto custo de equipamentos e reagentes analíticos. Os biossensores apresentam-se como uma alternativa promissora para análises, devido ao fato de serem altamente precisos, exatos, baratos de se construir e serem muito fáceis de operar. Neste trabalho, será apresentada uma proposta de melhoramento de sinal analítico para os biossensores, com o acréscimo de partículas magnéticas de óxido de ferro ao processo de imobilização enzimática. Estas partículas, devido à dimensão coloidal das mesmas, permitirão que muitas enzimas se liguem às mesmas, o que irá melhorar a qualidade do sinal analítico. Palavras-chave: Biossensores, compostos fenólicos, tirosinase, partículas magnéticas Área do Conhecimento: Grande Área do Conhecimento Sub-Área do Conhecimento CNPq. 1. INTRODUÇÃO Fenóis são compostos químicos que possuem como estrutura um anel benzênico e um ou mais -radicais hidroxila ligados ao mesmo. Catalogados, existem mais de 5 mil compostos fenólicos, possuindo incontáveis variações de estrutura e de radicais substituintes [1]. Os compostos fenólicos são comumente encontrados na natureza e apresentam uma variada gama de propriedades e utilizações. A qualidade de alimentos, principalmente os derivados de frutas, está intimamente relacionada com a presença de substâncias fenólicas em sua composição [2]. Fenóis e alguns de seus derivados, como cloro, nitrofenóis e compostos aromáticos relacionados, são muito comuns em efluentes industriais, oriundos de atividades como produção de: plásticos, corantes, drogas, detergentes, desinfetantes, refinaria de petróleo. No entanto, estes mesmos fenóis substituídos mencionados acima possuem desvantagens. Alguns desses compostos são mutagênicos, hepatotóxicos e prejudicam algumas reações biocatalisadas, além de penetrarem muito facilmente em membrana celulares e na pele. Todos estes problemas causados por estas substâncias impuseram a necessidade de desenvolvimento de um método analítico mais eficaz para seu monitoramento [2]. Uma das áreas que mais têm crescido nos últimos anos para análise de poluentes ambientais se refere ao uso de biossensores. Os biossensores são um subconjunto dos sensores químicos que usam como elemento de reconhecimento uma molécula biológica enzimas, anticorpos, organelas -. O bioelemento está integrado a um transdutor, que converte a resposta da biomolécula, face ao contato com seu substrato, em um sinal mensurável para posterior análise [3]. Devido às suas singulares propriedades seletividade, rapidez na obtenção de medidas e sensibilidade, os biossensores encontram grande aplicabilidade em muitas áreas como na química, biologia, e até na área militar. Quando a biomolécula é uma enzima, o biossensor é denominado enzimático. A polifenoloxidase é uma enzima bastante adequada para a detecção de compostos fenólicos [4].

2 No entanto, neste trabalho será tratada uma modificação no processo de imobilização enzimática. À pasta de carbono, serão adicionadas partículas magnéticas de Fe 2 O 3 previamente modificadas com as biomoléculas. As partículas possuem uma característica muito peculiar, que é a sua elevada razão á- rea/volume, inerente a partículas que estejam em dimensão coloidal. Isso permitirá que uma maior quantidade de enzima se ligue às partículas, o que melhorará o sinal do sensor, já que poderá haver aumento da sensibilidade do dispositivo. Com todas estas características, as partículas magnéticas apresentam grande potencial para a construção de sensores [5]. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de biossensores enzimáticos a base de tirosinase (polifenoloxidase) e partículas magnéticas de Fe 2 O 3 para a detecção de compostos fenólicos em matrizes de interesse ambiental. 2. MATERIAIS E MÉTODOS Os equipamentos utilizados para a execução deste projeto foram: Balança de precisão Shimadzu AW 220, Centrífuga Excelsa II Modelo 206 MP Fanem, Espectrofotômetro UV/Vis HP Agilent 8453, phmetro Digimed DM 20 e Potenciostato PGSTAT 30. Os reagentes utilizados foram: Solução Guaiacol 2% (Dinâmica), Óleo Mineral (Nujol), Fosfato de sódio bibásico heptahidratado P.A (Synth) e Fosfato de potássio monobásico P.A (Synth). 