JANDERSON TEIXEIRA RODRIGUES

Transcrição

1 JANDERSON TEIXEIRA RODRIGUES ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA DA EXPRESSÃO DE MARCADORES INFLAMATÓRIOS E DE REPARO TECIDUAL EM CISTOS PERIRRADICULARES INFLAMATÓRIOS PRÉ E PÓS DESCOMPRESSÃO 2016 i

2 JANDERSON TEIXEIRA RODRIGUES ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA DA EXPRESSÃO DE MARCADORES INFLAMATÓRIOS E DE REPARO TECIDUAL EM CISTOS PERIRRADICULARES INFLAMATÓRIOS PRÉ E PÓS DESCOMPRESSÃO Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Odontologia da Universidade Estácio de Sá, como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Odontologia (Endodontia). ORIENTADOR: Prof. Dr. Fábio Ramôa Pires UNIVERSIDADE ESTÁCIO DE SÁ RIO DE JANEIRO 2016 ii

3 Aprendi através da experiência amarga a suprema lição: controlar minha ira e torná-la como o calor que é convertido em energia. Nossa ira controlada pode ser convertida numa força capaz de mover o mundo. (Mahatma Gandhi) iii

4 AGRADECIMENTOS Primeiramente a Deus, por me conceder a coragem e a vontade de mudar o mundo em minha volta. À minha família: pai, mãe, irmãos, primos e tios que sempre me incentivaram e me apoiaram em todos os sentidos, estiveram sempre à disposição para dar suporte às viagens e rotinas. Amo todos vocês. Ao meu grande mestre e orientador, Prof. Dr. Fábio Ramôa Pires, pelo exemplo de profissional, pela dedicação para comigo e pela paciência de sempre. Pelas oportunidades que me ofertou e pelos ensinamentos clínicos que levarei por toda a vida. À eterna e querida Prof a. Dra. Luciana Armada Dias, pelas lições de vida, pelo exemplo como pessoa e profissional, pela disponibilidade constante e pelo incentivo de sempre. Parte do que sou e parte do que sonho ser, devo à você. Aos grandes professores do PPGO, em especial ao Prof. Dr. José Freitas Siqueira Junior, que não medem esforços para levantar a bandeira da Odontologia e nos levam ao cenário internacional como referências no ensino e pesquisa em Endodontia. Aos amigos do Rio de Janeiro, Camila Sampaio, Arthur Valente, Victor Figueiredo, Tissi Nazário e Thaís Medeiros, que estiveram sempre de braços abertos para me receber e faziam me sentir novamente em casa. iv

5 Aos amigos do Ceará, que compreenderam sempre minha ausência, apoiavam minha dedicação ao curso e me faziam esquecer dos problemas quando necessitava. Aos amigos de trabalho da SMS Crateús por darem total apoio durante todo o curso, possibilitando meu afastamento do trabalho durante os períodos de aula e assumindo parte da minha responsabilidade como membro da gestão. Aos meus maravilhosos amigos do PPGO, que sempre estiveram unidos e firmes para apoiar um ao outro, que nunca faltaram com palavras de carinho e incentivo e que eu levarei para o resto da vida como os famosos da Elite PPGO. À nossa secretária do PPGO e amiga, Angélica, pela amizade e amor por todos os alunos do programa. v

6 ÍNDICE RESUMO ABSTRACT LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS LISTA DE ABREVIATURAS vii viii ix x xi 1 INTRODUÇÃO 1 2 REVISÃO DA LITERATURA 3 3 JUSTIFICATIVA 19 4 HIPÓTESE 20 5 OBJETIVO 21 6 MATERIAIS E MÉTODOS 22 7 RESULTADOS 27 8 DISCUSSÃO 36 9 CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS 49 vi

7 RESUMO Objetivo: avaliar a expressão de marcadores inflamatórios e de reparo tecidual em cistos perirradiculares inflamatórios pré e pós descompressão cirúrgica. Materiais e Métodos: participaram do estudo 9 pacientes que apresentavam cistos perirradiculares inflamatórios e que foram submetidos ao procedimento de descompressão cirúrgica antes da enucleação final. As amostras coletadas foram submetidas à análise imuno-histoquímica para os marcadores IL-1β, TNFα, TGFβ1, MMP9, Ki-67 e EGFR. A expressão de cada marcador foi classificada em positiva, focal ou negativa; para o marcador Ki-67 foi calculado o índice de proliferação celular. Os resultados obtidos foram comparados com as informações clínicas e com as tomografias pré e pós descompressão. Resultados: as análises tomográficas pré e pós-descompressão mostraram que todas as lesões apresentaram redução no seu volume total, entretanto, não foi observado um padrão de expressão dos marcadores pró-inflamatórios e de reparo tecidual quando comparadas as expressões nos espécimes cirúrgicos pré e pós-descompressão. Conclusões: a descompressão cirúrgica mostrou-se útil na redução do volume dos cistos perirradiculares antes da remoção cirúrgica final. A análise imuno-histoquímica dos espécimes iniciais e pós-descompressão cirúrgica não mostrou um padrão de redução dos marcadores pró-inflamatórios nem um aumento dos fatores associados ao reparo tecidual na amostra de cistos perirradiculares inflamatórios avaliada. Palavras-chave: Cisto perirradicular inflamatório; descompressão cirúrgica; imuno-histoquímica. vii

8 ABSTRACT Objective: to evaluate the expression of inflammatory and tissue repair markers in periradicular inflammatory cysts before and after surgical decompression. Materials and Methods: the sample included 9 patients with inflammatory periapical cysts managed by decompression previously to surgical enucleation. The surgical specimens were analyzed through immunohistochemistry against IL-1β, TNFα, TGFβ1, MMP9, Ki-67 and EGFR. The expression of each of the studied markers was classified in positive, focal or negative; Ki-67 immunoexpression was calculated as a cell proliferation index. Data were compared with the clinical information and the pre- and post decompression computed tomographic analysis. Results: the computed tomographic analysis pre- and post-decompression showed that all cysts presented a reduction of their volume after the procedure. However a specific pattern of immunoexpression of the studied pro-inflammatory and tissue repair markers was not observed when comparing the pre- and post decompression specimens. Conclusions: surgical decompression was useful in reducing the volume of the inflammatory periapical cysts before surgical enucleation. The immunohistochemical analysis of the specimens obtained previously to and after surgical decompression did not show a standard pattern of decreasing of pro-inflammatory markers or increasing of tissue repair markers on the periapical cysts included in the studied sample. Keywords: Inflammatory periapical cyst; surgical decompression; immunohistochemistry. viii

9 LISTA DE FIGURAS Página Figura 1. Vista panorâmica de tomografia computadorizada cone beam do caso 3, mostrando em (A) a imagem inicial e em (B) a imagem pós-descompressão, com redução de 81% do volume do CP após 9 meses de descompressão. 29 Figura 2. Vista axial de tomografia computadorizada cone beam do caso 8, mostrando em (A) a imagem inicial e em (B) a imagem pósdescompressão. 30 Figura 3. Vista panorâmica de tomografia computadorizada cone beam do caso 5, mostrando em (A) a imagem inicial e em (B) a imagem pós-descompressão, com redução de 68,5% do volume do CP após 10 meses de descompressão. 31 Figura 4: Expressão de IL1β no revestimento epitelial e nas células inflamatórias de um CP antes (A, HE 20x) e depois (B, HE 20x) da descompressão. 32 Figura 5: Expressão de TGFβ1 na cápsula de tecido conjuntivo fibroso de um CP antes (A, HE 20x) e depois (B, HE 20x) da descompressão. 33 Figura 6: Expressão de MMP9 na cápsula de tecido conjuntivo fibroso de um CP antes (A, HE 20x) e depois (B, HE 20x) da descompressão. 33 Figura 7: Expressão de EGFR no revestimento epitelial de um CP antes (A, HE 20x) e depois (B, HE 20x) da descompressão. 34 Figura 8: Expressão de Ki-67 em menos de 1% das células epiteliais do revestimento de um CP antes (A, HE 20x) e depois (B, HE 20x) da descompressão (detalhe das células positivas nos boxes). 34 ix

10 LISTA DE TABELAS Página Tabela 1. Anticorpos primários utilizados no estudo com seus respectivos clones, fabricantes e diluições. 25 Tabela 2. Dados demográficos e clínicos da amostra. 27 Tabela 3. Dados referentes ao volume tomográfico, percentual de redução tomográfica dos CP e dentes associados aos CP nos casos estudados. 28 Tabela 4. Resultados da imunoexpressão dos marcadores avaliados no estudo nos fragmentos de descompressão e da enucleação final dos cistos perirradiculares. 35 x

11 LISTA DE ABREVIATURAS CP: Cisto perirradicular inflamatório EGF: Fator de crescimento epidérmico EGFR: Receptor do fator de crescimento epidérmico IL: Interleucina LP: Lesão perirradicular inflamatória LPS: Lipopolissacarídeo MMP: Metaloproteinase de matriz MTA: Agregado trióxido mineral PBS: Solução salina tamponada com fosfato PG: Prostaglandina TGF-β: Fator transformante de crescimento beta TNF-α: Fator de necrose tumoral alfa TOQ: Tumor odontogênico queratocístico xi

