ESTUDO DO SISTEMA DE DUAS FASES AQUOSAS EM PROCESSO CONTÍNUO PA- RA EXTRAÇÃO DO ÁCIDO CLAVULÂNICO
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- João Gabriel Camilo Arantes
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1 ESTUDO DO SISTEMA DE DUAS FASES AQUOSAS EM PROESSO ONTÍNUO PA- RA EXTRAÇÃO DO ÁIDO LAVULÂNIO 1 Mariana M. M. Mateus, 2 lóvis S. da Silva, 3 Marlei B. Pasotto 1 Bolsista de iniciação ientífica PIBI/NPq/UFSar, discente do curso de Engenharia Química 2 Aluno da Pós-graduação do Departamento de Engenharia Química da Universidade Federal de São arlos/sp 3 Professor do Departamento de Engenharia Química da Universidade Federal de São arlos/sp 1,2,3 Departamento de Engenharia Química da Universidade Federal de São arlos. Via Washington Luis, m 235, São arlos - EP: e marlei@ufscar.br RESUMO - O uso do Sistema de Duas Fases Aquosas (SDFA) para a extração do antibiótico i- nibidor de beta-lactamase, o ácido clavulânico (A), é umas das técnicas de separação de biomoléculas cada vez mais estudadas, principalmente, por ter a facilidade e confiabilidade no aumento de escala, por poder ser desenvolvido em processo contínuo de extração e por um processo econômico em comparação com outras técnicas de separação. O SDFA foi composto por PEG 400, solução tampão de fosfato e soluções de ácido clavulânico produzidas por cultivos com Streptomyces clavuligerus, pré-tratado por membrana de ultrafiltração de polisulfona de tamanho de poro 3kDa e a partir do produto farmacêutico lavulin (500mg de amoxilina e 125mg de A). O estudo da extração contínua do ácido clavulânico foi feito em diferentes fluxos: 1,6 ml/min e 6,4 ml/min. omparando os resultados com o processo em batelada podese observar que o coeficiente de partição e o fator de purificação foram superiores na extração contínua, resultando em um maior rendimento desta. A linearidade do coeficiente de partição e do fator de purificação, bem como a similaridade de comportamento do PEG e Fosfato ao longo do experimento mostram a estabilidade do SDFA e a viabilidade deste processo, industrialmente. Palavras-have: ácido clavulânico, processo contínuo, sistema de duas fases aquosas INTRODUÇÃO Os estudos sobre o uso do sistema de duas fases aquosas (SDFA) para separação e purificação do antibiótico beta-lactâmico ácido clavulânico (A), tem demonstrado que está pode ser uma importante técnica na etapa intermediária separação deste antibiótico. O A é produzido industrialmente em cultura submersa de Streptomyces clavuligerus e possui uma fraca atividade antibacteriana, no entanto, é um potente inibidor da enzima beta-lactamase, enzima esta que oferece resistências às bactérias patogênicas aos antibióticos bet-lactamicos (Buynak, 2003). Videira & Aires Barros (1994) realizaram a extração do clavulanato de potássio de uma solução pura, em um sistema de duas fases aquosas (SDFA), composto por polietileno glicol e fosfato (PEG/fosfato), variando o ph, peso molecular do PEG e a relação PEG/fosfato. Para as condições estudadas, os autores concluíram que o ácido clavulânico possui uma alta afinidade pela fase rica em PEG, apresentando altos valores de recuperação (90-99%). Os valores obtidos para o coeficiente de partição foram de a 114. Atualmente os parâmetros do SDFA como o coeficiente partição, fator de purificação e rendimento do sistema de duas fases aquosas para separação do ácido clavulânico tem sido otimizado por manipulação das propriedades do sistema (Silva et al. 2008). No entanto, para aumento de escala e implementação industrial é necessário estudos de aspectos fundamentais deste sistema para desenvolvimento de equipamentos apropriados. No que se refere á cinética de separação das fases em processo em batelada tem sido estudado em termos das propriedades físico-químico (densidade, viscosidade, tensão interfacial) medindo a altura da dispersão como uma função do tempo separação (aul et al 1995; Solano-astillo & Rito-Palomares 2000). Na tentativa de reduzir o tempo gasto, o custo e evitar a degradação da biomolécula ocorrida no modo de operação em batelada do SDFA, a forma contínua deste processo de extração vem sendo cada vez mais estudada. Modelos matemáticos para descrever o processo contínuo em estado estacionário e transiente têm sido desenvolvidos para separação de proteínas. Os modelos estão baseados no balanço de VIII ongresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação ientífica 27 a 30 de julho de 2009 Uberlândia, Minas Gerais, Brasil
