ESTUDO DA PARTIÇÃO DE BIOMOLÉCULAS EM SISTEMAS AQUOSOS BIFÁSICOS ENVOLVENDO PEG E SAL A 30 C

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1 ESTUDO DA PARTIÇÃO DE BIOMOLÉCULAS EM SISTEMAS AQUOSOS BIFÁSICOS ENVOLVENDO PEG E SAL A 30 C A. C. de OLIVEIRA 1, R. CERIANI 1 e M. AZNAR(in memorian) 1 Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química, Departamento de Engenharia de Processos para contato: rceriani@feq.unicamp.br RESUMO O objetivo deste trabalho foi investigar a partição de duas biomoléculas, albumina do soro bovino (BSA) e lisozima, em sistemas aquosos bifásicos (SABs) envolvendo PEG (1500, 4000 ou 6000) + tiossulfato de sódio penta hidratado a 30 C. Inicialmente, o equilíbrio líquido-líquido (ELL) desses sistemas foi avaliado e as partições das biomoléculas foram medidas por meio da relação entre as suas concentrações nas fases superior e inferior. As concentrações foram determinadas por leitura direta em espectrofotômetro a 280 nm a partir de curvas de calibração. Obtevese neste trabalho, eficiência de partição de aproximadamente 70 % para a maioria dos casos. 1. INTRODUÇÃO Extração aquosa em duas fases é uma técnica de fracionamento líquido-líquido que tem sido extensivamente usada para recuperação e purificação de produtos biológicos. Esta técnica envolve a construção de sistemas de extração que podem ser formados por dois polímeros ou um polímero e um sal que quando misturados em uma dada faixa de temperatura e concentração, formam misturas turvas que, após o repouso, separam-se espontaneamente em duas fases líquidas límpidas (Ruiz-Ruiz, et al., 2012). Os sistemas PEG/sal apresentam vantagens para a extração de biomoléculas pelo custo reduzido, menor tempo de separação de fases e propriedades físicas favoráveis à operação em larga escala, como elevada seletividade e diferenças de densidade, viscosidade entre as fases adequadas para o trabalho com equipamentos de extração disponíveis no mercado (Salabat, 2001; Husted et al., 1985). Entretanto, para aplicar os sistemas aquosos bifásicos ao estudo da partição de biomoléculas é importante que se conheça previamente seus diagramas de fases. Esses diagramas representam graficamente a composição na qual se formam duas fases líquidas em equilíbrio termodinâmico.

2 Dados de equilíbrio para SABs formados por polietileno glicol e sulfato de sódio estão disponíveis na literatura (Anathapadmanabhan e Goddard, 1987; Snyder et al.,1992; Salabat, 2001; Ferreira e Teixeira; 2011). No entanto, não foram encontradas referências de estudos de SABs envolvendo polietileno glicol e tiossulfato de sódio. Assim, neste trabalho, foi analisado o equilíbrio de fases e a partição das biomoléculas BSA e lisozima nesse tipo de sistema a 30 C. 2. METODOLOGIA 2.1. Material Os polietilenos glicóis utilizados neste trabalho foram os de massas molares médias 1500 g/gmol (PEG 1500), 4000 g/gmol (PEG 4000) e 6000 g/gmol (PEG 6000) e o sal inorgânico foi o tiossulfato de sódio (NaC2H3O2). As biomoléculas utilizadas para o estudo de partição nestes sistemas foram a Albumina de soro bovino (BSA) e a lisozima. Todos os materiais citados foram obtidos da Sigma-Aldrich. Utilizou-se água destilada para a realização dos experimentos Procedimento experimental Os diagramas de equilíbrio foram obtidos a partir de soluções aquosas de sal a 35 % (m/m) e de PEG a 50% (m/m). As curvas binodais foram obtidas por turbidimetria, a 30 C, seguindo a metodologia descrita por Albertsson (1986). Os pontos experimentais, em termos de frações mássicas de PEG (w 1 ) e de sal (w 2 ) da curva binodal são ajustados à Equação 1, que foi reescrita para as fases superior (Equação 2) e inferior (Equação 3), na forma de curvas de calibração: w 1 = Aexp(B(w 2 ) 0,5 C(w 2 ) 3 ) (1) onde w 1 e w 2 são as frações mássicas de PEG e sal, respectivamente, e A, B e C são constantes obtidas por regressão não-linear. Uma vez conhecida a região bifásica, pontos de mistura ternários dentro da região de duas fases foram preparados e vigorosamente agitados por 10 minutos a 2500 rpm em um vórtex da marca Heidolph. Em seguida, a solução turva foi colocada em um banho termostático, à temperatura constante, por no mínimo 20 horas, para que houvesse a formação das duas fases límpidas com interface bem definida. As mesmas foram, então, cuidadosamente separadas e pesadas em balança analítica para a determinação das concentrações das linhas de amarração (LAs) pelo método gravimétrico de Merchuk et al. (1998). Esse método consiste na aplicação da regra da alavanca para a relação entre a composição da fase superior e a composição global do sistema. Assim, a determinação das composições das linhas de amarração é feita pela resolução do sistema de quatro equações (Equações 2-5) e quatro incógnitas (w 1 I, w 2 I, w 1 e w 2 ): w 1 I = Aexp(B(w 2 I ) 0,5 C(w 2 I ) 3 ) (2) w 1 = Aexp(B(w 2 ) 0,5 C(w 2 ) 3 ) (3)