12 1 INTRODUÇÃO As lesões perirradiculares inflamatórias (LP) são doenças de caráter inflamatório e etiologia infecciosa que se estabelecem a partir da existência de uma infecção no sistema de canais radiculares, que deve ser combatida pelo cirurgião dentista através de estratégias antimicrobianas incluídas no tratamento endodôntico. O sucesso da terapia endodôntica depende diretamente do estabelecimento do diagnóstico correto e da escolha de métodos antimicrobianos que visem reduzir a carga microbiana presente nos canais, devolvendo então a capacidade de reparo dos tecidos perirradiculares. Desta forma, para se obter reparo e a remissão das LP, deve-se inicialmente combater os agentes infecciosos presentes no sistema de canais radiculares (SIQUEIRA et al., 2012). O cisto perirradicular inflamatório (CP) é um dos tipos de LP que se origina na porção perirradicular de dentes com polpa necrótica. Radiograficamente apresenta-se como uma área radiolúcida habitualmente bem delimitada circundada por um halo radiopaco, associada ao periápice de dentes desvitalizados. Na maioria das vezes apresentam pequenas dimensões, no entanto, podem atingir tamanhos maiores, causando importantes transtornos locais (SIQUEIRA et al., 2010; BRAVE et al., 2011). Histopatologicamente caracteriza-se por uma cavidade preenchida por conteúdo líquido e restos celulares, circundaa por um epitélio pavimentoso estratificado, envolto por tecido de granulação e mais externamente por uma cápsula de tecido fibroso (SIQUEIRA et al., 2010). 1

13 De forma geral, além do tratamento endodôntico convencional, os CP podem ser tratados por meio de cirurgias perirradiculares com ou sem apicetomia associada ou com a exodontia do elemento afetado com simultânea enucleação total da lesão (MARTINS-FILHO et al., 2009). A descompressão seguida da enucleação cirúrgica do CP é considerada uma boa opção terapêutica em casos de CP de grandes proporções, visando preservar estruturas nobres e limitar o tamanho da cirurgia (POZZER et al., 2011). No entanto, pouco se conhece sobre os fenômenos pró-inflamatórios e pró-reparo que modulam este processo. 2

14 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Cistos perirradiculares inflamatórios (CP) Os CP são lesões odontogênicas reacionais crônicas que acometem a região perirradicular de dentes comprometidos endodonticamente, podendo surgir na região mais apical ou lateralmente à raiz quando na existência de canais laterais. A origem da palavra "cisto" vem do grego Kystis, que significa bexiga, e faz alusão à morfologia da lesão (NAIR, 1998). Os CP são os cistos intraósseos mais comuns dos maxilares e podem representar entre 6 e 58% das lesões perirradiculares inflamatórias diagnosticadas em laboratórios de Patologia Oral (NAIR, 1998; RICUCCI et al., 2006; BECCONSALL-RYAN et al., 2010; JOHNSON et al., 2014). Os CP resultam de uma proliferação tecidual que ocorre em resposta a uma infecção endodôntica de longa duração, sendo decorrentes da presença de microrganismos no sistema de canais radiculares, quase sempre relacionados a lesões cariosas, que se instalam e se multiplicam nos canais após a necrose da polpa (SIQUEIRA et al., 2010). Estes agentes infecciosos produzem substâncias irritantes que induzem uma resposta inflamatória que se estende aos tecidos que circundam o dente (NAIR et al., 1990; LIAPATAS et al., 2003). A patogênese do CP envolve mecanismos imuno-inflamatórios e acredita-se que seja originada a partir da existência prévia de um granuloma perirradicular, que sofreu processo de epitelização por meio do estímulo inflamatório à proliferação dos restos epiteliais de Malassez. Estas estruturas são embriologicamente derivadas da degeneração da bainha epitelial radicular 3

15 de Hertwig e podem permanecer quiescentes no ligamento periodontal na vida adulta (SANTOS et al., 2006). Quando estimulados por citocinas e outros produtos derivados do processo inflamatório, proliferam formando ninhos de células epiteliais que, após degeneração de sua porção central, dão origem ao epitélio de revestimento dos CP, circundando a cavidade central preenchida por material líquido ou semi-sólido (MÁRTON & KISS, 2000; SANTOS et al., 2011). Dessa forma, os CP caracterizam-se histopatologicamente pela presença de uma cavidade central preenchida por conteúdo líquido ou semisólido, contendo principalmente células inflamatórias, hemorragia e restos epiteliais provenientes da descamação do epitélio cístico, que é classificado como pavimentoso estratificado não queratinizado, possuindo espessura variável (MOREIRA et al., 2000; PIATTELLI, et al., 2004). Na parede de tecido conjuntivo que circunda externamente o epitélio há presença de tecido de granulação, com predomínio de macrófagos, linfócitos, plasmócitos e neutrófilos polimorfonucleares. Podem ser encontradas, eventualmente, fendas negativas de cristais de colesterol, as quais podem ser adicionalmente encontradas no lúmen cístico (SIQUEIRA et al., 2014). Circundando todo este conteúdo e separando a lesão do tecido ósseo adjacente, existe uma cápsula de tecido conjuntivo fibroso denso, rico em fibras colágenas (SIQUEIRA et al., 2010). Os CP mostram discreta predileção por homens na quarta e quinta décadas de vida, localizando-se preferencialmente na maxila anterior. Radiograficamente apresentam-se como áreas radiolúcidas uniloculares 4

16 perirradiculares, geralmente de forma circular ou ovoide, com bordas bem delimitadas por um halo radiopaco, associadas a dentes com lesões cariosas ou restaurações extensas (NAIR, 1998; KUC et al., 2000; BECCONSALL- RYAN et al., 2010; SIQUEIRA et al., 2010; JOHNSON et al., 2014). O tratamento dos CP inicialmente é baseado na desinfecção do sistema de canais radiculares fazendo uso de instrumentação e irrigação com agentes antimicrobianos, seguida por medicação intracanal e obturação destes canais, objetivando perpetuar o estado de desinfecção (MURPHY et al., 1991; SIQUEIRA et al., 2010). Acredita-se que com as manobras clínicas habitualmente utilizadas no tratamento endodôntico conservador, alguns CP possam regredir, em especial aqueles nos quais a porção radicular encontra-se projetada no interior da cavidade cística (cistos "baía") em contraste com aqueles nos quais a cavidade cística encontra-se completamente fechada, separada da porção radicular ("cistos verdadeiros") (NAIR, 1998). No entanto, em alguns casos os CP podem persistir a despeito da intervenção endodôntica, mesmo que esta siga padrões de qualidade, e continuar crescendo, atingindo grandes dimensões e causando transtornos locais significativos, tais como aumento de volume, dor e infecção secundária (por vezes associada a drenagem de material purulento), deslocamento dos dentes adjacentes e rompimento das corticais ósseas (RAMAKRISHNA & VERMA, 2006). Nesses casos há indicação de procedimentos cirúrgicos para o tratamento dos CP, os quais podem incluir a remoção do dente associado e do CP por meio de enucleação ou curetagem cirúrgica (nos casos nos quais não há possibilidade de aproveitamento dos dentes associados) ou cirurgias 5

17 paraendodônticas (REES, 1997; LUSTIG et al., 1999; KADAM et al., 2014). No entanto, em algumas situações, em virtude do tamanho da lesão e/ou de sua íntima relação com estruturas anatômicas adjacentes (por exemplo fossa nasal, seio maxilar, e canal mandibular) o procedimento cirúrgico pode acarretar considerável aumento do risco de morbidade ao paciente (NEAVERTH & BURG, 1982). Dentre as opções cirúrgicas terapêuticas adicionais, a descompressão mostra-se a menos invasiva, havendo risco mínimo de danificar estruturas anatômicas nobres (MARTIN, 2007). 2.2 Descompressão cirúrgica A descompressão cirúrgica, por vezes confundida com a marsupialização, é uma técnica pouco invasiva utilizada no tratamento de lesões císticas que acometem os ossos gnáticos. Consiste na remoção de uma janela da cavidade cística, preservando o restante da lesão, estabelecendo um contato entre o cisto e a cavidade oral. A técnica objetiva diminuir a pressão intracística e assim acelerar o processo de cicatrização óssea (MARKER et al., 1996; BODNER et al., 2003; ELLIS, 2005; NAWAZ et al., 2011). A diferença entre as técnicas de descompressão e marsupialização consiste basicamente na utilização de dispositivos próprios para manter a abertura da cavidade cística na descompressão, em contraste com a marsupialização, na qual esta abertura é mantida apenas pela sutura realizada prendendo a mucosa oral ao restante da membrana cística (NEAVERTH & BURG, 1982). A descompressão pode ser utilizada como terapia única, resultando na regressão total da lesão, ou pode ser utilizada como etapa preliminar à uma 6

18 enucleação, visando a diminuição da lesão anterior a sua remoção total (ELLIS, 2005; TORRES-LAGARES et al., 2011). O procedimento tem mostrado bons resultados quando aplicado ao tratamento de lesões odontogênicas de morfologia cística, incluindo CP, podendo inclusive ser aplicada em pacientes pediátricos com dentição mista, buscando resultados mais conservadores de tratamento com a preservação dos dentes permanentes próximos às lesões (MARKER et al., 1996; DELBEM et al., 2003; SUN et al., 2009); ou no tratamento de pacientes na idade adulta, apresentando dentição permanente (SAMUELS, 1965; WONG, 1991; TANDRI, 2010); ou ainda em pacientes totalmente edêntulos (SAKKAS et al., 2007). ULOOPI et al. (2015) discutiram uma série de 4 casos de CP de grandes dimensões acometendo crianças com dentição mista, tratados de forma conservadora a partir da técnica de descompressão. Os autores demonstraram que a descompressão é uma terapia bem indicada nos casos de CP extensos, justificando-se pela menor morbidade, preservação de estruturas anatômicas importantes, conservação de elementos dentários, formação de tecido ósseo que facilita uma abordagem cirúrgica posterior, tendo bons resultados de reparo principalmente em crianças, graças a alta capacidade regenerativa em pacientes jovens. Estas vantagens em pacientes jovens e pediátricos têm sido demonstradas em outros estudos, que mostraram adicionalmente neoformação óssea mais acelerada em CP, quando comparados a outros cistos odontogênicos (GAO et al., 2014; ALLON et al., 2015). Os critérios utilizados na seleção dos casos submetidos a descompressão/marsupialização levam em consideração a proximidade da 7

