Subprojeto Identificação: Título do subprojeto: Avaliação do potencial terapêutico de células-tronco mesenquimais na regeneração de úlceras de
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- Luciana Monteiro Veiga
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1 Subprojeto Identificação: Título do subprojeto: Avaliação do potencial terapêutico de células-tronco mesenquimais na regeneração de úlceras de pele ocasionadas por queimadura térmica extensa em modelo animal País: Brasil Área do conhecimento, segundo tabela do CNPq Área: Dermatologia Código: Dados do coordenador do subprojeto Nome completo: Júlio César Voltarelli Data de nascimento: 17/12/1948 Sexo: Masculino Feminino Nacionalidade: brasileira Endereço eletrônico: 3. Dados da instituição do coordenador do subprojeto Instituição (universidade, centro, empresa, etc): Universidade de São Paulo Sigla: USP Órgão (instituto, faculdade, etc): Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto Unidade (departamento, laboratório, etc): Departamento de Clínica Médica, Divisão de Imunologia Clínica Cargo/função: Professor Titular 4. Resumo do subprojeto (Caracterização do problema e Justificativa) Resumir em, no máximo 1 página, o resumo do subprojeto. Queimaduras térmicas extensas de pele são de difícil tratamento, principalmente porque levam ao comprometimento do sistema imunológico e de outros órgãos, podendo levar o paciente a óbito em poucos dias. Uma alternativa terapêutica recente para o tratamento de úlceras de pele (possivelmente também as ocasionadas por queimaduras extensas) é a utilização de células-tronco mesenquimais (CTMs) para acelerar o processo de regeneração da pele lesada. Nos últimos anos, as CTMs passaram a ser consideradas como uma fonte celular importante para terapias celulares e têm sido utilizadas com eficácia no tratamento de diversas doenças, tais como doenças hematológicas, imuno-mediadas e cardiovasculares, tanto em modelos experimentais quanto em humanos. 1,2 Vários fatores são favoráveis à utilização das CTMs no tratamento de úlceras de pele ocasionadas por queimaduras extensas, tais como suas propriedades de imunoregulação 1,2 e regeneração 3,4,5, seu fácil isolamento de tecidos adultos e expansão in vitro, sua capacidade de migração para sítios de inflamação 1,2 e os resultados satisfatórios de estudos pré-clínicos recentes que demonstraram seu grande potencial terapêutico no tratamento de úlceras de pele. No entanto, pacientes com queimaduras graves necessitam de tratamento com urgência e a expansão de CTMs autólogas até números suficientes de células para aplicação leva de 2-3 semanas, inviabilizando a terapia celular autóloga. Com isto, faz-se necessário a utilização de culturas de CTMs alogênicas, previamente estabelecidas de outros doadores saudáveis. A utilização de CTMs alogênicas possibilita uma maior rapidez no tratamento dos pacientes queimados e conseqüentemente diminui o risco de infecções, pois aumenta velocidade da regeneração da pele lesada. A galectina-1 (Gal-1) é uma lectina que reconhece β-galactosídeos e participa de vários processos biológicos, incluindo a modulação da resposta imunológica, a homeostasia leucocitária e a regeneração tecidual de músculos e nervos. 6 Vários relatos da literatura reportam o potencial uso terapêutico da Gal-1 para tratamento de doenças auto-imunes, inflamatórias e degenerativas. 