TÍTULO: ESTUDO IN VITRO DO POTENCIAL ANTITUMORAL DO EXTRATO DE MARSDENIA CONDURANGO EM LINHAGENS CELULARES DE ADENOCARCINOMA MAMÁRIO

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1 TÍTULO: ESTUDO IN VITRO DO POTENCIAL ANTITUMORAL DO EXTRATO DE MARSDENIA CONDURANGO EM LINHAGENS CELULARES DE ADENOCARCINOMA MAMÁRIO CATEGORIA: CONCLUÍDO ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE SUBÁREA: FARMÁCIA INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE ANHEMBI MORUMBI AUTOR(ES): DANIEL GONSALES SPINDOLA ORIENTADOR(ES): CARLOS ROCHA OLIVEIRA, CLÁUDIA BINCOLETTO TRINDADE

2 1. RESUMO A Marsdenia condurango é uma planta Sul Americana popularmente usada contra o câncer de estômago e problemas digestivos. A atividade antitumoral é relatada desde a década de 198, porém os mecanismos moleculares subjacentes continuam pouco conhecidos. Este estudo teve como objetivo avaliar sua atividade antiproliferativa/antitumoral contra duas linhagens celulares de adenocarcinoma: MCF-7 e 4T1. O extrato etanólico de Marsdenia condurango (EEMC) foi fornecido pelo Laboratório Almeida Prado, São Paulo, SP, Brasil. A viabilidade celular foi avaliada após a exposição ao EEMC durante 24 h utilizando os ensaios de azul de tripano e redução do MTT. Nos estudos de morte celular foram empregadas as técnicas de marcação com Anexina-V-FITC/PI e coloração Hoechst por citometria de fluxo e análise de microscópio de fluorescência, respectivamente. A fração do ciclo celular e a geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) foram analisadas usando iodeto propídeo (PI) e DCFDA, respectivamente, e o potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) foi avaliado em células marcadas com TMRE. O EEMC foi citotóxico para as células MCF-7 e 4T1 com o valor de IC5 de 1 ug/ml. O ensaio com PI demonstrou que o EEMC aumentou a fração sub-g1, em ambas as linhagens celulares, e a análise com Anexina V-FITC/PI evidenciou que o EEMC a 1 ug/ml induz morte celular de forma significativa em células 4T1 e em menor quantidade na linhagem MCF-7. Além disso, a coloração Hoechst revelou a presença de núcleos apoptóticos, sugerindo apoptose em ambas as linhagens. Estes eventos foram acompanhados por diminuição da produção de EROs e do ΔΨm. O EEMC induziu morte celular, principalmente por apoptose, em células MCF- 7 e 4T1, sendo a primeira mais significativa em relação à segunda. Como a linhagem MCF-7 é deficiente em caspase-3, sugerimos que outras modalidades de morte celular, além de apoptose, estão envolvidas na citotoxicidade do EEMC. 2. INTRODUÇÃO O câncer de mama é o segundo tipo mais frequente no mundo e a principal causa de morte entre as mulheres no Brasil desde a década de 197. Seu prognóstico e tratamento dependem de inúmeros fatores que, quando aplicados precocemente e de forma efetiva, reduzem a probabilidade de sua evolução para quadros mais graves (INCA, 3). Desta maneira, a pesquisa, tanto básica como 1

3 aplicada, é fundamental e deve ser estimulada, para que se encontre terapêuticas antitumorais mais eficazes e seguras. A utilização de produtos naturais como agentes anticancerosos começou com a medicina popular e, ao longo dos anos, foi se incorporando na medicina tradicional e alopática (CRAGG et al., 5). Nesta classe incluem-se os fitoterápicos, que são medicamentos obtidos a partir de plantas, empregando-se exclusivamente derivados de substâncias vegetais, os suplementos dietéticos herbáceos e as plantas medicinais, íntegras ou suas partes (FUKUMASU et al., 8). A Marsdenia condurango é uma planta medicinal sul americana da família Apocynaceae, e é utilizada na medicina popular contra o câncer de estômago e problemas digestivos como náuseas e gases intestinais (ALONSO, 7; GÜLTEKIN et al.,4). Sua atividade antitumoral é relatada desde os anos 8, mas os mecanismos moleculares subjacentes permanecem pouco conhecidos (ALONSO, 7; HAYASHI et al., 198). Em linhagens de adenocarcinoma humano (MCF-7), o processo apoptótico ocorre de maneira diferenciada, uma vez que estas células, além de possuírem caraterísticas ideais do epitélio mamário, não expressam caspase 3, contrapondo a linhagem de adenocarcinoma murinho (4T1), que inclusive mimetiza em muitos aspectos o câncer de mama humano (LIANG et al, 1) (PULASKI et al, 1) e expressa esta caspase. Portanto, estudos sobre a ação de extratos vegetais nas linhagens mamárias em questão se tornam importantes, uma vez que cada uma possui características próprias que permitem diferentes observações acerca do processo de morte celular, contribuindo para o desenvolvimento de uma nova opção antitumoral, com propriedades complementares àquelas exibidas pelos fármacos utilizados na clínica atual. 3. OBJETIVOS 3.1. Objetivo Geral Avaliar os possíveis efeitos antitumorais do extrato etanólico de Marsdenia condurango (EEMC), popularmente conhecida como condurango, através de estudos de citotoxicidade e de morte celular utilizando as linhagens celulares MCF-7 (humana) e 4T1 (murina). 2