19 lesão com estruturas anatômicas nobres, a facilidade do acesso cirúrgico, a idade e a capacidade cognitiva do paciente, a extensão cirúrgica, o tamanho da lesão cística e o transtorno que será produzido pelo procedimento cirúrgico convencional, incluindo o dano aos dentes adjacentes (DELBEM et al., 2003; ELLIS, 2005). A maior vantagem da descompressão consiste na sua pequena invasividade, tornando-se um procedimento que gera baixa morbidade ao indivíduo, preservando estruturas anatômicas importantes e sendo um procedimento cirúrgico pouco complexo. Entre as principais desvantagens, apontam-se o fato do tecido patológico permanecer in situ, deixando o diagnóstico histopatológico restrito à análise apenas do fragmento removido, e o desconforto gerado ao paciente, tendo em vista que estes precisam redobrar os cuidados com a higiene oral, para impedir a ocorrência de processos infecciosos no local operado no período durante o qual a abertura cirúrgica estará presente na boca (GUNRAJ, 1990; ELLIS, 2005; ANAVI et al., 2011). Embora existam evidências clínicas de que a descompressão seja uma técnica útil no manejo de CP de grandes dimensões (ULOOPI et al., 2015), pouco se conhece sobre os mecanismos imuno-inflamatórios pelos quais passa a lesão ao longo do processo. 2.3 Inflamação e Reparo tecidual nas LP Define-se como inflamação uma resposta imunológica ao nível da microcirculação, estimulada por agentes agressores e que repercute na movimentação de células e componentes moleculares, que atravessam os vasos para chegar aos tecidos agredidos, com a finalidade de eliminar o 8

20 agressor. Este processo é complexo e envolve mecanismos importantes para a compreensão da trajetória que seguem as doenças inflamatórias. A inflamação pode ser classificada como aguda ou crônica e apresentará rotineiramente os mesmos mecanismos, variando apenas a intensidade e a persistência destas etapas (SIQUEIRA et al., 2010). Em situações fisiológicas normais, o organismo apresenta mecanismos de defesa, barreiras e processos que impedem ou diminuem os danos provenientes de uma agressão externa, seja ela física, química ou biológica. O organismo humano possui a capacidade de identificar, diferenciar e responder à agressores como os microrganismos. Porém, em determinadas situações, a própria defesa do organismo acaba gerando danos teciduais indiretos, resultando no surgimento de doenças inflamatórias. Os microrganismos são sabidamente os agentes etiológicos das alterações patológicas da polpa e dos tecidos perirradiculares, no entanto, para que os CP se estabeleçam, é necessário o desenvolvimento de mecanismos inflamatórios, que envolvem respostas celulares e moleculares (SIQUEIRA-JÚNIOR & SABÓIA-DANTAS, 2000). O objetivo principal da resposta inflamatória nestas situações é eliminar o agente agressor, deixando o organismo em condições adequadas para o reparo tecidual. Caso a missão seja alcançada com êxito, ocorrerá o reparo, que será dependente da extensão, intensidade e persistência da agressão, além do tipo de tecido que foi afetado, podendo se realizar através dos processos de cicatrização ou regeneração. Em alguns casos, este mecanismo inflamatório é suficiente para eliminar o agressor, havendo uma recuperação 9

21 natural dos tecidos, sem que haja uma intervenção profissional. No entanto, tratando-se de resposta inflamatória proveniente de infecções odontogênicas, em quase todos os casos deve haver uma intervenção do profissional através da remoção mecânica de parte dos microrganismos ou, se necessário, uma associação farmacológica de agentes antimicrobianos (SIQUEIRA-JÚNIOR & SABÓIA-DANTAS, 2000; ABBAS et al., 2012). Na existência de infecção no sistema de canais radiculares, são liberadas substâncias moleculares nos tecidos perirradiculares que acabam por induzir um quadro imuno-inflamatório. Quando há o reconhecimento por parte do sistema imune do hospedeiro de moléculas sinalizadoras, como os lipopolissacarídeos (LPS) presentes na parede celular de bactérias Gram negativas, é desencadeada a liberação de inúmeros mediadores químicos inflamatórios, substâncias como as aminas vasoativas, citocinas inflamatórias e quimiocinas, que desempenham papel importante nos efeitos histológicos do quadro inflamatório (MEDZHITOV, 2008; SIQUEIRA et al., 2010). O principal efeito desencadeado por estes mediadores inflamatórios é a formação de um exsudato composto basicamente por leucócitos e plasma proveniente dos vasos sanguíneos mais próximos à área afetada. As principais células envolvidas nesta resposta são os macrófagos e os neutrófilos, que são os primeiros à atuar no combate à agressão tecidual, dando espaço posteriormente à chegada de linfócitos que serão responsáveis por uma resposta imune adaptativa, que se caracteriza pela maior complexidade de processos celulares e moleculares, bem como pela maior especificidade (BARTON & KAGAN, 2009). 10

22 2.4 Interleucina 1 beta A Interleucina 1 (IL-1) é um mediador químico inflamatório e pode ser codificada em duas formas diferentes (IL-1α e IL-1β), cada qual possuindo sequências de bases nitrogenadas distintas, tendo apenas 35% de homologia em sua sequência de aminoácidos. Possuem ainda diferencial de ponto isoelétrico, tendo ambas peso molecular aproximado de 17kDa e receptor celular em comum. Os macrófagos são as principais células envolvidas na síntese da IL-1, podendo ser estimulados pela presença da própria IL-1 ou de diferentes mediadores como o fator de necrose tumoral α (TNF-α) e o interferon gama. Há uma discrepância em relação às quantidades produzidas dos dois subtipos, sendo que a síntese de IL-1β pode ser cerca de cinco vezes maior que a de IL-1α (SIQUEIRA-JÚNIOR & SABÓIA-DANTAS, 2000; TAKEUCHI & AKIRA, 2010). Sua atividade na resposta inflamatória está ligada principalmente a ativação de fagócitos como os macrófagos, também estimulando-os a sintetizar prostaglandinas (PG), possuindo assim ligação indireta com o estado febril, tendo em vista o efeito das PG sobre hipotálamo; funciona ainda como citocina quimiotática para neutrófilos e participa dos mecanismos de reabsorção óssea (LADER & FLANAGAN, 1998; SIQUEIRA-JÚNIOR & SABÓIA-DANTAS, 2000). Os mecanismos celulares envolvidos na atividade da IL-1β frente à reabsorção óssea estão relacionados à capacidade desta molécula em estimular a replicação e maturação de células hematopoiéticas precursoras de osteoclastos, além de estimular a atividade fagocítica destas células quando maduras (SIQUEIRA et al., 2010). Esta citocina possui atividade inibitória da 11

23 síntese óssea, semelhante ao paratormônio, sendo correlacionada com os achados clínicos de reabsorção óssea dos quadros de doenças periodontais e lesões perirradiculares. Apresenta ainda capacidade de induzir a proliferação epitelial, contribuindo para o crescimento e desenvolvimento do epitélio dos CP (MEGHJI et al., 1996; SIQUEIRA-JÚNIOR & SABÓIA-DANTAS, 2000). 2.5 Fator de necrose tumoral alfa O TNF-α, também denominado de linfotoxina, é um mediador químico da inflamação sintetizado principalmente por monócitos, macrófagos ativados e linfócitos T. Possui importante papel dentro do quadro inflamatório, tendo efeito nas etapas de migração de células de defesa através dos vasos sanguíneos, pois o mesmo estimula a expressão de moléculas de adesão nas células endoteliais (SIQUEIRA et al., 2010). Atua ainda na estimulação do hipotálamo, tendo ligação direta com os quadros de febre; na estimulação de atividade citotóxica de neutrófilos e monócitos; na indução da síntese de outras citocinas (como a IL-1 e a IL-6); e influencia na atividade osteoclástica (SIQUEIRA- JÚNIOR & SABÓIA-DANTAS, 2000; AGGARWAL, 2003). O estudo realizado por JURISIC et al. (2008) avaliou a relação da concentração de TNF-α com achados histopatológicos de 43 CP coletados no Laboratório de Patologia da Universidade de Belgrado (Sérvia). As maiores concentrações de TNF-α encontravam-se em lesões de tamanho reduzido, com fluído cístico rico em conteúdo proteico e paredes da cavidade cística bem espessas, e foi encontrada íntima relação entre a quantidade deste marcador e a intensidade de infiltrado inflamatório em alguns CP. TEIXEIRA-SALUM et al. 12