6 Embora haja descrito alguns poucos estudos 7 que utilizaram CTMs no tratamento de queimaduras de pele, ainda não foi realizado um estudo detalhado dos mecanismos de ação pelos quais as CTMs aceleram o processo de regeneração da pele e promovem a melhora clínica das úlceras ocasionadas por queimaduras graves e extensas. Dessa forma, o presente projeto visa estudar o potencial terapêutico de CTMs xenogênicas e alogênicas no tratamento de úlceras ocasionadas por queimaduras térmicas extensas em ratos. Considerando que a Gal-1 participa do processo de regeneração tecidual e é altamente expressa em CTMs, pretendemos estudar também o impacto da Gal-1 sobre o potencial terapêutico de CTMs xenogênicas no tratamento de úlceras provocadas por queimaduras. Para isto, CTMs serão isoladas da medula óssea de camundongos C57BL/6 selvagens (Gal-1 +/+ ) ou destituídos do gene para Gal-1 (Gal-1 -/- ) ou de ratos e expandidas in vitro. As CTMs (alogênicas, xenogênicas selvagens ou Gal-1 +/+ ) e/ou a galectina-1 recombinante murina (Gal-1rm) serão aplicadas pela via tópica e/ou sistêmica, em previamente submetidos à queimadura de pele extensa. Serão avaliados após o tratamento ou não das queimaduras com as CTMs: a gravidade da queimadura, o processo de regeneração tecidual, o estado de imunossupressão sistêmica, a expressão de fatores angiogênicos, fatores de crescimento, de quimiocinas e citocinas em biópsias das úlceras e a expressão protéica diferencial por análises proteômicas. Serão, portanto, estudados detalhadamente nesse projeto os mecanismos de ação das
2 CTMs no processo de regeneração de úlceras ocasionadas por queimaduras térmicas extensas. Além disso, será feita uma comparação entre potencial terapêutico de CTMs administradas por via tópica ou via sistêmica e uma comparação entre o potencial terapêutico de CTMs alogênicas e xenogênicas. O potencial terapêutico das CTMs na regeneração de úlceras de pele é de grande relevância não só para o tratamento de pacientes com queimaduras térmicas extensas, mas também para pacientes com diabetes, vasculites e aterosclerose que apresentam úlceras de pele neuropáticas, vasculares ou traumáticas. Os resultados desse projeto de pesquisa poderão promover o uso de CTMs como alternativa terapêutica para o tratamento de pacientes com queimaduras extensas e graves, que necessitam de alternativas terapêuticas rápidas e eficazes. Além disso, o projeto poderá gerar informações importantes sobre o papel da galectina-1 na biologia e potencial terapêutico das CTMs. 5. Objetivos Listar os objetivos gerais e específicos do subprojeto. O objetivo geral do presente projeto é estudar o potencial terapêutico e regenerativo de célulastronco mesenquimais (CTMs) xenogênicas e alogênicas no tratamento de úlceras ocasionadas por queimaduras térmicas extensas em ratos, bem como estudar detalhadamente os mecanismos de ação das CTMs no processo de regeneração dessas úlceras. Para isso estabelecemos os seguintes objetivos específicos: Comparar o potencial terapêutico e regenerativo de CTMs xenogênicas e alogênicas; Comparar o potencial terapêutico e regenerativo de CTMs administradas por via tópica e/ou via sistêmica; Comparar o potencial terapêutico e regenerativo de CTMs xenogênicas selvagens (Gal-1 +/+ ) ou destituídos do gene da galectina 1 (Gal-1 -/- ); Avaliar a gravidade da queimadura e o processo de regeneração tecidual por análises histopatológicas das biópsias das úlceras; Analisar a expressão gênica e a expressão in situ de fatores angiogênicos, fatores de crescimento, metaloproteinases, quimiocinas e citocinas em biópsias das úlceras; Analisar a expressão protéica diferencial por abordagem proteômica das biópsias das úlceras. 6. Plano de trabalho Descrever as etapas de execução do subprojeto. Padronização do modelo de queimadura extensa (1º ano); Tratamento das queimaduras com CTMs xenogênicas ou alogênicas (1º e 2º ano); Análise de subpopulações celulares nas biópsias das úlceras por citometria de fluxo (1º e 2º ano); Ensaios de proliferação de linfócitos (1º e 2º ano); Análises histopatológicas, reações de imunohistoquímica e imunofluorescência (1º e 2º ano); Análise de expressão gênica por Real-Time PCR (2º ano); Análise proteômica das úlceras (3º ano). 