2 massas dos principais componentes do sistema e dos dados de equilíbrio das fases (Mistry et al. 1996; unha et al., 2003; Simon & Guatam 2005). Referente ao antibiótico ácido clavulânico apenas processo em batelada foram desenvolvido, necessitando assim estudos em processos contínuos do sistema de duas fases aquosas para separação e purificação do ácido clavulânico. om este trabalho objetivou-se analisar o comportamento dinâmico do processo contínuo de extração do ácido clavulânico, proveniente de produto farmacêutico lavulin e produzido por cultivos de S. clavuligerus, a partir dos Sistemas de Duas Fases Aquosas compostos por Polietileno glicol (PEG) e Fosfato. Materiais MATERIAIS E MÉTODOS Ácido clavulânico: As soluções de ácido clavulânico foram produzidas por cultivos com Streptomyces clavuligerus AT 27064, prétratado por membrana de ultrafiltração de polisulfona de tamanho de poro 3kDa, cujos meios de cultura são essencialmente constituídos de glicerol, isolado protéico de soja, SUPRO 783, suplementação de ornitina, solução de sais, (NH 4 ) 2 SO 4 e H 2 PO 4 ; e a partir do produto farmacêutico lavulin (500mg de amoxilina e 125 mg de A). PEG: Foi utilizado PEG de massa molecular 400 Da (Synth). Métodos Analíticos oncentração de A: A concentração de ácido clavulânico foi determinada por cromatografia líquida de alta eficiência (LAE) segundo o método descrito por Foulstone and Reading (1982). oncentração de ontaminantes: A concentração de contaminantes nos caldos de cultivo foi determinada por espectrofotometria a 280nm com espectrofotômetro UV/VIS da Pharmacia Biotech, descontando-se a influência da concentração de ácido clavulânico nesse comprimento de onda. oncentração de PEG e Fosfato: A concentração de PEG foi obtida por um método espectrofotométrico, segundo o descrito por B. Skoog (1979). A concentração de fosfato foi obtida por espectrofotometria, segundo o método azul de molibdênio. Procedimento Experimental Os experimentos em processo contínuos foram baseados nos trabalhos realizados por aul et al. (1995) e Mistry et al. (1996). A composição do sistema de duas fases aquosas foi baseada nos resultados obtidos por Silva et al. (2008). Para a realização destes experimentos utilizou-se um reator, sob constante agitação, projetado para que ocorresse uma mistura perfeita. Este foi alimentado por correntes de PEG, Fosfato e Ácido lavulânico com o auxílio de bombas peristálticas. Em seguida, a mistura foi bombeada continuamente para uma proveta, onde ocorre à separação das fases e continuamente estas fases são retiradas. Foram coletadas amostras das soluções de topo e fundo a cada cinco minutos durante um período de 40 minutos. Pode-se observar na Figura 1, o esquema experimental. Fosfato PEG A Tanque de mistura Bomba separador Topo Fundo Figura 1 Esquema do processo contínuo para extração do A ANÁLISE DOS RESULTADOS Os resultados foram analisados de acordo com os dados experimentais, considerando-se o coeficiente de partição (), que caracteriza a distribuição das substâncias entre as fases de topo e de fundo, descrito pela equação 1. t = (1) f Onde t e f são as concentrações de A na fase de topo e de fundo, respectivamente. O fator de purificação do sistema foi definido de acordo com a equação 2. t To = (2) O T Onde 0 e T0 são as concentrações iniciais da substância de interesse e contaminantes, respectivamente, t e T são as concentrações desses produtos na fase de topo. RESULTADOS E DISUSSÕES Extração do A proveniente de produto farmacêutico Os resultados da extração do A em processo contínuo SDFA a partir da solução do produto farmacêutico podem ser observados na Tabela 1, juntamente com os valores obtidos no processo em batelada.