24 (2010) também encontraram expressão positiva de TNF-α em CP, ressaltando a importância desta citocina na sua patogênese. 2.6 Metaloproteinase de matriz 9 As metaloproteinases de matriz (MMP) são um grupo de enzimas envolvidas nos mecanismos de remodelação tecidual e estão diretamente ligadas aos processos de degradação da matriz extracelular do tecido conjuntivo durante as agressões microbianas, sendo importantes imunomoduladores, inclusive nos casos de lesões perirradiculares (BRINCKERHOFF & MATRISIAN, 2002; SILVEIRA et al., 2007). São subdivididas em 25 tipos de enzimas, que são classificadas em 5 grupos: gelatinases (MMP-2 e 9), colagenases (MMP-1, 8 e 13), estromelisinas (MMP- 3, 10 e 11), tipo-membrana e outras, incluindo a matrilisina (KUMAMOTO et al., 2003). O nome metaloproteinase está relacionado com a necessidade que estas enzimas possuem de ter associação com o Zinco para que ocorra sua ativação. Apresentam bastante homologia entre seus subtipos, sendo diferenciados apenas pela especificidade que apresentam para cada substrato molecular (SIQUEIRA-JÚNIOR & SABÓIA-DANTAS, 2000). A síntese destas moléculas ocorre pelas próprias células que compõem o tecido conjuntivo como osteoblastos, osteoclastos, macrófagos e células endoteliais. Quando circulantes, encontram-se em seu estado inativo (pró-peptídeo), sendo necessária uma ligação entre o seu aminoácido cisteína e uma molécula de Zinco para efetuar a ativação (SIQUEIRA-JÚNIOR & SABÓIA-DANTAS, 2000). 13

25 A MMP-9 apresenta peso molecular aproximado de 92 kda e é responsável pela clivagem da elastina, sendo produzida por neutrófilos, macrófagos, fibroblastos e osteoclastos (SIQUEIRA-JÚNIOR & SABÓIA- DANTAS, 2000). As células do epitélio de revestimento dos cistos odontogênicos e os fibroblastos e miofibroblastos da cápsula são capazes de sintetizar MMPs, que participam ativamente da clivagem das fibras colágenas e da degradação da matriz óssea (HENRIQUES et al., 2011). A MMP-9 facilita a migração dos leucócitos em meio ao tecido conjuntivo, tendo em vista que provoca o rompimento de fibras colágenas do tipo IV (GOETZL, 1996). Em estudo avaliando a expressão de MMP-9 em CP e outros cistos e tumores odontogênicos, HENRIQUES et al. (2011) identificaram expressão difusa deste marcador no tecido epitelial e mesenquimal do CP, havendo marcação em todas as camadas do epitélio de 90% dos CP avaliados pelo estudo. Estes autores associam a presença da MMP-9 em CP com o grau de destruição tecidual encontrado. 2.7 Ki-67 Na patogênese do CP, assim como no desenvolvimento de outros cistos odontogênicos, existe um potencial de proliferação celular, que pode ser avaliado por meio de marcadores imuno-histoquímicos que identificam proteínas envolvidas no ciclo celular. Marcadores como o Ki-67 são baseados em anticorpos monoclonais que identificam as fases ativas do ciclo celular (AGARAM et al., 2004), sendo o mais amplamente utilizado atualmente para observar este tipo de marcação. Este marcador pode ser associado a fase S do 14

26 ciclo celular, assim como nas fases G2 na intérfase e durante a mitose priopriamente, onde atinge seu pico de expressão, vindo a diminuir sua intensidade logo após o término da mitose (SLOOTWEG, 1995; MACLUSKEY et al., 1999; MENDES et al., 2011). Devido sua íntima relação com a atividade proliferativa, vem sendo utilizado nos estudos que visam entender melhor o desenvolvimento de neoplasias e outras lesões reacionais que envolvem proliferação celular (MACLUSKEY et al. 1999). NADALIN et al. (2011) realizaram estudo avaliando CP e outros cistos e tumores odontogênicos, objetivando observar o papel do Ki-67 na patogênese destas lesões. Os autores identificaram marcação positiva para Ki-67 em 60% dos CP avaliados, estando esta expressão restrita, na grande maioria das vezes, às camadas basais do epitélio, mostrando a íntima relação deste marcador com a atividade proliferativa. MARTINS et al. (2011) encontraram positividade de Ki-67 em CP e cistos dentígeros, observando maior expressão nas camadas basais do epitélio dos cistos e uma maior expressão do marcador nas lesões com infiltrado inflamatório mais exuberante. 2.8 Receptor do fator de crescimento epidérmico O receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) é um receptor celular que se liga a fatores que regulam o crescimento e proliferação celular, como o fator de crescimento epidérmico (EGF). Este receptor caracteriza-se por apresentar uma porção extra e outra intracelular, sendo que este posicionamento em relação a membrana plasmática tem relação direta com a capacidade e velocidade proliferativa das células que o possuem. Observa-se 15

27 que as células que possuem o EGFR expresso em sua porção externa apresentam alto padrão de proliferação (OLAYIOYE et al., 2000; HERBST & SHIN, 2002; SERGINA & MOASSER, 2007). A presença deste marcador em células do epitélio de lesões odontogênicas pode ter relação direta com o seu crescimento e desenvolvimento (HERBST, 2004; GULKESEN et al., 2001). Este marcador pode estar presente tanto em células do epitélio de desenvolvimento do germe dentário, como no tecido epitelial de cistos odontogênicos (LI et al., 1997; TANIKAWA & BAWDEN, 1999). GONÇALVES et al. (2012) avaliaram amostras de CP utilizando métodos de imuno-histoquímica para compreender a expressão de EGFR, tendo sido possível observar a expressão deste receptor em todas as camadas epiteliais dos casos analisados. 2.9 Fator transformante do crescimento beta O Fator transformante do crescimento beta (TGF-β) é uma citocina encontrada no tecido ósseo e no tecido conjuntivo, sendo produzida principalmente por macrófagos, linfócitos T e plaquetas. Apresenta ação estimuladora da função dos osteoblastos, tendo influência no crescimento e diferenciação destas células. Atua ainda inibindo a ação osteoclástica, por possuir mecanismos de inibição dos precursores destas células e por diminuir a atividade das mesmas quando maduras (TACHI et al., 2011). Por se tratar de um fator estimulador de células reparadoras, está diretamente ligado aos processos de reparo tecidual e tem sido demonstrado que esta citocina possui 16

28 a capacidade de estimular a formação de fibras colágenas (SIQUEIRA-JÚNIOR & SABÓIA-DANTAS, 2000; HEINEMEIER et al., 2007). MORAES et al. (2014) realizaram um estudo avaliando a expressão imuno-histoquímica de TGF-β em CP e cistos dentígeros, observando intensa marcação deste mediador em células do epitélio do CP, havendo presença de TGF-β tanto no citoplasma, quanto no núcleo das células das camadas mais basais do tecido. Quando estes mesmo autores avaliaram a cápsula fibrosa do CP, observaram intensa expressão de TGF-β no citoplasma de fibroblastos, neutrófilos e macrófagos, chegando a conclusão de que a presença deste marcador pode estar ligada diretamente com a atividade osteogênica. No entanto, outros estudos não identificaram expressão em células do epitélio do CP, havendo positividade apenas em células do estroma (TYLER et al., 1999; PIATTELLI et al., 2004). FUKADA et al. (2009) e TEIXEIRA-SALUM et al. (2010) compararam a expressão deste mediador em CP e granulomas perirradiculares, observando índices semelhantes de expressão imunohistoquímica desta citocina Imuno-histoquímica e descompressão Avaliando uma série de 10 casos de tumor odontogênico queratocístico (TOQ), SUYAMA et al. (2008) observaram a expressão imuno-histoquímica de IL-1α e seus receptores antes e após estas lesões serem submetidas ao tratamento com descompressão, identificando marcação positiva deste mediador em todos os espécimes antes do procedimento, havendo expressão principalmente nas células epiteliais, células endoteliais e fibroblastos. Na 17

29 segunda amostra dos casos, momento pós-descompressão, foram verificadas marcações significativamente reduzidas de IL-1α e seu receptor nos cistos, havendo uma alteração na concentração deste mediador inflamatório após a terapêutica cirúrgica escolhida. Também avaliando uma amostra composta por TOQ submetidos à descompressão cirúrgica, AUGUST et al. (2003) utilizaram métodos imunohistoquímicos para avaliar a expressão de citoqueratina 10 em amostras pré e pós descompressão. Levando em consideração a redução de tamanho das lesões avaliadas através de radiografias panorâmicas, NAKAMURA et al. (2002) avaliaram a expressão de Ki-67 em 24 casos de TOQ que tiveram a descompressão como terapia cirúrgica parcial, sendo realizadas análises de fragmentos removidos durante a descompressão e os resíduos de cisto removidos na enucleação final. A comparação pré e pós em relação à expressão de Ki-67 apresentou pouca diferença, não havendo significância estatística. Estudos avaliando os efeitos teciduais da descompressão por meio de imuno-histoquímica ainda são escassos na literatura, não havendo sido previamente realizados em amostras de CP. 18

30 3 JUSTIFICATIVA CP refratários ao tratamento endodôntico convencional ou de grandes dimensões são habitualmente tratados por meio de enucleação ou curetagem cirúrgica. Estes procedimentos, entretanto, podem causar considerável morbidade aos pacientes e a descompressão tem sido indicada como opção de manejo em alguns casos, em virtude de suas características conservadoras. A despeito do sucesso clínico, pouco se conhece acerca dos fenômenos imunoinflamatórios e de reparo tecidual pelos quais passam os tecidos componentes do CP durante este processo. 19