4 3.2. Objetivos específicos Avaliar a citotoxicidade do EEMC através das técnicas de exclusão por Azul de tripano e redução do MTT a cristais de formazan; Avaliar o percentual de células nas fases do ciclo celular após tratamento com o EEMC, a fim de evidenciar taxa de células na fração Sub-G1; Avaliar as modalidades de morte celular das linhagens em questão a partir da técnica de incorporação de iodeto de propídeo/anexina/fitc; Avaliar a capacidade do extrato em neutralizar as EROs (Espécies reativas de oxigênio) geradas pela mitocôndria em condições de estresse oxidativo; Avaliar a participação da mitocôndria na indução de morte pela marcação com TMRE. 4. METODOLOGIA 4.1. Matéria-prima vegetal e produção do extrato vegetal O EEMC foi fornecido pelo Laboratório Almeida Prado, localizada no município de São Paulo-SP. O extrato é produzido dentro do mais alto padrão de qualidade, com a emissão de laudo técnico que atesta a qualidade do produto e a presença dos constituintes vegetais Linhagens celulares MCF-7 e 4T1 Neste estudo foram utilizadas duas linhagens de células tumorais, uma de adenocarcinoma mamário humana (MCF-7), e outra de adenocarcinoma mamário murino (4T1). As células foram cultivadas em incubadora de CO2 com meio RPMI- 16 suplementado com 1% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina Ensaios de viabilidade celular Método de exclusão por azul de tripano Esse método permite detectar células inviáveis, cuja membrana, por apresentar danos, permite a incorporação do corante e coram-se em azul. Assim, após incubação das células com determinadas concentrações do EEMC por 24 horas, estas foram centrifugadas e diluídas (1:1) em corante de azul de tripano, então foi realizada a contagem das células viáveis em câmara hemocitométrica utilizando microscópio óptico X Método de redução do MTT. 3

5 Para o teste do MTT, as células tumorais foram semeadas em microplacas de 96 poços na ausência ou presença do EEMC e incubadas em estufa a 37 C com 5% de CO 2. Ao final do período de incubação, foram adicionados aos poços MTT, e após mais 4 h de incubação SDS 1% (Dodecil sulfato de sódio). A quantificação da densidade óptica foi medida em leitor de ELISA. O valor de IC5 (concentração que inibe 5% da viabilidade celular) foi determinada por meio da curva dose resposta utilizando o programa estatístico GraphPadPrism 5. (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) Análise de ciclo celular por incorporação de Iodeto Propídeo Após cultivo celular com as concentrações e o período de tratamento determinados, as células foram lavadas com PBS estéril duas vezes e ressuspensas em PBS com Etanol (1:1). O sobrenadante foi então suspendido em RNAse diluído em PBS (1:) e incubado no banho-maria por 15 a minutos. Por fim, adicionouse Iodeto de Propídeo (PI) por no mínimo 3 minutos a 1 hora. Após foi lido em citômetro de fluxo. (FACS-CALIBUR BD, New Jersey, USA). Os resultados foram analisados utilizando o software FlowJo Ensaios de modalidades e vias de morte celular Análise por citometria de fluxo e marcação simultânea com Iodeto de Propídeo / Anexina Para a avaliação da morte celular induzida pelo EEMC foi utilizado o Kit de detecção de Apoptose e necrose (FITC Annexin-V Apoptosis Detection Kit II BD Pharmigen), o qual permite a detecção de apoptose (quando marcado com Anexina- V-FITC) e/ou necrose (quando marcado com Iodeto de Propídeo). Após o tratamento as células foram lavadas em PBS. Após foram incubadas com 1µL de Anexina-V FITC e 1µL de PI por 3 minutos. Em seguida, os tubos foram levados para leitura em citometro de fluxo (FACS-CALIBUR BD, New Jersey, USA). Os resultados foram analisados utilizando o software FlowJo Avaliação do potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) TMRE A técnica se baseia na utilização de um corante fluorescente específico que se liga a membrana mitocondrial de células viáveis, contudo, quando apresentarem alterações emitirá menos fluorescência. Para a realização da avaliação do ΔΨm as células encubadas com o extrato vegetal serão recolhidas em tubos de citometria 4