3 Os coeficientes de partição no processo contínuo são superiores ao processo em batelada (Tabela 1), indicando que a cinética de separação das fases ocorre rapidamente. No entanto, para o fluxo de 1,6 ml/min, a composição das fases do sistema contínuo se aproxima do processo em batelada como pode se observar na Tabela 1. Este fato mostra que pode não haver uma mistura instantânea dentro do reator, ocasionando uma variação na composição SDFA. Tabela 1. Análise dos dados experimentais dos SDFA em processos lavulin Solução Fluxo t f (ml/min) (mg/l) (mg/l) 1,6 8,6 123,2 14,1 lavulin 6,4 17,6 117,5 7,1 Batelada 5, ,1 Na Figura 2 pode ser observado o comportamento do ao longo do tempo para o processo contínuo de SDFA. Inicialmente o processo contínuo de SDFA para extração do A apresenta instabilidade, devido a não uniformidade das vazões de alimentação do reator no início do processo contínuo. No entanto, pode-se observar a similaridade de comportamento no restante do tempo (Figura 2). Vale ressaltar, que a estabilidade do sistema manteve-se para um fluxo quatro vezes maior, mostrando a necessidade de um baixo controle do processo. entanto, é possível notar-se que as concentrações de PEG e Fosfato foram alteradas, esta alteração deve estar relacionada ao fato de que, apesar da cinética de separação para formação das fases ser rápida, o sistema ainda não atingiu o equilíbrio químico das fases (Figuras 3 e 4). PEG,T (mol/l) 5,0 4,5 4,0 3,5 F=1,6 ml/min F=6,4 ml/min Figura 3 Variação da concentração de PEG na fase de topo para o processo contínuo com lavulin de fluxo 1,6 ml/min e 6,4 ml/min em relação ao tempo F=1,61 ml/min F=6,44 ml/min F=1,6 ml/min F=6,4 ml/min Fosf,F (g/l) Figura 2 Variação dos coeficientes de partição para o processo contínuo com lavulin de fluxo 1,6 ml/min e 6,4 ml/min em relação ao tempo A variação da composição de PEG e Fosfato na fase de topo e fundo durante a etapa experimental do processo contínuo pode ser observada nas Figuras 3 e 4, respectivamente. O aumento de 4 vezes na vazão de 1,6 ml/ min para 6,4 ml/min não influenciou na estabilidade da composição do sistema ao longo do tempo. No Figura 4 Variação da concentração de Fosfato na fase de fundo para o processo de fluxo 1,6 ml/min e 6,4 ml/min com lavulin em relação ao tempo Extração do A proveniente de cultivo Os resultados do processo de extração contínua do A proveniente de cultivo também foram avaliados de acordo com os valores obtidos experimentalmente, considerando-se, além do coeficiente de partição, o desempenho do processo avaliado pelo fator de purificação. Na Tabela 2, observam-se os valores de e, juntamente com os valores obtidos das
4 concentrações de A nas fases de topo e de fundo. Os resultados obtidos demonstram que o coeficiente de partição e o de fator de purificação são superiores no processo de extração contínua do A em comparação com os resultados do processo em batelada. Tabela 2 Análise dos dados experimentais dos SDFA em processos contínuos e em batelada realizados com caldo Fluxo solução t f (ml/min) (-) (-) (mg/l) (mg/l) 1,6 13,2 0,74 95,7 7,3 aldo Batelada 4,2 0, ,3 Na Figura 5 observa-se que o comportamento foi de forma linear e estável tanto para coeficiente de partição como para o fator de purificação