31 4 HIPÓTESE Espera-se encontrar menor expressão de fatores pró-inflamatórios e maior expressão de fatores associados ao reparo tecidual em amostras de CP submetidos a descompressão em comparação com as amostras teciduais prédescompressão. 20

32 5 OBJETIVO Comparar a expressão imuno-histoquímica de marcadores próinflamatórios e de reparo tecidual em CP antes e após o procedimento de descompressão cirúrgica. 21

33 6 MATERIAIS E MÉTODOS A amostra foi composta por 9 CP submetidos a procedimentos de descompressão, realizada como forma parcial de tratamento, divididos em dois grupos de análise: um composto pelos fragmentos removidos durante a realização da descompressão e outro com as peças cirúrgicas completas após a enucleação cirúrgica dos respectivos CP. Todos os 9 casos apresentavam tratamento endodôntico satisfatório realizados pelo mesmo profissional. As informações clínicas (localização da lesão, presença de alterações clínicas e presença de sintomas), demográficas (idade, sexo e cor da pele dos pacientes), radiográficas e tomográficas (tamanho e volume da lesão, delimitação das bordas, relação com dentes e estruturas adjacentes, rompimento de corticais) de todos os casos foram obtidas a partir dos registros laboratoriais vinculados aos espécimes e pelas fichas clínicas dos pacientes. Por ser um estudo retrospectivo, todas as lâminas histológicas e os blocos de parafina utilizados foram provenientes do Laboratório de Patologia Bucal da Universidade Estácio de Sá (localizado na Av. Alfredo Baltazar da Silveira, 580 cobertura, Recreio dos Bandeirantes, Rio de Janeiro/RJ, Brasil). Todos os casos incluídos no estudo foram submetidos ao tratamento cirúrgico pelo mesmo profissional, seguindo a mesma técnica cirúrgica, e todos os espécimes obtidos foram acondicionados em formol tamponado a 10% em frascos adequados para submissão ao laboratório. Realizou-se a técnica de descompressão fazendo uso de anestesia local, incisão com lâmina de bisturi, osteotomia até acessar a cavidade cística e colocação de um dispositivo para 22

34 manter a abertura da janela óssea, que tinha tamanho variável de acordo com a localização anatômica e dimensões da cavidade cística. O tempo de reabertura foi estabelecido individualmente de acordo com o tamanho da lesão, a resposta ao tratamento e o envolvimento de estruturas anatômicas nobres. A enucleação cirúrgica final foi realizada segundo o mesmo protocolo em todos os casos: anestesia local, realização de um retalho intra-sulcular com apenas uma relaxante, descolamento muco-periosteal, osteotomia, curetagem completa da lesão residual, apicectomia, retro-peparo e retro-obturação utilizando agregado trióxido mineral (MTA). Nenhum dos pacientes incluídos no estudo apresentou intercorrências pós-cirúrgicas no período de observação, tais como infecções secundárias, fraturas patológicas, parestesia ou fechamento da abertura da descompressão. Todos os pacientes eram sistemicamente saudáveis, não relatando na história médica pregressa e atual doenças relevantes, e não estavam fazendo uso de anti-inflamatórios não esteroidais ou drogas imunosupressoras. Todos os casos foram previamente analisados por meio de radiografias convencionais (panorâmicas e periapicais) e tomografias computadorizadas obtidas pela técnica volumétrica (cone-beam) no momento inicial e no momento préenucleação cirúrgica. Foram mensurados os volumes tomográficos das lesões pré e pós descompressão, multiplicando as medidas disto-mesial (comprimento), apico-incisal (altura) e vestíbulo-lingual (profundidade) e obtendo resultado em mm³. Posteriormente foram calculados os percentuais de redução do volume destas lesões durante o período de descompressão. 23

35 A partir dos blocos de parafina foram realizados cortes de 5 µm, que foram corados em hematoxilina e eosina para posterior análise histológica utilizando um microscópio óptico de luz contendo uma câmera digital acoplada (Microscópico Leica, modelo DM500, Alemanha). Posteriormente, para os ensaios imuno-histoquímicos, foram realizados cortes 3 µm a partir dos blocos de parafina. Os cortes foram dispostos em lâminas previamente sinalizadas com 3-aminopropil-trietoxi-silano (Sigma, ST. Louis, MO, EUA) e a desparafinização foi feita por meio de dois banhos no xilol por 10 minutos cada sob temperatura ambiente, sendo realizada posterior hidratação em soluções com concentração decrescente de etanol (100%, 90%, 70% e 50%), seguida por lavagem abundante em água corrente. A recuperação antigênica foi realizada inserindo-se as lâminas em um berço de vidro, que foi imerso em um recipiente com solução tampão citrato a 10mM (ph 6,0) e levado ao microondas (Panasonic modelo NN7809BH, 850W) em potência máxima com duração de 12 minutos. Em seguida, as lâminas foram resfriadas em temperatura ambiente e foi utilizado o peróxido de hidrogênio a 3% para inativação da peroxidase endógena, com 5 banhos de 5 minutos cada. Após a inativação da peroxidase, as lâminas foram lavadas em água corrente e mergulhadas em leite desnatado durante 5 minutos, seguida pela imersão em solução salina tamponada com fosfato (PBS). A técnica seguiu com a incubação dos anticorpos primários, que foram diluídos em PBS com 1% de albumina sérica bovina (Sigma, ST. Louis, MO, EUA) e tiveram suas diluições variando de acordo com as indicações e padronizações do laboratório de imuno-histoquímica da Universidade Estácio 24

36 de Sá, sendo levados posteriormente a câmara úmida por um período de 16 horas e temperatura de 4 C. Foram realizados controles positivos (tecidos sabidamente reativos) e negativos (omissão do anticorpo primário) em todas as reações. A tabela 1 mostra os anticorpos primários que foram utilizados, com suas respectivas especificidades e fabricantes. Tabela 1. Anticorpos primários utilizados no estudo com seus respectivos clones, fabricantes e diluições. Anticorpos primários Clone Fabricante Diluição IL-1 β Policlonal Santa Cruz Biotechnology 1:100 TNF α 2C8 Santa Cruz Biotechnology 1:50 TGF β 1 Policlonal Santa Cruz Biotechnology 1:500 MMP 9 Policlonal Dako 1:500 Ki-67 MIB-1 Dako 1:100 EGFR EGFR.25 Novocastra 1:500 Após o período de 16 horas, as lâminas foram lavadas em 3 banhos de PBS e posteriormente incubadas com o anticorpo secundário (LSAB, Dako, Carpinteria, CA, EUA) por 30 minutos à 37 C. Dando sequência, as lâminas passaram por três banhos de PBS e foram expostas ao sistema estreptavidinabiotina-peroxidase (LSAB, Dako, Carpinteria, CA, EUA) por um período de 30 minutos a 37 o C. Em seguida, após três lavagens com PBS, as reações foram evidenciadas com solução de tetracloreto de 3,3 diaminobenzidina (Dako, Carpinteria, CA, EUA) por 5 minutos a temperatura ambiente. Para finalizar o 25

37 preparo, os cortes foram lavados em água corrente, contra corados com hematoxilina de Carazzi e montados com Entelan e lamínulas. Todas as lâminas provenientes das reações imuno-histoquímicas de todos os casos foram avaliadas sob microscopia óptica e a marcação foi categorizada, segundo a intensidade da marcação, em negativa, focal/fraca e moderada/intensa, descrevendo adicionalmente em quais tipos celulares o marcador foi encontrado, com exceção do Ki-67, que foi contabilizado de maneira percentual levando-se em consideração a quantidade de núcleos epiteliais positivos em relação ao número total de núcleos de células epiteliais em 2 campos de grande aumento (400x), obtendo-se a média. Todas as lâminas foram analisadas por dois avaliadores e os casos nos quais existiu discordância o resultado final foi decidido após discussão em conjunto. As informações clínicas, demográficas, radiográficas, tomográficas, histológicas e imuno-histoquímicas foram tabuladas e analisadas de forma descritiva e comparativa, buscando avaliar a importância do procedimento de descompressão na expressão dos marcadores pró-inflamatórios e de reparo tecidual. O estudo foi submetido a apreciação do Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Estácio de Sá, tendo sido aprovado sob o parecer número de 24 de setembro de 2015 (ANEXO). 26

38 7 RESULTADOS Dos 9 pacientes incluídos no estudo, 5 eram do sexo masculino e 4 do sexo feminino, com idade média de 39,2 anos, com variação de 15 a 68 anos. Quanto à etnia, 2 pacientes (22%) eram melanodermas e 7 (78%) eram feodermas. Seis pacientes (67%) relataram a presença de sintomas, incluindo dor, edema, flutuação, mobilidade ou aumento de volume), associados aos CP. Todos os casos estavam situados na maxila anterior e apresentavam sinais clínicos e/ou tomográficos de abaulamento e rompimento das corticais. O tempo médio de descompressão foi de 7,8 meses (Tabela 2). Tabela 2. Dados demográficos e clínicos da amostra. Caso Sexo Idade Cor da pele Sintomas Localização Tempo de descompressão 1 F 56 Feoderma SIM Maxila anterior 8 2 F 45 Feoderma NÃO Maxila anterior 7 3 M 16 Melanoderma SIM Maxila anterior 9 4 M 49 Melanoderma NÃO Maxila anterior 7 5 F 36 Feoderma SIM Maxila anterior 10 6 F 15 Feoderma SIM Maxila anterior 6 7 M 68 Feoderma SIM Maxila anterior 9 8 M 34 Feoderma NÃO Maxila anterior 7 9 M 34 Feoderma SIM Maxila anterior 7 27

