Novos Sistemas Terapêuticos

Transcrição

1 Novos Sistemas Terapêuticos

2 Vantagens dos novos sistemas terapêuticos Vectorização do p.a. Diminuição da dose Diminuição dos efeitos secundários

3 Vectorização Vectorização Passiva Vectorização Activa

4 Vectores Lipossomas Nanopartículas Nanoesferas Nanocápsulas

5 Nanopartículas sensíveis a campos magnéticos

6 Outras partículas

7 Vectores virais

8 Vectores de DNA

9 Terapia génica do sonho à realidade

10 Terapia génica Introdução de genes, em células de pacientes, de modo a permitir a modulação ou a correcção de uma doença.

11 Gene viral (infecção) Gene defeituoso Gene inexistente Subs. de genes defeituosos RNA m Inibição RNA m Proteínas virais Proteína Subs. proteína Inib. proteína Novo virus Manifestações patológicas Sintomas clínicos Tratamento sintomático

12 A promessa da terapia génica Cura da doença na sua origem, sem efeitos secundários Evita as limitações do uso de proteínas na prática clínica (baixa biodisponibilidade, fraca farmacocinética, elevados custos de fabrico)

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14 Terapia Génica Breve História 1940 gene e DNA 1960 descoberta da estrutura do DNA º splicing de DNA º experiências de clonagem (Bayer & Cohen) 1975 isolamento de DNA Humano marcação genética Estudos de Imunoterapia anti-hiv Estudo de substituição de gene ADA

15 14 Setembro 1990 Ashanto Desilva 4 anos Imunodeficiência severa combinada Adenosina desaminase - função adequada do sistema autoimune Vulnerável a infecções TERAPIA GÈNICA - NIH Criança com vida normal - 15 anos

16 Realidade Transportador eficiente e selectivo para determinado tipo celular Capacidade de armazenar uma elevada quantidade de material genético Estável na corrente sanguínea Entrega eficiente do material genético às células

17 Mas Necessário o conhecimento profundo das doenças Descoberta do genoma humano - identificação de genes causadores de doenças ESTRATÉGIA ADEQUADA

18 Estratégia utilizadas em terapia génica somática O conceito original - substituição de genes defeituosos ou introdução de genes inexistentes Limitada a doenças causadas por um só gene Patologia Gene defeituoso ou inexistente Tecido/célula alvo Fibrose quística - CFTR (gene regulador da condutância transmembranar) Tracto respiratório Anemia de Fanconi (Complementação do grupo C) Células hematopoiéticas SCID (Adenosino desamoinase - ADA) Linfócitos

19 Estratégias utilizadas em terapia génica somática Uso de genes marcadores - inserção de genes não residentes - monitorização (linfócitos de infiltração tumoral, transplantes de medula ossea em doentes com leucemia); evolução de uma patologia (monitorizar o desenvolvimento de metástases) Utilização de genes terapêuticos Proteínas farmacológicas genes suicidas

20 Genes que codificam a expressão de proteínas farmacologicamente activas (citoquinas, hormonas ou enzimas deficitárias) IL-2 ou factor de necrose tumoral resposta imunológica a tumores Produção de insulina, factor de coagulação IX.. em órgãos não fisiológicos Produção sistémica de moléculas solúveis de CD4

21 Inserção de genes suicidas Terapia antiviral e antitumoral Inserção do gene codificador da cadeia A da toxina diftérica controlado pelo promotor do HIV-1 Timidina - quinase do vírus Herpes simplex (HSV-Tk) - permite a bifosfatação do ganciclovir com inibição da síntese do ADN Citosino-desaminase. Permite a conversão do 5-fluorcitosina em 5-fluoruracilo (activação dos genes suicidas depende de promotores específicos das células tumorais)

22 O uso de oligonucleótidos antisense Formação de estruturas do tipo triplex

23 O uso de oligonucleótidos antisense Por bloqueamento da acção dos pliceossomas Por ligação complementar do oligonucleótido antisense a uma fracção do ARN m

24 O uso de ribozimas Moléculas de ARN capases de promover a clivagem específica de outras moléculas de ARN Condicionantes subjacentes à aplicação da terapia génica Condicionantes genéticas Profundo conhecimento da doença Mecanismos de controlo da expressão génica Técnicas e processos que possibilitem o transporte e cedência intracelular de material genético

25 Transporte e cedência intracelular de material genético Propriedades fisico-químicas do material genético n Macromoléculas hidrofílicas n Elevado peso molecular n Carga superficial negativa n Alteração da biodisponibilidade (nucleases) n Internalização e tráfego intracelular n Translocação para o núcleo

26 Modificações químicas Propriedades fosfodiester metilfosfonato fosforotioato Estabilidade biológica O X H 3 C O NH Uptake celular /- Eficácia de hibridização O P O O N O Activação da RNase H Plasmídeos bacterianos {O - Fosfodiester X S - Fosforotioato CH3 - Metilfosfanato Injecção intramuscular Microinjecção directa Introdução forçada de partículas Electroporação Coprecipitação de partículas MAS

27 Vectores de tipo viral - aprender com a natureza LTR Gene terapêutico LTR Vector retroviral 1 Transdução do vector viral LTR gag pol env Vector construtor LTR pol psigag env 2 Formação de partículas virais Partículas virais recombinantes 3 Infecção das células alvo 4 Integração no ADN hospedeiro produto genético

28 Retrovírus: RNA transcriptase reversa DNA Falta de especificidade Tradução impossível em células que não se dividem Possibilidade de assumir a forma infecciosa Genes de pequenas dimensões Integração ao acaso pró-oncogenes

29 Adenovírus: ADN Infectam todas as células Mutagenese limitada e menor patogenicidade Transporte de material genético de grandes dimensões Expressão O transiente CASO DO PACIENTE 18 Imunogenicidade University of Pensylnani s - administração Institute for Human repetida Gene Therapy limitada Jesse Gelsinger 18 anos Ensaio clínico fase 1 Morte Adenovirus ornitina transcarbamilase Metabolização deficiente do nitrogénio existente nos alimentos Resposta do Sistema Imunitário ARDS - Síndrome de stress respiratório no adulto Privação de oxigénio - morte por asfixia

30 Vectores do tipo não viral Polímeros catiónicos Nanopartículas Lipossomas

31 Porquê transportadores positivos? Condensação do material genético por anulação das cargas positivas MAS Necessária libertação para ser activo

32 In vivo Cauda Administração de lipoplexos na veia da cauda Coração Sistema capilar do pulmão Coração Sistema capilar do coração Figado Orgão (tumores)

33 1ª Barreira - circulação sanguínea Transportador eficiente e selectivo para determinado tipo celular Capacidade de armazenar uma elevada quantidade de material genético Estável na corrente sanguínea Entrega eficiente do material genético às células

34 Distribuição dos lipoplexos na presença de PEG

35 Ligação específica

36 Terapia génica Estratégia terapêutica promissora para cura de doenças

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