Composição do dispositivo 1. Lâminas de substrato Crithidia luciliae (dsdna); 12 poços/lâmina ou 6 poços/lâmina, com excicante
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- Jessica Osório Santana
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1 NOVA Lite dsdna Crithidia luciliae Kits/Substrate Slides Para Diagnóstico In Vitro Código do Produto: , , , Complexidade CLIA: Elevada Aplicação Diagnóstica NOVA Lite dsdna Crithidia luciliae é um ensaio imunofluorescência indirecta para o rastreio e determinação semi-quantitativa de anticorpos anti-duplicação de DNA entrançado (dsdna) no soro humano. A presença de anticorpos antinucleares pode ser usada em conjunto com outros testes serológicos e descobertas clínicas para ajudar no diagnóstico de lúpus eritematoso sistémico (SLE). Resumo e Explicação do teste O teste NOVA Lite dsdna Crithidia luciliae é um teste de anticorpo imunofluorescente indirecto que emprega o hemoflagelado, Crithidia luciliae, como um substrato. Este organismo de célula única possui uma mitocondria gigante contendo uma massa altamente condensada de dsdna circular. 1 Esta massa de dsdna, conhecida como o cinetoplasto, parece estar isenta de histonas ou de outros antígenos nucleares mamíferos. 1,2 Funciona como um substrato sensível e específico para detectar auto-anticorpos para dsdna. Os auto-anticorpos para dsdna ocorrem quase exclusivamente em pacientes com lúpus eritematoso sistémico (SLE) e como tal são considerados anticorpos marcadores. Os auto-anticorpos para dsdna foram incluídos nos Critérios Revistos de 1982 para a Classificação de Lúpus Eritematoso Sistémico por uma subcomissão da Associação de Artrite e Reumatismo. 3 Enquanto que o teste Anticorpo Antinuclear (ANA) usado normalmente é um teste de rastreio sensível para SLE e outras doenças de tecido conjuntivo, não é de modo algum específico para SLE. Em consequência disto, todas as amostras de ANA positivas deverão ser testadas para anticorpos específicos para dsdna. A presença de anticorpos para dsdna indica fortemente SLE; no entanto, a ausência destes anticorpos não exclui SLE em todos os casos. Foram empregados uma diversidade de métodos ao longo dos anos para detectar anticorpos para dsdna. Estes métodos incluem fixação de complemento 4, aglutinação passiva 5 e R I A. 6-8 A vantagem principal de um C. luciliae baseado no teste dsdna é a sua especificidade, devido à natureza da massa enrolada fortemente de dsdna circular no cinetoplasto Esta característica é extremamente importante para um teste de anticorpo marcador. Princípio do Procedimento Na técnica de imunofluorescência indirecta, as amostras são incubadas com o substrato antigénico e anticorpos não reactivos são retirados. O substrato é incubado com conjugado especifico marcado com fluoresceína e depois o reagente em excesso é retirado. Quando se observa através de um microscópio de fluorescência, as amostras positivas com auto-anticorpos, exibirão uma fluorescência verde maçã correspondendo às áreas da célula ou do núcleo onde se ligaram os auto-anticorpos. Composição do dispositivo 1. Lâminas de substrato Crithidia luciliae (dsdna); 12 poços/lâmina ou 6 poços/lâmina, com excicante Apenas em kit 2. Conjugado IgG Anti-Humano (cabra) sem Evan s azul, marcado com fluoresceína em tampão contendo 0,09% de azida de sódio 3. Controlo dsdna, 1 frasco de tampão contendo 0,09% de azida de sódio e anticorpos de soro humano para dsdna, pré-diluído 4. Controlo Negativo IFA, 1 frasco de tampão contendo 0,09% de azida de sódio e sem anticorpos de soro humano para dsdna, pré-diluído 5. PBS II concentrado (40x) 6. Meio de Montagem, 0,09% de azida de sódio 7. Lamelas Advertências 1. Todo o material de origem humana usado na preparação de controlos para este produto foi testado e considerado negativo para anticorpos anti HIV, HBsAg, e HCV pelos métodos aprovados pela FDA. No entanto, nenhum teste pode garantir segurança total em relação à ausência de HIV, HBV, HCV ou de outros agentes infecciosos. Assim, o Controlo de Padrão de Ponto Final de Titulagem ANA e o Controlo Negativo IFA deverão ser manuseados como material potencialmente infeccioso A Azida de Sódio é usada como um conservante. A Azida de Sódio é um veneno e pode ser tóxica se for ingerida ou absorvida através da pele ou dos olhos. A azida de sódio pode reagir com chumbo ou com canalizações de chumbo para formar azidas metálicas potencialmente explosivas. Lave as bacias, se forem usadas para despejar reagentes, com grandes volumes de água para impedir a formação de azida. 1