6 previamente identificados e centrifugados a 1.5 RPM, o pellet será ressuspenso em Rodamina e incubado por 15 minutos. A leitura será realizada em citômetro de fluxo (FACS-CALIBUR BD, New Jersey, USA). Os resultados serão analisados utilizando-se o software FlowJo Determinação dos níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) por citometria de fluxo usando DCFDA (2,7 dichlorofluorescin diacetate) Para avaliar os níveis de EROs as células tumorais serão plaqueadas em placas de 6 wells e, após 24 horas de tratamento com o extrato vegetal serão lavadas com PBS, tripsinizadas e coletadas. Após o pellet será incubado em de PBS com a sonda DCFDA por minutos a 37ºC. Em seguida, os tubos serão levados para leitura no equipamento de citometria de fluxo (FACS-CALIBUR BD, New Jersey, USA). Os resultados serão analisados utilizando o software FlowJo Análise estatística Os dados já obtidos foram analisados através do teste estatístico Análise de Variância (ANOVA) com teste a posteriori de comparação múltipla de Tukey, com significância de p<.5, para a comparação entre os grupos. Foi utilizado o Software GraphPad-Prism V DESENVOLVIMENTO Conforme mencionado anteriormente, achados moleculares sobre vias de morte celular são de grande importância no desenvolvimento de novos agentes tumorais. (ZASLAU et al., 4; RIGGS et al., 5; BRAULT et al, 5). A apoptose está presente em diversas situações fisiológicas tendo como principais características a ativação de proteases intracelulares, especialmente as caspases e fragmentação internucleossomal de DNA. Alterações em várias moléculas de superfície também permitem que a celular apoptótica seja imediatamente reconhecida e fagocitada por células adjacentes, fazendo da apoptose um mecanismo de remoção de células sem a geração de uma resposta inflamatória (EDINGER e THOMPSON, 4). Além de alterações morfológicas e da ativação de caspases, as células apoptóticas podem ainda liberar citocromo c mitocondrial, mostrando que a participação das mitocôndrias na morte celular é fundamental, pois ela age como um 5

7 eixo central de decisão de muitos tipos de respostas apoptóticas (SUN e PENG, 9). 6. RESULTADOS 6.1. Avaliação da viabilidade celular na presença do EEMC. Células das duas linhagens foram expostas por um período de 24 horas ao EEMC em diferentes concentrações (5, 1,, 3, µg/ml). Neste sentido, os resultados obtidos pelo Azul de tripano, indicaram um comportamento dosedependente. Dentre as concentrações utilizadas, a de 1 µg/ml do extrato vegetal foi a concentração que apresentou 5% de viabilidade celular em ambas as linhagens, sendo eleita a concentração de estudo para os ensaios seguintes. (Fig. 1) A B Viabilidade Celular (%) 1 8 *** Viabilidade Celular (%) 1 8 *** EtOH g/ml EtOH g/ml Figura 1: Percentual da viabilidade celular das linhagens MCF-7 (A) e 4T1 (B) tratadas com o EEMC e o veículo etanol (EtOH) por 24h, e submetidas a coloração com Azul de Tripano. GraphPad-Prism V5.. *** P<,5 (ANOVA teste a posteriori de Tukey). A B Viabilidade Celular (%) 1 8 ** *** Viabilidade Celular (%) 1 8 *** EtOH g/ml EtOH g/ml Figura 2: Percentual da viabilidade celular das linhagens MCF-7 (A) e 4T1 (B) tratadas com o EEMC e o veículo etanol (EtOH) por 24h, e submetidas a técnica de redução do MTT, evidenciando a IC5 1 µg/ml. GraphPad-Prism V5.. *** P<,5 (ANOVA teste a posteriori de Tukey). 6