durante o processo contínuo de SDFA com caldo ao longo do tempo. omportamento este também observado para a concentração de PEG e Fosfato (Figuras 6 e 7, respectivamente), em relação ao tempo Figura 5 Variação do e para o processo contínuo caldo de A emrelação ao temp PEG,T (mol/l) 2,7 2,4 2,1 1,8 1,2 0,9 0,6 0,3 Figura 6 Variação da concentração de PEG na fase de topo para o processo contínuo caldo de A em relação ao tempo 1,8 1,2 0,9 0,6 0,3 Fosf,F (g/l) Figura 7 Variação da concentração de Fosfato na fase de fundo para o processo contínuo caldo de A relação ao tempo ONLUSÃO Os sistemas de duas fases aquosas operando em processos contínuos para a extração do ácido clavulânico apresentaram coeficientes de partição superiores aos processos em batelada e melhor desempenho, com um fator de purificação também superior, ao utilizar o A proveniente do cultivo. Os experimentos mostraram-se estáveis durante os 40 minutos de observação, sem apresentar altas variações do, e das concentrações analisadas. Estes experimentos mostraram a viabilidade do processo contínuo para extração de A industrialmente, perante o melhor desempenho deste em comparação com o processo em batelada. REFERÊNIAS BIBLIOGRÁFIAS BARBOZA, M.; ARAUJO, M. L. G..; HOA,. O. inetic studies on clavulanic acid degradation. Biochemical Engineering Journal, v.23, p.31-36, v. 22, p , BUYNA, J. D., Understanding the longevity of the β-lactam antibiotics and of antibiotic/β-lactamase inhibitor combinations. Biochemical Pharmacology, v.71, p , UNHA, M. T.; OSTA, M. J. L.; ALADO,. R.., FONSEA, L. P.; AIRES-BARROS; M. R.; ABRAL, J. M. S. Integration of production and aqueous two-phase systems extraction of extracellular Fusarium solani pisi cutanise fusion proteins. Journal of Biotechnology, v.100, p.55-64, 2003.
5 FOULSTONE, M.; READING,., Assay of amoxicillin and clavulanic acid, the omponents of Augmentin, in Biological Fluids with High, AUL, A.; PEREIRA, R. A. M., ASENJO, J. A., MERHU, J.. inetics separation for polyethylene glycol-phosphate two-phases systems. Biotechnology and bioengineering, v. 48, p , MISTRY, S.L.; AUL, A.; MERHU, J..; ASENJO, J.A. Mathematical modelling and computer simulation of aqueous twophase continuous protein extraction. Journal of hromatography A, v.741, p , SILVA,. S.; BOVAROTTI, E; RODRIGUES, M. I.; HOA,. O.; BARBOZA M. Avaliação de efeitos de parâmetros envolvidos na purificação do acido clavulânico através do sistema de duas fases aquosas. In: XVII ongresso Brasileiro de Engenharia Química (OBEQ) 2008, Recife-Pe. Anais (D-ROM). SOLANO-ASTILLO,.; RITO-PALOMARES, M. inetics of phase separation under different process and design parameters in aqueous two-phase systems. Journal of hromatography B, v.743, p , SOOG, B. Determination of polyethylene glycols 4000 and 6000 in plasma protein preparations. Vox Sang, v.37, p , VIDEIRA, M.; AIRES-BARROS, M. R. Liquidiliquid extraction of clavulânico acid using an aqueous two-phase system of polyethyleneglycol and potassium phosphate. Jounal of chromatography A, v.668, p , AGRADEIMENTOS Os autores agradecem pelo financiamento da FAPESP (05/ ) e a NPq pela bolsa I para Mariana M.M. Mateus e a bolsa de doutorado para lóvis S. da Silva.
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