2 3. Use equipamento de protecção pessoal apropriado enquanto trabalhar com os reagentes fornecidos. 4. Os reagentes derramados deverão ser limpos imediatamente. Cumpra todos os regulamentos ambientais federais, estatais e locais quando descartar detritos. Precauções 1. Este produto (kit) é para Uso de Diagnóstico In Vitro. 2. A substituição de componentes do dispositivo, por componentes diferentes dos fornecidos neste sistema pode conduzir a resultados inconsistentes. 3. A lavagem incompleta ou ineficiente dos poços IFA pode causar uma elevada interferência de fundo. 4. A adaptação deste ensaio para uso com processadores de amostras automatizados e outros dispositivos de manuseamento de líquidos, totalmente ou em parte, podem produzir diferenças nos resultados dos testes em relação aos obtidos com o procedimento manual. É da responsabilidade de cada laboratório validar os seus procedimentos automatizados. 5. Uma diversidade de factores influencia o desempenho dos ensaios. Estes incluem a temperatura de início dos reagentes, a potência da lâmpada do microscópio usado, a exactidão e reprodutibilidade da técnica de pipetagem, a eficácia de lavagem e a duração dos períodos de incubação durante o ensaio. É necessária uma atenção cuidadosa em relação à consistência para obter resultados exactos e reprodutíveis. 6. É recomendado um cumprimento rigoroso dos protocolos. Condições de Armazenamento 1. Armazene todos os lâminas e reagentes a 2-8 C. Não congele. Os reagentes ficam estáveis até à data de validade quando são armazenados e manuseados conforme indicado. 2. O tampão PBS II diluído é estável durante 4 semanas a 2-8 C. Colheita de Amostras Este procedimento deverá ser efectuado com uma amostra de soro. A adição de azida ou de outros conservantes às amostras podem afectar negativamente os resultados. Amostras com contaminação microbiana, tratadas termicamente ou contendo partículas visíveis não deverão ser usadas. As amostras de soro com hemólise macroscópica ou altamente lipémica deverão ser evitadas. Após colheita, o soro deverá ser separado do coágulo. O Documento H18-A3 da NCCLS (CLSI) recomenda as seguintes condições de armazenamento para as amostras: 1) Armazene as amostras à temperatura ambiente durante um período não superior a 8 horas. 2) Se o ensaio não estiver concluido dentro de 8 horas, guarde a amostra a 2-8 C. 3) Se o ensaio não for efectuado em 48 horas, ou se houver transporte da amostra, congele a -20 C ou a temperatura inferior. As amostras congeladas devem ser bem misturadas após descongelação e antes do teste. Procedimento Material fornecido (kits) Laminas com Substrato Crithidia luciliae (dsdna), 6- poços 1 4 ml de FITC Conjugado IgG Anti-Humano 1 0,5 ml de Controlo dsdna 1 0,5 ml de Controlo Negativo IFA 1 25 ml de PBS II Concentrado (40x) 1 7 ml de Meio de Montagem 1 10 Lamelas Laminas com Substrato Crithidia luciliae (dsdna), 12- poços 1 4 ml de FITC Conjugado IgG Anti-Humano 1 0,5 ml de Controlo dsdna 1 0,5 ml de Controlo Negativo IFA 2 25 ml de PBS II Concentrado (40x) 1 7 ml de Meio de Montagem 1 20 Lamelas Material fornecido (lâminas) x dsdna Crithidia luciliae Lâminas com Substrato, 6- poços x dsdna Crithidia luciliae Lâminas com Substrato, 12- poços x dsdna Crithidia luciliae Lâminas com Substrato, 12- poços Material Necessário Não Fornecido Micropipetas de µl de volume Água destilada ou desionizada Frascos de pressão ou pipetas Pasteur Câmara húmida Recipiente de 1L (para diluir PBS II) Tinas Microscópio de fluorescência com filtro de 495 nm e filtro barreira de 515 nm 2