2.1 Obtenção da atividade enzimática. A atividade da enzima tirosinase obtida das abobrinhas foi determinada pelas medidas de absorbância no comprimento de onda de 470 nm durante 15 minutos monitorando a formação da benzoquinona. O produto foi obtido a partir de reação de 0,2 ml (200 µl) da solução enzimática do inhame; 0,1 ml (100 µl) de peróxido de hidrogênio 10,3 mmol.l -1 e 2,7 ml de hidroquinona 0,01 mol.l -1 em tampão fosfato 0,1 mol.l -1 (ph 7,0) a 25 o C 2.2 Estudo da resposta do biossensor provido e desprovido de partículas magnéticas de Fe 2 O 3 Este estudo foi realizado para testar se as partículas estão, de fato, amplificando a resposta do sensor. Para tanto, construiu-se um biossensor comum e um biossensor modificado com partículas de Fe 2 O 3. Mediu-se a corrente de cada um em solução tampão fosfato 0,1 mol L -1 ph 7,0 e com o substrato da enzima solução de guaiacol 3,6 mol.l -1 com o auxílio de um potenciostato. 2.3 Estudo da reprodutibilidade de preparação do biossensor O estudo da reprodutibilidade de preparação do sensor tem como finalidade investigar se o método de construção do sensor está sendo eficiente no sentido de produzir medidas com variação pequena entre as mesmas. Para este estudo, foram construídos três sensores distintos e para cada um realizou-se uma medida eletroquímica em solução tampão fosfato ph 7,0 contendo solução de guaiacol 3,6 mmol.l Estudo da repetibilidade de medidas do biossensor A repetibilidadede de medidas do sensor necessitou ser estudada com o intuito de se descobrir se a medida eletroquímica de um sensor decrescia com o tempo, nas mesmas condições experimentais. Isso porque os compostos fenólicos podem formar um filme de material oxidado na superfície do biossensor, fazendo com que haja perda de sensibilidade. Para tanto, construiu-se um sensor e realizaram-se 8 medidas eletroquímicas em solução tampão fosfato ph 7,0 contendo solução de guaiacol 3,6 mmol.l -1, usando-se um único biossensor. 2.5 Determinação de compostos fenólicos em amostras de interesse ambiental via biossensor A curva de calibração se construiu a partir de adições sucessivas de uma solução de guaiacol 3,6 mol.l -1 a 5 ml de tampão fosfato 0,1 mol L -1 ph 7,0. Mediu-se a corrente a cada adição. Construiu-se então a curva de calibração com os valores de concentração no eixo x e de corrente no eixo y, e obteve-se a equação da reta. Contaminou-se uma amostra com 100 µl da solução de guaiacol 3,6 mol.l -1 portanto, contendo 2, mol.l de guaiacol e colocou-se o um biossensor, já nos melhores parâmetros analíticos, em contato com a mesma, e mediu-se o valor de corrente obtido. Então, substituiu-se o valor de corrente obtido na equação da reta e obteve-se o valor de concentração de guaiacol na amostra. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Obtenção da atividade enzimática O cálculo da atividade enzimática é uma etapa importante do processo, pois a partir dos resultados obtidos, pode-se descobrir se a atividade da enzima se mantém a mesma com a biomolécula em solução aquosa. Foi realizado por meio do tratamento dos dados obtidos da espectrofotometria. A substância

3 fenólica hidroquinona (incolor), na presença de tirosinase, se oxida no composto benzoquinona (colorido). O acompanhamento da geração do produto oxidado com o tempo permite que a atividade enzimática seja encontrada. O resultado obtido para a tirosinase, nas condições de obtenção do extrato, foi de 2770,5 U.mL -1, considerado similar aos descritos na literatura, para esta enzima. 