8 Dando continuidade a avaliação da viabilidade celular, foi realizado o ensaio de redução do MTT. O princípio deste método descrito por Mosman (1983) consiste em medir a viabilidade celular pela atividade enzimática da succinatodesidrogenase, que resulta em cristais de formazan insolúveis na cor violeta. (MOSMANN et al., 1983; SCUDIERO et al.,1988). A partir do ensaio foram observados resultados que corroboram com o comportamento dose-dependente já obtido no ensaio com o Azul de tripano, confirmando a IC5 de 1 µg/ml. (Fig. 2) A 1 B Sub-G1 (%) ** Sub-G1 (%) ** 1 g/ml 1 g/ml Figura 3: Percentual de células MCF-7 (A) e 4T1 (B) na fração Sub-G1 do ciclo celular dos grupos controle e tratados por 24 horas com o EEMC 1µg/mL e incubados com o PI. GraphPad-Prism V5.. FlowJo ** P<,5 (ANOVA teste a posteriori de Tukey). Embasado pelos dados obtidos até então os ensaios subsequentes foram realizados com a IC5, tendo início pela análise de ciclo celular por incorporação de Iodeto Propídeo. O ensaio visa expor o percentual de células que se encontram em cada fase do ciclo celular além da fração Sub-G1, objeto de interesse do estudo, já que o aumento nessa população é indicio de processo apoptótico. O ensaio demonstrou aumento de 5% no número de células na fração Sub-G1 em ambas as linhagens. (Fig. 3) 6.2. Avaliação das modalidades de morte celular. Para avaliar o tipo de morte foi utilizada a das células tratadas por 24 horas com os extratos vegetais por citometria de fluxo e marcação simultânea com Iodeto de Propídeo / Anexina. É possível notar uma diminuição acentuada no número de células viáveis (AN-/PI-) em ambas as linhagens em relação ao seu respectivo controle, essa diminuição é ainda mais significativa na linhagem 4T1. (Fig. 4) Quanto a indução do processo apoptótico, é possível observar que a linhagem MCF-7 demonstrou um discreto, mas ainda significativo, aumento da população marcada com AN+/PI-, e um porcentual de aproximadamente 15% de 7

9 população com dupla marcação (AN+/PI+), sugerindo baixa taxa de apoptose e apoptose tardia, respectivamente. Na linhagem 4T1 a população indicativa de apoptose (AN+/PI-) expressa valor semelhante a linhagem humana, enquanto é possível observar um aumento expressivo, em relação ao mesmo controle, da população com dupla marcação (AN+/PI+) se mostrando, portanto, uma linhagem mais susceptível a ação do extrato vegetal. Além disso a linhagem murina ainda apresentou cerca de % de população marcada com AN-/PI+, sugerindo uma taxa necrose significativa em relação ao controle. (Fig. 4) A B AN- PI+ (%) AN+ PI+ (%) * AN- PI+ (%) * AN+ PI+ (%) g/ml * g/ml g/ml g/ml AN- PI- (%) 1 g/ml AN+ PI- (%) * 1 g/ml AN- PI- (%) ** 1 g/ml AN+ PI- (%) 1 g/ml Figura 4: Quantificação da morte celular: Apoptose (AN+/PI-), Apoptose tardia (AN+/PI+) e Necrose (AN-/PI+) em células MCF-7 (A) e 4T1 (B) tratadas por 24h com 1 µg/ml do EEMC e marcadas com AnexinaV-FITC/PI. GraphPad-Prism V5..** P<,5 (ANOVA teste a posteriori de Tukey). Figura 5: Histogramas representando o aumento da geração de EROs em células MCF-7 (A) e 4T1 (B); e despolarização do ΔΨm em células MCF-7 (C) e 4T1 (D). Ambos os ensaios foram realizados após exposição por 24h a 1 µg/ml do EEMC. FlowJo O EEMC foi capaz de aumentar os níveis de EROs intracelulares principalmente em linhagens 4T1 como demonstrado pela mudança da intensidade de fluorescência quando comparado ao grupo controle, sugerindo um papel oxidante do extrato sobre os efeitos de citotoxicidade. Contrapondo os ensaios anteriores, células tratadas com o EEMC e incubadas com TMRE demonstraram diminuição da 8