39 A média de volume inicial dos CP obtida por meio dos exames tomográficos foi de 7.845,5 mm³, variando de e mm³. Após a descompressão a média do volume tomográfico dos CP foi de 2.298,6 mm 3, variando de 720 a mm 3. O percentual médio de redução do volume tomográfico foi de 54%, com menor redução de volume no caso 6 (10%) e maior redução no caso 3 (81%) (Tabela 3). Tabela 3. Dados referentes ao tamanho e ao volume tomográfico, percentual de redução tomográfica dos CP e dentes associados aos CP nos casos estudados. Caso Espécime Tamanho ** Volume *** % **** Dentes associados Inicial 13 X 11 X PD * 10 X 9 X Inicial 21 X 13 X ,3 PD 18 X 12 X Inicial 40 X 29 X PD 22 X 20 X Inicial 21 X 13 X PD 17 X 10 X Inicial 22 X 16 X ,5 PD 16 X 09 X Inicial 14 X 10 X PD 14 X 9 X Inicial 33 X 20 X ,4 PD 20 X 10 X Inicial 29 X 15 X ,8 PD 20 X 10 X Inicial 20 X 15 X PD 12 X 13 X * PD pós-descompressão; ** Em milímetros; *** em mm 3 ; **** percentual de redução do volume tomográfico da lesão pós-descompressão. 28

40 As figuras 1 a 2 mostram imagens tomográficas em cortes panorâmicos (figura 1) e axiais (figura 2) do caso 8. A figura 3 mostra a imagem tomográficas em corte panorâmico do caso 5. Figura 1. Vista panorâmica de tomografia computadorizada cone beam do caso 3, mostrando em (A) a imagem inicial e em (B) a imagem pós-descompressão, com redução de 81% do volume do CP após 9 meses de descompressão. 29

41 Figura 2. Vista axial de tomografia computadorizada cone beam do caso 8, mostrando em (A) a imagem inicial e em (B) a imagem pós-descompressão. 30

42 Figura 3. Vista panorâmica de tomografia computadorizada cone beam do caso 5, mostrando em (A) a imagem inicial e em (B) a imagem pós-descompressão, com redução de 68,5% do volume do CP após 10 meses de descompressão. A análise da expressão imuno-histoquímica dos marcadores analisados mostrou que apenas um espécime de descompressão e três espécimes cirúrgicos finais foram focalmente positivos para TNFα, sendo todos os demais negativos. A expressão de IL1β foi marcante em todos os espécimes, sendo negativa apenas em um fragmento oriundo de descompressão (Figura 4). A expressão de TGFβ1 também foi marcante em todos os espécimes, sendo 31

43 negativa apenas em um fragmento oriundo de descompressão e em um espécime cirúrgico final de enucleação de CP (Figura 5). A expressão de MMP- 9 esteve presente em todos os espécimes, à exceção de apenas um fragmento oriundo de descompressão (Figura 6). Já a expressão de EGFR, embora tenha se mostrado focal em alguns casos, também foi encontrada em todos os casos, à exceção de um espécime oriundo da remoção final de um CP (Figura 7). A imunoexpressão de Ki-67 mostrou-se semelhante em todos os espécimes, sempre revelando índice de proliferação celular abaixo de 1% (Figura 8). Não foi observado padrão de imunoexpressão distinto dos marcadores avaliados quando foram comparados os fragmentos oriundos da descompressão e os fragmentos oriundos da enucleação final do CP (Tabela 4). Figura 4: Expressão de IL1β no revestimento epitelial e nas células inflamatórias de um CP antes (A, Imunoperoxidase 20x) e depois (B, Imunoperoxidase 20x) da descompressão. 32

44 Figura 5: Expressão de TGFβ1 na cápsula de tecido conjuntivo fibroso de um CP antes (A, Imunoperoxidase 20x) e depois (B, Imunoperoxidase 20x) da descompressão. Figura 6: Expressão de MMP9 na cápsula de tecido conjuntivo fibroso de um CP antes (A, Imunoperoxidase 20x) e depois (B, Imunoperoxidase 20x) da descompressão. 33

45 Figura 7: Expressão de EGFR no revestimento epitelial de um CP antes (A, Imunoperoxidase 20x) e depois (B, Imunoperoxidase 20x) da descompressão. Figura 8: Expressão de Ki-67 em menos de 1% das células epiteliais do revestimento de um CP antes (A, Imunoperoxidase 20x) e depois (B, Imunoperoxidase 20x) da descompressão (detalhe das células positivas nos boxes). 34

46 Tabela 4. Resultados da imunoexpressão dos marcadores avaliados no estudo nos fragmentos de descompressão e da enucleação final dos cistos perirradiculares. Caso Espécime TNFα IL1β TGFβ1 MMP9 EGFR KI Inicial < 1% PD * - Foc < 1% Inicial Foc ** < 1% PD Foc + < 1% Inicial Foc < 1% PD Foc Foc < 1% Inicial Foc Foc < 1% PD foc < 1% Inicial - + Foc - - < 1% PD < 1% Inicial - + Foc + + < 1% PD < 1% Inicial < 1% PD Foc < 1% Inicial < 1% PD < 1% Inicial Foc < 1% PD Foc Foc < 1% * PD pós-descompressão; ** Foc focal. 35

47 8 DISCUSSÃO Embora a literatura sustente a utilidade da descompressão como procedimento adjuvante no manejo cirúrgico de CP extensos (GAO et al., 2014; ALLON et al., 2015; ULOOPI et al., 2015), pouco se conhece sobre os efeitos que este procedimento produz nos tecidos. Supostamente, a descompressão teria como princípio básico a diminuição da pressão intracística, que viria à favorecer o reparo ósseo e a diminuição do quadro inflamatório. Desta forma, os estudos imuno-histoquímicos podem ser úteis na identificação de fenômenos celulares e moleculares envolvidos na resposta inflamatória e no reparo tecidual destas lesões. Como demonstrado pela revisão da literatura, não existem estudos na literatura que façam a comparação dos achados histológicos e imuno-histoquímicas antes e após a terapia de descompressão cirúrgica em casos de CP. Alguns estudos já foram realizados utilizando esta metodologia para avaliar a resposta tecidual frente à descompressão cirúrgica em TOQ, utilizando apenas um marcador imuno-histoquímico por estudo (IL-1α, Ki-67 ou citoqueratina 10, por exemplo), e mostrando poucos resultados estatisticamente significativos (NAKAMURA et al., 2002; AUGUST et al., 2003; SUYAMA et al., 2008). A IL-1β é um importante mediador inflamatório envolvido nas atividades de quimiotaxia, estando intimamente ligada também com a atividade osteolítica desempenhada por osteoclastos, já que atua estimulando células hematopoiéticas precursoras de osteoclastos. Tem importante atividade também sobre a proliferação epitelial e acredita-se que exista relação direta da 36

48 presença do IL-1β na patogênese das LP e no crescimento e desenvolvimento dos CP (SIQUEIRA-JÚNIOR & SABÓIA-DANTAS, 2000; SIQUEIRA et al., 2010). A expressão desta IL foi encontrada na grande maioria das amostras, tanto antes como depois da terapia de descompressão. Mesmo diante do procedimento cirúrgico com objetivo de redução da pressão intracística, ainda existe atividade inflamatória presente nos tecidos, sendo possivelmente a explicação para tal achado imuno-histoquímico. GUNRAJ (1990), ELLIS (2005) e ANAVI et al. (2011) apontam entre as principais desvantagens da técnica de descompressão é o risco aumentado de infecção secundária na área operada. E mesmo diante de ausência de sinais clínicos sugestivos de infecção, podem haver irritantes locais nos tecidos, levados à cavidade através da abertura cirúrgica, que continuem a induzir um quadro inflamatório. O TNF-α é um mediador relevante nas etapas da diapedese, tendo em vista que estimula a expressão de moléculas de adesão endoteliais. Além disso, é um importante mediador envolvido na reabsorção óssea, tanto pela atividade estimuladora direta de osteoclastos como pela indução da liberação de outros mediadores (IL-1 e IL-6) envolvidos na osteoclastogênese (SIQUEIRA-JÚNIOR & SABÓIA-DANTAS, 2000; AGGARWAL, 2003; SIQUEIRA et al., 2010). Os resultados encontrados neste estudo não sustentam a participação do TNF-α como principal citocina envolvida na reabsorção óssea associada ao crescimento dos CP, em contraste com outros estudos da literatura (JURISIC et al., 2008; TEIXEIRA-SALUM et al., 2010). A MMP-9 é uma metaloproteinase da matriz envolvida na clivagem da elastina, estando diretamente ligada na destruição de fibras colágenas e 37