7. Metodologia (delineamento experimental) Indicar a metodologia que será aplicada na pesquisa pretendida. Com o objetivo de avaliarmos o potencial terapêutico das CTMs na regeneração de úlceras de pele ocasionadas pela queimadura utilizaremos um modelo animal de queimadura em ratos LEWIS. Esses serão previamente anestesiados com solução de xylasina e quetamina e submetidos a queimaduras extensas de aproximadamente 40% da superfície corporal dos ratos, com o auxílio de uma placa de metal aquecida. Os ratos serão submetidos à terapia celular com CTMs xenogênicas isoladas de medula óssea de camundongos C57BL/6 selvagens (Gal-1 +/+ ) ou destituídos do gene da galectina (Gal-1 -/- ) ou CTMs alogênicas isoladas de medula óssea de ratos. As CTMs (alogênicas, xenogênicas selvagens ou Gal-1 +/+ ) e/ou a galectina-1 recombinante murina (Gal-1rm) serão administradas por via tópica e/ou sistêmica, em previamente submetidos à queimadura de pele extensa. Nos dias 7º, 14º e 21º após a terapia celular serão realizadas biópsias de pele para análise histopatológica, extração de RNA, extração de proteínas e isolamento de células para fenotipagem por citometria de fluxo. Também nesses dias o baço dos ratos será extraído para isolamento de esplenócitos para ensaios de proliferação com estímulo mitogênico. A análise histopatológica será feita pela coloração de hematoxilina/eosina e de picrosirius. A análise da expressão in situ de diversos fatores angiogênicos, fatores de crescimento, metaloproteinases, quimiocinas e citocinas será realizada por reações de imunohistoquímica e imunofluorescência. A análise da expressão gênica de fatores angiogênicos, fatores de crescimento, de quimiocinas e citocinas em biópsias das úlceras será feita por PCR em tempo real. A analisar a expressão protéica diferencial de úlceras ocasionadas por queimaduras tratadas ou não com CTMs será feita por análise proteômica das biópsias das úlceras. Os ratos serão subdivididos em cinco grupos de estudo, cada grupo contendo 5 (n=13). GRUPO 1: controles que não serão submetidos à queimaduras. GRUPO 2: os serão
3 apenas submetidos à queimaduras, nos quais será avaliada a capacidade de regeneração espontânea do ferida. GRUPO 3: serão apenas submetidos à queimaduras e receberão tratamento tópico da região queimada com selante de fibrina. GRUPO 4: serão apenas submetidos à queimaduras e receberão tratamento tópico da região queimada com selante de fibrina e CTMs xenogênicas. GRUPO 5: serão apenas submetidos à queimaduras e receberão infusão intravenosa de CTMs xenogênicas. GRUPO 6: Animais queimados receberão tratamento tópico da região queimada com selante de fibrina e CTMs xenogênicas, e também receberão infusão intravenosa de CTMs xenogênicas. GRUPO 7: serão apenas submetidos à queimaduras e receberão tratamento tópico da região queimada com selante de fibrina e CTMs alogênicas (de rato). GRUPO 8: serão apenas submetidos à queimaduras e receberão infusão intravenosa de CTMs alogênicas. GRUPO 9: Animais queimados receberão tratamento tópico da região queimada com selante de fibrina e CTMs alogênicas, e também receberão infusão intravenosa de CTMs alogênicas. GRUPO 10: serão submetidos a queimaduras e receberão tratamento intraperitoneal com galectina-1 ( µg/animal); GRUPO 11: Animais serão submetidos a queimaduras e receberão tratamento tópico da região queimada com selante de fibrina e galectina-1 ( µg/animal). GRUPO 12: serão submetidos a queimaduras e receberão tratamento intraperitoneal com galectina-1 ( µg/animal) e também receberão infusão intravenosa de CTMs xenogênicas; GRUPO 13: Animais serão submetidos a queimaduras e receberão tratamento tópico da região queimada com selante de fibrina, galectina-1 ( µg/animal) e também CTMs xenogênicas. Em alguns, as CTMs serão infectadas com retrovírus recombinantes que carregam o gene LacZ estudos de migração e permanência das CTMs no tecido lesado. 8. Referências 1. Uccelli A, Moretta L, Pistoia V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nature Reviews Immunology. Advance online 18 August 2008; doi: /nri Caplan AI. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine. J Cell Physiol Nov;213(2): Fu X, Fang L, Li X, Cheng B, Sheng Z.Enhanced wound-healing quality with bone marrow mesenchymal stem cells autografting after skin injury. Wound Repair Regen May-Jun;14(3): Badillo AT, Redden RA, Zhang L, Doolin EJ, Liechty KW. Treatment of diabetic wounds with fetal murine mesenchymal stromal cells enhances wound closure. Cell Tissue Res Aug;329(2): Sasaki M, Abe R, Fujita Y, Ando S, Inokuma D, Shimizu H.Mesenchymal stem cells are recruited into wounded skin and contribute to wound repair by transdifferentiation into multiple skin cell type. J Immunol Feb 15;180(4): Salatino M, Croci DO, Bianco GA, Ilarregui JM, Toscano MA, Rabinovich GA.Galectin-1 as a potential therapeutic target in autoimmune disorders and cancer. Expert Opin Biol Ther Jan;8(1): Rasulov MF, Vasilenko VT, Zaidenov VA, Onishchenko NA.Cell transplantation inhibits inflammatory reaction and stimulates repair processes in burn wound. Exp Biol Med Jul;142(1): Equipe Executora - Atividades dos pesquisadores que integram o subprojeto Descrição detalhada do grupo proponente explicitando a qualificação dos pesquisadores. Especificar as atividades a serem desempenhadas pelos membros da equipe, informando as experiências anteriores dos mesmos em atividades de pesquisa e desenvolvimento. Nome CPF Objetivo/Justificativa Função no s Titula Júlio César Voltarelli Dimas Tadeu Covas Lewis Joel Greene Marcelo Dias Baruffi Kelen Cristina R. M. de Farias da atividade Coordenação do projeto projeto (Médico hematologista e imunologista) Análises dos resultados (Terapia Celular) Análises dos resultados obtidos de expressão protéica Produção de galectina- 1 recombinante Análise dos (Post-doc) anteriores clínica e transplantes de medula células-tronco proteoma imunoquímica e celular celular, ção
4 Leandra Naira Zambelli Ramalho Aparecida Maria Fontes Maria Angélica Miglino Análises histopatológicas de pâncreas Análises dos resultados dos modelos Infecção das MSCs com retrovírus recombinantes que carregam o gene LacZ (contratado) molecular e aplicada patologia modelos Patrícia Cristina Baleeiro Beltrão Braga Patrícia Vianna Bonini Palma Carolina Caliári de Oliveira Juliana Navarro Ueda Yaochite Ana Elisa Teófilo Saturi Infecção das MSCs com retrovírus recombinantes que carregam o gene LacZ Análises de citometria de fluxo Realização dos Realização dos Realização dos (Post-doc) (Aluna mestrado) (Aluna mestrado) Aluna de iniciação científica modelos e biologia molecular citometria 10. Fontes de financiamento Relação dos projetos financiados nos últimos 5 anos (vigentes ou encerrados) Fonte de Financiamento Título Vigência Valor Relação com a presente solicitação FINEP (Convênio Nº Transplante de células-tronco hematopoéticas em doenças auto-imunes (encerrado) R$ Auxílio financeiro à linha CNPq (Processo Nº /2005-1) FAPESP (Processo Nº ) Transplante de células tronco hematopoéticas para diabete melito do tipo 1 e doenças neuro-degenerativas 2005-final 2008 R$ CTC-CEPID 2001-atual ~R$ (por ano) Auxílio financeiro à linha Auxílio financeiro à linha 11. Contrapartida das instituições participantes Detalhar, em moeda corrente nacional, a contrapartida das instituições brasileiras e francesas participantes do subprojeto temático, na forma de: infra-estrutura, recursos financeiros, recursos humanos (horas de trabalho), materiais de consumo e diárias e passagens. Não se aplica 12. Orçamento justificado e adequado com a proposta Formulário anexo 13. Bolsas Esses recursos não poderão ultrapassar 15% do valor total solicitado para o projeto Modalidade de bolsa: (IC, ITI, DTI, AT, PDJ, BEV) Modalidade Duração Quantidade Implantação de cursos ou disciplinas de pós-graduação: -
5 Detalhar treinamento tecnológico de alto nível ou implantação de metodologias laboratoriais inovadoras indicar horas/aula e o programa. Indicar classificação CAPES Não se aplica
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