10 fluorescência indicando despolarização mitocondrial, entretanto essa diminuição ocorre de forma mais acentuada na linhagem MCF-7. (Fig. 5) 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS O presente estudo demonstrou a avaliação da efetividade antitumoral do extrato de Marsdenia condurango frente às linhagens de adenocarcinoma mamária murina e humana. Inicialmente, foi evidenciado através das metodologias de análise de viabilidade celular, o efeito citotóxico de diferentes concentrações do extrato em estudo. O uso da Marsdenia condurango já havia sido relata contra linhagens celulares de câncer de pulmão in vitro, corroborando com os resultados aqui encontrados, que demonstram um comportamento dose-dependente, pois quanto maior a concentração do extrato, menor foi a viabilidade celular verificada. (SIKDAR et al., 13; ALONSO, 7; HAYASHI et al., 198). O aumento da fração Sub-G1 do ciclo celular no ensaio com Iodeto Propídeo, demonstra que o extrato pode estar induzindo o processo apoptótico nas linhagens em questão a partir da concentração inibitória de 5%, a IC5 de 1 µg/ml, evidenciada por meio dos ensaios de viabilidade celular. Levando em consideração que se trata de um extrato bruto, seu mecanismo de ação pode estar relacionado com um componente específico de sua composição. Existem relatos de um glicosídeo isolado do vegetal, a condurango-glicosídeo-a (CGA), que causa uma senescência celular prematura associada a danos no DNA (Bishayee et al., 13). Ao analisarmos os dados como um todo, podemos sugerir que a linhagem 4T1 (murina) é mais susceptível ao EEMC em relação aos seus respectivos controles. No ensaio de marcação simultânea com Anexina V/FITC e PI a linhagem murina apresentou maior taxa de população marcada com AN+/PI+ em relação ao mesmo controle, sugerindo a presença de apoptose tardia após os tratamentos com o EEMC, além de uma população marcada com AN-/PI+, indicando também a presença de necrose em relação ao mesmo controle. A linhagem MCF-7 (humana) demonstrou menor taxa de apoptose (AN+/PI-), apoptose tardia (AN+/PI+) e necrose (AN-/PI+), em relação ao respectivo controle. Esse efeito pode estar relacionado à característica da linhagem tumoral, já que esta não expressa caspase 3, sugerindo uma via alternativa de morte celular. Em sintonia com os dados até então obtidos, é possível observar uma ação oxidativa por parte do EEMC sob as células em questão, de forma a aumentar a 9

11 geração de EROs intercelulares. Esses achados corroboram com estudos anteriores (ALONSO, 7; GÜLTEKIN et al.,4). No entanto, a despolarização do ΔΨm foi maior em células MCF-7, sugerindo aumento do dano mitocondrial. Como despolarização da membrana mitocondrial e ΔΨm está associada com a ativação de caspases e a linhagem em questão não é capaz de expressar caspase-3 é possível que outras vias de morte estão relacionadas com a ação do extrato. Portanto estudos futuros se fazem necessários a fim de relatar o real mecanismo de ação do extrato e a caracterização dos mecanismos de morte celular desencadeados por meio da exposição in vitro ao extrato vegetal. 8. FONTES CONSULTADAS 1- BRASIL. Instituto Nacional de Câncer. Estimativa da incidência e mortalidade por câncer no Brasil 3. Rio de Janeiro: INCA; 3 2- CHABNER BA, ROBERTS TG, JR. Timeline: Chemotherapy and the war on cancer. Nat Rev Cancer, CRAGG, G. M; NEWMAN, D. J. Plants as a source of anti-cancer agents. Journal of Ethnopharmacology, EDINGER, A.L.; THOMPSON, C.B. Death by design: apoptosis, necrosis and autophagy. Curr Opin Cell Biol. 4 Dec;16(6): FUKUMASU, H.; LATORRE, A. O.; BRACCI, L.; GÓRNIAK, S.L.; DAGLI, M.L.Z. Fitoterápicos e potenciais interações medicamentosas na terapia do câncer. Revista Brasileira de Toxicologia, SIKDAR, S. et al. Ethanolic extract of Condurango (Marsdenia condurango) used in traditional systems of medicine including homeopathy against cancer can induce DNA damage and apoptosis in non small lung cancer cells, A549 and H522, in vitro. TANG Vol.3 No.1, 2, 43-52; 13a. 7- LIANG Y, YAN C, SCHOR N. Apoptosis in the absence of caspase 3. Nature. 1 Oct, Volume, Number 45, Pages PULASKI B, OSTRAND-ROSENBERG S. Mouse 4T1 breast tumor model. Curr Protoc Immunol. 1 May;Chapter :Unit.2. 1