49 consequentemente, na degradação de tecidos conjuntivos. Tem atuação comprovada na patogênese das LP e representa um importante mediador envolvido na destruição tecidual encontrada nos CP, sendo expressa principalmente pelas células do epitélio que reveste a cavidade cística e na cápsula de tecido conjuntivo que envolve estas lesões (SIQUEIRA-JÚNIOR & SABÓIA-DANTAS, 2000; SILVEIRA et al., 2007; HENRIQUES et al., 2011). Os resultados encontrados no presente estudo reforçam a importância da expressão de MMP9 no epitélio e no tecido conjuntivo dos CP, à semelhança dos resultados encontrados em outros estudos (ANDRADE-SANTOS et al., 2011; HENRIQUES et al., 2011). Acreditamos que não houve diferença na imunoexpressão de MMP9 nas amostras pré e pós descompressão em nosso estudo, provavelmente pela persistência do estímulo inflamatório nos CP mesmo pós-descompressão. O EGFR é o receptor do EGF e tem comprovada relação com a atividade proliferativa das células do epitélio dos cistos odontogênicos. Se localiza de maneira estratégica na porção externa ou interna da membrana plasmática de células com capacidade mitótica, havendo relação entre este posicionamento do receptor e a capacidade proliferativa (HERBST & SHIN, 2002; HERBST, 2004; SERGINA & MOASSER, 2007; GULKESEN et al., 2011). No presente estudo, 8 das 9 amostras pré descompressão apresentaram imunoexpressão de EGFR, resultados semelhantes aos encontrados por GONÇALVES et al. (2012). As análises dos fragmentos pós descompressão também apresentaram o mesmo resultado percentual de marcação positiva, achado provavelmente relacionado com a manutenção do 38

50 estímulo a expressão deste fator de crescimento em virtude da persistência de um infiltrado inflamatório nos CP mesmo com a abertura cirúrgica. O KI-67 é um marcador de proliferação celular expresso nas células do epitélio cístico que se encontram em atividade proliferativa, principalmente nas fases G2 e M da interfase. Pelo fato da patogênese do CP envolver proliferação de células epiteliais, este anticorpo se torna importante no estudo imuno-histoquímico destas lesões, auxiliando a compreensão de seus mecanismos evolutivos (SLOOTWEG, 1995; MACLUSKEY et al., 1999; MENDES et al., 2011). Nadalin et al. (2011) encontraram imunomarcação de Ki-67 na maioria dos CP avaliados e, embora nossos resultados também tenham encontrado imunomarcação para este antígeno, a mesma foi encontrada em menos de 1% das células do revestimento epitelial dos cistos, tanto pré quanto pós-descompressão. NAKAMURA et al. (2002), avaliando casos de TOQ, também não encontraram diferenças estatisticamente significativas em amostras pré e pós-descompressão. Possivelmente o procedimento de descompressão e a diminuição da pressão intra-cística não interfiram no potencial proliferativo intrínseco dos TOQ e dos CP. De forma geral, um dos objetivos da terapia endodôntica, seja convencional ou com auxílio de técnicas cirúrgicas, é devolver a saúde aos tecidos perirradiculares, e esta condição depende de mecanismos de reparo tecidual. O reparo é alcançado quando há diminuição dos estímulos nocivos aos tecidos e envolve série de células e mediadores químicos que participam de forma ativa do processo de formação tecidual. Dentre estes mediadores, destaca-se a participação do TGF-β, que é encontrado principalmente no tecido 39

51 ósseo e no tecido conjuntivo e tem papel essencial na estimulação dos osteoblastos, contribuindo assim com a neoformação óssea, sendo importante nos processos envolvidos na patogênese e na recuperação dos tecidos afetados pelos CP (HEINEMEIER et al., 2007; SIQUEIRA et al., 2010; TACHI et al., 2011). Os resultados do presente estudo mostraram imunoexpressão de TGF-β1 em quase todos os casos, tanto em espécimes pré quanto pósdescompressão, reforçando sua importância junto à patogênese do CP, como anteriormente demonstrado por outros autores (FUKADA et al., 2009; TEIXEIRA-SALUM et al., 2010; MORAES et al., 2014). 40

52 9 CONCLUSÃO O perfil imuno-histoquímico da expressão de TNFα, IL1β, TGFβ1, MMP9 e EGFR e o índice de proliferação celular mensurado pela expressão de Ki-67 é semelhante em espécimes teciduais derivados de CP pré e pósdescompressão cirúrgica. 41

53 10 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S (2012). Cellular and molecular immunology. 7º ed. Philadelphia: Saunders/ Elsevier. Agaram NP, Collins BM, Barnes L, Lomago D, Aldeeb D, Swalsky P (2004). Molecular analysis to demonstrate that odontogenic keratocysts are neoplastic. Arch Pathol Lab Med 128: Aggarwal BB (2003). Signaling pathways of the TNF superfamily: a doubleedged sword. Nat Rev Immunol 3: Allon DM, Allon I, Anavi Y, Kaplan I, Chaushu G (2015). Decompression as a treatment of odontogenic cystic lesions in children. J Oral Maxillofac Surg 73: Anavi Y, Gal G, Miron H, Calderon S, Allon DM (2011). Decompression of odontogenic cystic lesions: clinical long-term study of 73 cases. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 112: Andrade-Santos PP, Aquino ARL, Oliveira AB, Almeida RF, Galvão HC, Souza LB (2011). Immunohistochemical expression of nuclear factor κb, matrix metalloproteinase 9, and endoglin (CD105) in odontogenic keratocysts, dentigerous cysts, and radicular cysts. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 12: August M, Faquin WC. Troulis MJ, Kaban LB (2003). Dedifferentiation of odontogenic keratocyst epithelium after cyst decompression. J Oral Maxillofac Surg 61: Barton GM, Kagan JC (2009). A cell biological view of Toll-like receptor function: regulation through compartimentalization. Nat Rev Immunol 9: Becconsall-Ryan K, Tong D, Love RM (2010). Radiolucent inflammatory jaw lesions: a twenty-year analysis. Int Endod J 43: Bodner L, Woldenberg Y, Bar-Ziv J (2003). Radiographic features of large cystic lesions of the jaws in children. Pediatr Radiol 33: 3-6. Brave D, Madhusudan AS, Gayathri RVR (2011). Radicular cyst of anterior Maxilla. Int J Dent Clinics 3: Brinckerhoff CE, Matrisian LM (2002). Matrix metalloproteinases: a tail of a frog that became a prince. Nat Rev Mol Cell Biol 3:

54 Delbem AC, Cunha RF, Vieira AE, Pugliesi DM (2003). Conservative treatment of a radicular cyst in a 5-year-old child: a case report. Int J Paediatr Dent 13: Ellis E (2005). Tratamento Cirúrgico das Lesões Patológicas Orais. In: Peterson, JL, Ellis E, Hupp JR, Tucker, MR. Cirurgia Oral e Maxilo-Facial Contemporanea. 4º ed. Rio de Janeiro, RJ: Elsevier, Fukada SY, Silva TA, Garlet GP, Rosa AL, da Silva JS, Cunha FQ (2009). Factors involved in the T helper type 1 and type 2 cell commitment and osteoclast regulation in inflammatory apical diseases. Oral Microbiol Immunol 24: Gao L, Wang XL, Li SM, Liu CY, Chen C, Li JW, Yan XJ, Zhang J, Ren WH, Zhi KQ (2014). Decompression as a treatment for odontogenic cystic lesions of the jaw. J Oral Maxillofac Surg 72: Goetzl, EJ, Banda MJ, Leppert D (1996). Matrix metalloproteinases in immunity. J Immunol 156: 1. Gonçalves CK, Fregnani ER, Leon JE, Silva-Sousa YT, Perez DE (2012). Immunohistochemical expression of p63, epidermal growth factor receptor (EGFR) and notch-1 inradicular cysts, dentigerous cysts and keratocystic odontogenic tumors. Braz Dent J 23: Gulkesen KH, Kilicarslan B, Altunbas HÁ, Karpuzoglu G (2001). EGRF and p53 and proliferative activity in parathyroid adenomas: an immunohistochemical study. APMIS 109: Gunraj MN (1990). Decompression of a large periapical lesion utilizing an improved drainage device. J Endod 16: Heinemeier KM, Olesen JL, Haddad F, Langberg H, Kjaer M, Baldwin KM, Schjerling P (2007). Expression of collagen and related growth factors in rat tendon and skeletal muscle in response to specific contraction types. J Physiol 582: Henriques ACG, Vasconcelos MG, Galvao HC, de Souza LB, Freitas RD (2011). Comparative analysis of the immunohistochemical expression of collagen IV, MMP-9, and TIMP-2 in odontogenic cysts and tumors. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 112: Herbst RS (2004). Review of epidermal growth fator receptor biology. Int J Radiat Oncol Biol Phys 59: Herbst RS, Shin DM (2002). Monoclonal antibodies to target epidermal growth fator receptor-positive tumors: a new paradigma for cancer therapy. Cancer 94:

55 Johnson NR, Gannon OM, Savage NW, Batstone MD (2014). Frequency of odontogenic cysts and tumors: a systematic review. J Investig Clin Dent 5: Jurisic V, Terzic T, Colic S, Jurisic M (2008). The concentration of TNF α correlate with number of inflammatory cells and degree of vascularization in radicular cysts. Oral Dis 14: Kadam NS, Ataide Ide N, Raghava P, Fernandes M, Hede R (2014). Management of large radicular cyst by conservative surgical approach: a case report. J Clin Diagn Res 8: Kuc I, Peters E, Pan J (2000). Comparison of clinical and histologic diagnoses in periapical lesions. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 89: Kumamoto H, Yamauchi K, Yoshida M, Ooya K (2003). Immunohistochemical detection of matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) in ameloblastomas. J Oral Pathol Med 32: Lader CS, Flanagan AM (1998). Prostaglandin E2, interleukin 1a, and tumor necrosis factor-a increase human osteoclast formation and bone resorption in vitro. Endocrinology 139: Li TJ, Browne RM, Matthews JB (1997). Immunocytochemical expression of growth factors by odontogenic jaw cysts. Mol Pathol 50: Liapatas S, Nakou M, Rontogianni D (2003). Inflammatory infiltrate of chronic periradicular lesions: an immunohistochemical study. Int Endod J 36: Lustig JP, Schwartz-Arad D, Shapira A (1999). Odontogenic cysts related to pulpotomized primary molars: clinical features and treatment outcome. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 87: Macluskey M, Ogden GR, Green M, Chisholm DM, Schor SL, Schor AM (1999). The association between epitelial proliferation and disease progression in the oral mucosa. Oral Oncol 35: Marker P, Brøndum N, Clausen PP, Bastian HL (1996). Treatment of large odontogenic keratocysts by decompression and later cystectomy: a long-term follow-up and a histologic study of 23 cases. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 82: Martin AS (2007). Conventional endodontic therapy of upper central incisor combined with cyst decompression: a case report. J Endod 33: Martins CA, Rivero ER, Dufloth RM, Figueiredo CP, Vieira DS (2011). Immunohistochemical detection of factors related to cellular proliferation and apoptosis in radicular and dentigerous cysts. J Endod 37:

56 Martins-Filho PRS, Brasileiro BF, Piva MR, Silva LCF, Reinheimer DM, Marzola C (2009). Cisto radicular na maxila relato de caso clínico cirúrgico. Rev ATO 4: Márton IJ, Kiss C (2000). Protective and destructive immune reactions in apical periodontitis. Oral Microbiol Immunol 15: Medzhitov R (2008). Origin and physiological roles of inflammatory. Nature 454: Meghji S, Qureshi W, Henderson B, Harris M (1996). The role of endotoxin and cytokines in the pathogenesis of odontogenic cysts. Arch Oral Biol 41: Mendes RA, Carvalho JFC, Van der Waal I (2011). A comparative immunohistochemical analysis of COX-2, p53, and Ki-67 expression in keratocystic odontogenic tumors. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 111: Moraes M, Neto PCR, Matos FR, Lopes MLDS, Azevedo PRM, Costa ALP (2014). Immunoexpression of transforming growth factor beta and interferon gamma in radicular and dentigerous cysts. J Endod 40: Moreira PR, Santos DF, Martins RD, Gomez RS (2000). CD57+ cells in radicular cyst. Int Endod J 33: Murphy WK, Kaugars GE, Collett WK, Dodds RN (1991). Healing of periapical radiolucencies after nonsurgical endodontic therapy. Oral Surg Oral Med Oral Pathol 71: Nadalin MR, Fregnani ER, Silva-Sousa YT, Perez DE (2011). Syndecan-1 (CD138) and ki-67 expression in odontogenic cystic lesions. Braz Dent J. 22: Nair PNR (1998). Review: New perspectives on radicular cysts: do they heal? Int Endod J 31: Nair PNR, Sjrgren U, Kahnberg KE, Krey G, Sundqvist G (1990). Intraradicular bacteria and fungi in root-filled, asymptomatic human teeth with therapyresistant periapical lesions: a longterm light and electron microscopic follow-up study. J Endod 16: Nakamura N, Mitsuyasu T, Mitsuyasu Y, Taketomi T, Higuchi Y, Ohishi M (2002). Marsupialization for odontogenic keratocysts: long-term follow-up analysis of the effects and changes in growth characteristics. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 94: Nawaz MS, Yazdanie N, Faheemuddin M (2011). Rehabilitation of a cystic mixed dentition mandible following marsupialization with a multipurpose acrylic splint acting as a space maintainer and an obturator. J Ayub Med Coll Abbottabad 23:

57 Neaverth EJ, Burg HA (1982). Decompression of large periapical cystic lesions. J Endod 8: Olayioye MA, Neve RM, Lane HA, Hynes NE (2000). The ErbB signaling network: receptor heterodimerization in development and cancer. EMBO J 19: Piattelli A, Rubini C, Fioroni M, Favero L, Strocchi R (2004). Expression of transforming growth factor-beta 1 (TGF-beta 1) in odontogenic cysts. Int Endod J 37: Pozzer l, Jaimes M, Netto HDMC, Olate S, Barbosa JRA (2009). Cistos odontogênicos em crianças: análise da descompressão cirúrgica em dois casos. Rev Cir Traumatol Buco-Maxilo-fac 9: Ramakrishna Y, Verma D (2006). Radicular cyst associated with a deciduous molar: A case report with unusual clinical presentation. J Indian Soc Pedod Prev Dent 24: Rees JS (1997). Conservative management of a large maxillary cyst. Int Endod J 30: Ricucci D, Pascon EA, Ford TR, Langeland K (2006). Epithelium and bacteria in periapical lesions. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 101: Sakkas N, Schoen R, Schulze D, Otten JE, Schmelzeisen R (2007). Obturator after marsupialization of a recurrence of a radicular cyst of the mandible. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 103: Samuels HS (1965). Marsupialization: effective management of large maxillary cysts: report of a case. Oral Surg Oral Med Oral Pathol 20: Santos LCS, Bôas DSV, Oliveira GQV, Ramos EAG, Gurgel CAS, Santos JN (2011). Histopathological study of radicular cysts diagnosed in a Brazilian population. Braz Dent J 22: Santos LCS, Ramos EAG, Meira TM, Fiqueiredo, CRLV, Santos JN (2006) Etiopatogenia do cisto radicular: Parte I R Ci Méd Biol 5: Sergina NV, Moasser MM (2007). The HER Family and cancer: emerging molecular mechanisms and therapeutic targets. Trends Mol Med 13: Silveira EJD, Piva MR, Galvão HC, Souza LB, Freitas RA (2007). Role of matrix metalloproteinases in the etiopathogeny of odontogenic cysts. J Bras Patol Med Lab 43: Siqueira Jr JF, Rôças IN, Lopes HP (2010). Patologia pulpar e perirradicular. In: Lopes HP, Siqueira Jr JF. Endodontia: biologia e técnica. 3ºed. Rio de Janeiro, RJ: Guanabara Koogan,

58 Siqueira Jr JF, Rôças IN, Lopes HP, Alves FRF, Oliveira JCM, Armada L, Prozenzano JC (2012). Princípios biológicos do tratamento endodôntico de dentes com polpa necrosada e lesão perirradicular. Rev Bras Odontol 69: Siqueira Jr JF, Rôças IN, Ricucci D, Hulsmann M (2014). Causes and management of post-treatment apical periodontitis. Br Dent J 216: Siqueira-Júnior JF, Sabóia-Dantas CJ (2000). Mecanismos celulares e moleculares da inflamação. 1ª ed. Rio de Janeiro: MEDSI Editora Médica Científica p Slootweg PJ (1995). p53 protein and Ki-67 reactivity in epithelial odontogenic lesions: an immunohistochemical study. J Oral Pathol Med 24: Sun KT, Chen MY, Chiang HH, Tsai HH (2009). Treatment of large jaw bone cysts in children. J Dent Child 76: Suyama Y, Kubota Y, Ninomiya T, Shirasuma K (2008). Immunohistochemical analysis of interleukin-1 alpha, its type I receptor and antagonist in keratocyst odontogenic tumors. J Oral Pathol Med 37: Tachi K, Takami M, Sato H, Mochizuki A, Zhao B, Miyamoto Y, Tsukasaki H, Inoue T, Shintani S, Koike T et al. (2011). Enhancement of bone morphogenetic protein-2- induced ectopic bone formation by transforming growth factor-beta1. Tissue Eng Part A 17: Takeuchi O, Akira S (2010) Pattern recognition receptors and inflammation. Cell 140: Tandri S (2010). Management of infected radicular cyst by surgical decompression. J Conserv Dent. 13: Tanikawa Y, Bawden JW (1999). The immunohistochemical localization of phospholipase cγ and the epidermal growth-factor, platelet derived growthfactor and fibroblast growth-factor receptors in the cells of the rat molar enamel organ during early amelogenesis. Arch Oral Biol 44: Teixeira-Salum TB, Rodrigues DB, Gervásio AM, Souza CJ, Rodrigues V Jr, Loyola AM (2010). Distinct Th1, Th2 and Treg cytokines balance in chronic periapical granulomas and radicular cysts. J Oral Pathol Med 39: Torres-Lagares D, Segura-Egea JJ, Rodríguez-Caballero A, Llamas-Carreras JM, Gutiérrez-Pérez JL (2011). Treatment of a large maxillary cyst with marsupialization, decompression, surgical endodontic therapy and enucleation. J Can Dent Assoc 77: b87. Tyler LW, Matossian K, Todd R, Gallagher GT, White RR, Wong DT (1999). Eosinophil-derived transforming growth factors (TGF-alpha and TGF-beta 1) in human periradicular lesions. J Endod 25:

59 Uloopi KS, Shivaji RU, Vinay C; Pavitra, Shrutha SP, Chandrasekhar R (2015). Conservative management of large radicular cysts associated with non-vital primary teeth: A case series and literature review. J Indian Soc Pedod Prev Dent. 33: Wong M (1991). Surgical fenestration of large periapical lesions. J Endod 17:

60 11 ANEXOS Parecer do Comitê de Ética e Pesquisa da Universidade Estácio de Sá. 49

61 50