3 Método Antes de começar 1. Todos os componentes devem encontrar-se á temperatura ambiente (20-26ºC) e ser bem misturados. 2. Diluir o PBS II Concentrado : IMPORTANTE: Dilua o PBS II Concentrado 1:40 adicionando o conteúdo do frasco de PBS II Concentrado para 975 ml de água destilada ou desionizada e misture completamente. O tampão PBS II é usado para diluir as amostras dos doentes e como tampão de lavagem. O tampão diluidopode ser armazenado até 4 semanas a 2-8 C. 3. Diluir as Amostras : a. Rastreio Inicial: Dilua as amostras 1:10 com o tampão PBS II diluido (i.e., adicione 100 µl de soro para 900 µl de Tampão PBS II). b. Titulação: Faça diluições em série, duplas, a partir da diluição de rastreio inicial para todas as amostras positivas com Tampão PBS II diluído (i.e. 1:20, 1:40,... 1:640). Procedimento 1. Preparar as Lâminas: Deixe que a Lâmina atinja a temperatura ambiente antes de a remover da saqueta. Marque-a com um lápis e coloque-a numa câmara húmida adequada. Adicione uma gota (20-25 µl) do controlo não diluído positivo e negativo aos poços 1 e 2 respectivamente. Adicione 1 gota (20-25 µl) da amostra do doente diluída aos poços remanescentes. 2. Incubação da Lâmina: Incube a lâmina durante 30 ±5 minutos numa câmara húmida (uma toalha de papel humedecida colocada numa base plana de um recipiente de plástico ou de vidro fechado manterá as condições de humidade adequadas). Não deixe secar o substrato durante o procedimento. 3. Lavagem de Lâminas: Após a incubação, use um frasco de pressão de plástico ou uma pipeta para lavar suavemente o soro com o tampão PBS II diluído. Oriente a lâmina e o fluxo do tampão PBS II de modo a minimizar o transbordo das amostras entre os poços. Evite direccionar o fluxo directamente para os poços para impedir danos nos substratos. Coloque as lâminas na tina de lavagem com PBS II diluído durante mais 5 minutos. Se desejado, coloque as lâminas em um frasco de Coplin do amortecedor diluído de PBS II por até 5 minutos. 4. Adição de Conjugado Fluorescente: Deite fora o excedente do tampão PBS II. Coloque novamente a lâmina na câmara húmida e cubra imediatamente cada poço com uma gota de conjugado fluorescente. Incube as lâminas durante mais minutos. 5. Lavagem de Lâminas: Repita o Passo Lamela: O procedimento para colocar a lamela varia de laboratório para laboratório; no entanto, são recomendados os seguintes procedimentos: a. Coloque uma lamela numa toalha de papel. b. Aplique meio de montagem numa linha contínua na extremidade da lamela. c. Deite fora o excesso de tampão PBS II e toque com a extremidade inferior da lâmina na extremidade da lamela. Baixe a lâmina suavemente no sentido da lamela de tal modo que o meio de montagem flua para a extremidade superior da lâmina sem a formação de bolhas de ar ou artefactos. Controlo de Qualidade O Controlo dsdna o Controlo Negativo IFA deverão ser colocados em todas as lâminas para assegurar que todos os reagentes e procedimentos foram efectuados correctamente. Outros controlos adequados podem ser preparados alíquotando amostras de soro humano e armazenando a < -70 C. De forma a que os resultados dos testes sejam considerados válidos, todos os critérios defenidos devem ser satisfeitos. Se algum destes critérios não for satisfeito, os resultados do teste deverão ser considerados inválidos e o ensaio deverá ser repetido. 1. O Controlo dsdna não diluído deve ser > O Controlo Negativo IFA deve ser negativo. Interpretação dos Resultados Reacção Negativa. Uma amostra é considerada negativa se a fluorescência cinetoplasto específica for igual ou inferior ao Controlo Negativo IFA. A fluorescência de outras estruturas tais como o corpo basal, o flagelo ou o núcleo sem coloração concomitante do cinetoplasto deverá ser considerada negativa, para reactividade de dsdna. Reacção Positiva. Uma amostra é considerada positiva se a fluorescência cinetoplasto específica ou o cinetoplasto mais a fluorescência nuclear específica for superior ao Controlo Negativo IFA. Determine o grau ou intensidade de fluorescência usando estes critérios: 4+ Fluorescência verde maçã brilhante 3+ Fluorescência verde maçã clara 2+ Fluorescência positiva claramente distinguível 1+ Fluorescência específica mais baixa que permite que a fluorescência cinetoplasto seja claramente diferenciada da fluorescência de fundo 3