3.2 Estudo da resposta do sensor provido e desprovido de particulas de Fe 2 O 3 Este estudo tem a finalidade de verificar se o biossensor está respondendo para o composto fenólico (substrato da tirosinase), uma vez que a enzima está imobilizada sobre as partículas magnéticas e inseridas em pastas de carbono. Além disso, outro biossensor foi construído com a enzima inserida diretamente na pasta de carbono, sem a etapa de imobilização prévia nas partículas de Fe 2 O 3, a fim de verificar a influência do processo de imobilização na resposta do dispositivo sensor. As medidas voltamétricas foram realizadas em tampão fosfato 0,1 mol.l -1, ph 7,0 e após adição de guaiacol (fenol usado no teste). A Figura 1 exibe os resultados obtidos. I(µΑ) s o lu ç ã o ta m p ã o biossensor com nanopartículas biossensor sem nanopartículas E / m V Figura 1 Comportamento do biossensor, com e sem partículas de Fe 2O 3, em solução tampão fosfato 0,1 mol L -1 ph 7,0 e após adição de 3,6 mmol L -1 do composto fenólico guaiacol Observando-se a Figura 1, percebe-se que na solução tampão linha pontilhada não há nenhum pico referente à atividade do biossensor devido a ausência de fenol. No entanto, percebe-se um aumento da corrente com a adição de fenol guaiacol com a existência de picos referentes à oxidação do fenol, como visto na linha contínua. A linha tracejada referente ao biossensor modificado com as partículas magnéticas de Fe 2 O 3 indica uma amplificação de sinal, comparando-se com o biossensor comum o que indica que uma maior quantidade de enzima é encontrada no dispositivo quando há uma etapa prévia de imobilização sobre as partículas magnéticas, como esperado. As reações enzimáticas ocorrem numa escala satisfatória para a detecção, o que é percebido pelo significativo aumento na resposta do biossensor modificado face ao biossensor comum. 3.3 Otimização das condições experimentais A avaliação da influência da quantidade de partículas magnéticas no sensor foi estudada usando os seguintes parâmetros: 25 µl, 50 µl, 100 µl e 150 µl e foi medido o sinal voltamétrico resultante. Verificouse que, ao se dobrar a quantidade das partículas de Fe 2 O 3 (de 25 para 50 µl), os picos de correntes aumentaram, o que indica uma amplificação de sinal, esperada para uma quantidade maior das partículas magnéticas no sistema. No entanto, na curva referente a 100 µl o crescimento do sinal foi muito pequeno, quase irrisório. A curva referente a 150 µl teve resultados inferiores a todas as demais. Portanto, face a estes fatos, a quantidade de partículas escolhidas para a construção de biossensores futuros foi de 50 µl, já que o uso de 100 µl das partículas não é necessário, pois se pode obter resultados muito satisfatórios com uma quantidade menor de partículas magnéticas, o que diminui o custo do dispositivo final. Para se estudar a influência da concentração da enzima na resposta do dispositivo, parâmetro importante para se manter as reações enzimáticas numa escala razoável para detecção, foram construídos quatro biossensores com quantidades diferentes de tirosinase na pasta (139; 277; 544 e 1108 Unidades) e mediu-se o sinal voltamétrico resultante. O melhor sinal analítico foi obtido na concentração mais elevada, ou seja, de 1108 U.mL -1. Concentrações maiores não foram testadas pois tornam a pasta muito líquida, de difícil manuseio. O último parâmetro avaliado foi a influência do tempo de interação da enzima com as partículas magnéticas usando 5; 15; 30 e 60 min. A resposta do biossensor submetido a 5 minutos de interação com as partículas, apresentou um sinal pouco significativo. Isso ocorre pois este pequeno tempo não é suficiente para a fixação da biomolécula no suporte magnético sólido. Ao se submeter a enzima a um tempo maior com as partículas, obteve-se uma resposta maior, que é o caso do tempo de 15 minutos. Essa tendência se manteve devido ao fato de um tempo de interação maior garantir a adesão de mais enzimas às partículas, o que acarreta em mais reações enzimáticas e, portanto, num aumento do sinal do sensor. Em suma, o tempo que se obteve um melhor sinal foi o de 60 minutos, já que um número grande de biomoléculas foi englobado pelas partículas, como espera-