4 Limitações do Procedimento 1. O utilizador deverá ter consciência dos efeitos do excesso de anticorpos e da possibilidade de obter padrões de coloração não-dsdna enquanto lê as lamelas. 2. Uma diversidade de factores externos influenciam a sensibilidade do teste incluindo o tipo de microscópio de fluorescência usado, a potência e a idade da lâmpada, a ampliação usada, o sistema de filtro e o observador. 3. Se for usado um filtro diferente do filtro de barreira 515, pode ser observado uma fluorescência artificial aumentada. 4. Deve apenas ser usado um lápis para etiquetar as lâminas. A utilização de qualquer outro material de escrita pode provocar fluorescência artificial. 5. Todas as tinas usadas para lavagem de lâminas deverão estar isentas de todos os resíduos de corantes. O uso de tinas contendo resíduos de corantes pode provocar fluorescência artificial. 6. Os resultados deste ensaio deverão ser usados em conjunto com descobertas clínicas e outros testes serológicos. 7. As características do ensaio não foram estabelecidas para matrizes diferentes do soro. As lâminas vendidas em separado têm a classificação de Reagentes específicos de analitos. Excepto como componente do kit NOVA Lite dsdna Crithidia luciliae, as características analíticas e de desempenho não foram estabelecidas. Valores Esperados Utilizando o teste NOVA Lite dsdna Crithidia luciliae, foram testados diversos doentes com doenças do tecido conjuntivo, bem como 200 dadores de sangue aleatórios. Os resultados obtidos foram os seguintes: Grupo Número Número de Positivos NOVA Lite dsdna Crithidia luciliae SLE Lúpus Induzido por Medicamento 24 0 Artrite Reumatóide 40 0 Escleroderme 24 0 Dermatomiosite 14 0 Síndroma de Sjogren 14 0 Normais
5 Referências 1. Aarden LA, de Groot ER, Feltkamp TE: Immunology of DNA. III. Crithidia luciliae, a simple substrate for the detection of anti-dsdna with immunofluorescence techniques. Ann. NY Acad. Sci. 254: , Crowe W, Kusher I: An immunofluorescent method using Crithidia luciliae to detect antibodies to double-stranded DNA. Arthritis and Rheumatism 20: , Tan EM, et al.: The 1982 Revised Criteria for the Classification of Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25: , Arana R, Seligmann M: Antibodies to native and denatured deoxyribonucleic acid in systemic lupus erythematosus. J. Clin. Invest. 46: , Inami YH, Nakamura RM, Tan EM: Microhemagglutination test for the detection of native and single-stranded DNA antibodies and circulating DNA antigen. J. Immunol. Methods 3: , Aarden LA, Lakmaker F, de Groot ER, et al.: Detection of antibodies to DNA by radioimmunoassay and immunofluorescence. Scand. J. Rheu. Suppl. 11: 12-19, Fish F, Ziff M: A sensitive solid phase microradioimmunoassay for anti double-stranded DNA antibodies. Arthritis and Rheumatism 24: , Pincus T, Schur P, Rose JA, et al.: Measurement of serum DNA-binding activity in systemic lupus erythematosus. The New England J. of Medicine 281: , Somerfield SD, Roberts MW, Booth RJ: Double-stranded DNA antibodies: comparison of four methods of detection. J. Clin. Path. 34: , Sontheimer RD, Gilliam JD: An immunofluorescence assay for double-stranded DNA antibodies using the Crithidia luciliae kinetoplast as a double-stranded DNA substrate. J. Lab Clin. Med. 91: , Stingl G, Meingassner JG, Swelty P, Knapp W: An immunofluorescence procedure for the demonstration of antibodies to native, double-stranded DNA and of circulating DNA-anti DNA complexes. Clin. Immunol. Immunopath. 6: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 5 th Edition. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2009 Fabricado por: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : Technical Service (Outside the U.S.) : support@inovadx.com Representante Autorizado: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: PRT December 2012 Revision 16 NO VA Lite e INO VA Diagnos tic s, Inc. s ão m ar c as c om er c iais r egis tadas. Copyr ight 2012 T odos os Dir eitos Res er vados 5
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