4 do. Tempos de reação maiores não foram testados, pois estes inviabilizam a construção do biossensor, que perde a característica de ser um método rápido de análise Estudo da reprodutibilidade do biossensor e repetibilidade das medidas A repetibilidade de resposta do biosssensor é outro parâmetro importante, pois esta investiga se a medida eletroquímica do sensor permanece constante ou com pouca variação durante um procedimento, o que certamente prejudicaria a confiabilidade do aparato. Para tanto, construiu-se um biossensor e foram realizadas 8 medidas eletroquímicas nas mesmas condições experimentais (tampão fosfato 0,1 mol L -1, ph 7,0, contendo 3,6 mmol L -1 de guaiacol). O resultado do desvio padrão relativo (DPR %) das medidas foi de 0,94%. O baixo valor de desvio padrão relativo indica que as medidas estão muito próximas, uma vez que o valor obtido foi extremamente baixo, portanto, o biossensor possui uma excelente precisão. O estudo da reprodutibilidade de preparação tem como finalidade investigar se o método de preparação está gerando sensores que apresentam medidas similares, com a mesma proporção de constituintes e mesmo tempo de homogeneização. Então, construíram-se três biossensores distintos e realizou-se uma medida eletroquímica para cada um. O valor de DPR% das medidas obtido foi 3,7%. O valor obtido está dentro do aceitável (5%), o que indica que o sistema de adição de partículas magnéticas à pasta de carbono não só melhora o sinal, mas também constitui um sistema reprodutível. 3.5 Determinação de compostos fenólicos em amostras de interesse ambiental via biossensor Na derradeira etapa do trabalho, o biossensor já se encontra apto para teste em amostras reais. A análise de amostras se deu inicialmente pela construção da curva de calibração. I / µa c o n c e n t r a ç ã o d e f e n o l / µ m o l L - 1 Figura 2. Curva de calibração obtida para o biossensor em sucessivas adições de guaiacol Com base na Figura 2, verifica-se que a curva é linear entre as concentrações 2, mol.l -1 a 6, mol.l -1 de guaiacol. O R 2 obtido foi de 0,9958, indicando uma boa linearidade da corrente com o aumento da concentração de fenol no meio Determinação de compostos fenólicos na a- mostra Uma vez confeccionada a curva de calibração, devese obter a equação de reta da mesma antes de partir para a análise da amostra. A equação de reta dessa curva é mostrada abaixo pela equação 1. (Eq. 1) Uma amostra de água residual de indústria foi contaminada com 2, mol.l -1 de guaiacol. Construiu-se um biossensor para a análise, colocou-se o mesmo em contato com a amostra e realizou-se uma medida voltamétrica. A Figura 3 exibe o voltamograma resultante dessa análise Construção da curva de calibração A construção da curva de calibração para o sensor se deu através de sucessivas adições da solução de guaiacol em 5 ml de solução tampão fosfato 0,1 mol L -1 ph 7,0 e para cada adição, uma medida eletroquímica foi realizada. A Figura 2 mostra a curva obtida.

5 I / µa E / mv Figura 3. Voltamograma referente à análise da amostra em água residual industrial contaminada com composto fenólico (guaiacol) No potencial de oxidação de 0,157 V; obteve-se o valor de corrente máxima de 1,6370 µa e substituiuse o mesmo na equação da reta, obtendo-se como resultado 1, mol.l -1 de guaiacol, valor muito próximo ao adicionado. O erro relativo entre os dois valores é de 2,45% Como a concentração encontrada foi muito próxima da adicionada, e o erro entre os valores foi muito baixo, isso prova que o biossensor modificado com as partículas magnéticas de Fe 2 O 3 pode detectar eficientemente compostos fenólicos, com exatidão no processo. AGRADECIMENTOS Ao CNPq pela bolsa concedida e à PUC-Campinas pela oportunidade. REFERÊNCIAS [1] Angelo, P.M.; Jorge, N. (2007) Compostos fenólicos em alimentos uma breve revisão. Rev. Inst. Adolfo Lutz, Vol. 66, No.1, p.1-9. [2] Durán, et al. (2001) Biossensores amperométricos para determinação de compostos fenólicos em a- mostras de interesse ambiental. Quim. Nova, Vol. 24, No. 1, p [3] Dupont, et al. (2010) Biosensors of Laccase Based on Hydrophobic Ionic Liquids Derived from Imidazolium Cation. J. Braz. Chem. Soc., Vol. 21, No. 8, p [4] Marques, P.R.B.O.; Yamanaka, H. (2008) Biossensores baseados no processo de inibição enzimática. Quim. Nova, Vol. 31, No. 7, p [5] Mendes, R.K.; Laschi, S.; Stach-machdo, D.R.; Kubota, L.T.; Marrazza, G. (2012) A disposable voltammetric immunosensor based on magnetic beads for early diagnosis of soybean rust. Sensors and Actuators B: Chemical, vol , n.20, p