3 w 1 I = w 1 M α w 2 I = w 2 M α 1 α α w 1 (4) 1 α α w 2 (5) sendo que, os sobrescritos, I, e M, referem-se à fase superior, fase inferior e mistura, respectivamente. O termo α é a razão entre a massa da fase superior (g) e a massa total da mistura (g). O comprimento da linha de amarração (CLA) e inclinação (S) das linhas de amarração foram calculados pelas Equações 6 e 7. CLA = (w 1 I w 1 ) 2 + (w 2 I w 2 ) 2 (6) S = w 1 I w 1 w 2 I w 2 (7) onde: w 1 I, w 1, w 2 I e w 2 representam as composições de equilíbrio, em fração mássica, do PEG (1) e do sal (2), na fase superior (I) e inferior (). Os dados experimentais das linhas de amarração tiveram sua qualidade verificada pelos testes de Othmer-Tobias (1942) e de Bancroft (González-Tello et al., 1996). 1 w 1 I n w ) 2 w 1 I = k 1 ( 1 w 2 w 3 I r wi ) 1 w 2 = k 2 ( w 3 (8) (9) sendo que, k 1, n, k 2 e r são parâmetros de ajuste e w 1 I, w 2 I, w 3 I, w 1, w 2, w 3 são as frações mássicas do PEG (1), sal (2) e água (3) nas fases superior (I) e inferior (). 2.3.Partição das biomoléculas Com o objetivo de avaliar a influência do comprimento das linhas de amarração (CLAs) na partição das biomoléculas em estudo, foram realizadas partições em quatro LAs de cada sistema na temperatura de 30 C. A massa total do sistema para análise da partição foi de 5 g. Para a partição da lisozima e da proteína BSA foram usadas soluções aquosas de 1 g/dm³ e 0,5 g/dm³ das biomoléculas, respectivamente, ao invés de água no sistema ternário formador de duas fases. O ph das fases do sistema de partição foi medido em phmetro da marca Quimis. Para a análise das

4 partições das biomoléculas, BSA e lisozima, as concentrações foram medidas por leitura direta no espectrofotômetro a 280 nm, utilizando água destilada como branco. Para este estudo, as fases superior e inferior foram cuidadosamente separadas e diluídas com água destilada na proporção apropriada para cada biomolécula. Todos os experimentos de partição foram conduzidos em duplicata. O coeficiente de partição foi calculado pela Equação 10, que é a relação da concentração da biomolécula nas fases superior (rica em PEG) e inferior (rica em sal): A eficiência de extração (EE, %) foi calculada pela Equação 11. EE = 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO k p = [BIO ] sup [ BIO ] inf = [BIO ] PEG [BIO] sal (10) [ BIO ] sal w sal [ BIO ] PEG w PEG +[ BIO ] sal w sal 100 (11) A Figura 1 mostra os dados experimentais das frações mássicas de PEG (1) e sal (2) das curvas binodais a 30 C para os sistemas estudados. Nela estão representadas as regiões monofásicas (abaixo da curva) e as regiões bifásicas (acima da curva). Observou-se, que quanto maior a massa molecular do PEG, maior é a região de duas fases w PEG 1500 PEG 4000 PEG w 2 Figura 1: Efeito da massa molar do PEG na curva binodal para o sistema: PEG (1) + Tiossulfato de sódio (2) + água (3) a 30 C.

5 Utilizando os dados das curvas binodais apresentados na Figura 1, os parâmetros da Equação 1 foram obtidos e estão apresentados na Tabela 1. Tabela 1. Parâmetros da equação de ajuste das curvas binodais sugeridas por Merchuk et al. (1998) (Equação 1). PEG A B C R² SD* PEG ,9935-3, ,3559 0,9980 0,0044 PEG ,8379-3, ,8174 0,9973 0,0056 PEG ,9490-4, ,3039 0,9976 0,0054 *SD (desvio padrão) =( (w 1 calc exp 0,5 w 1 ) ), onde n é o n de dados da curva binodal; n Correlações e linhas de amarração A Tabela 2 traz os dados das linhas de amarração para os sistemas estudados na temperatura de 30 C. As frações mássicas das fases inferior e superior em termos de PEG (1) e sal (2) foram obtidas através da utilização da ferramenta Solver do Microsoft Excel. Nesta tabela, também estão apresentados os valores de CLA (Equação 6), S (Equação 7) e os valores de ph das fases. Observou-se, que quanto maior a quantidade de sal adicionado ao sistema maior é o comprimento da LA. Isso significa que a CLA é diretamente proporcional à quantidade de sal adicionado na alimentação. Tabela 2. Dados experimentais das linhas de amarração do sistema: PEG (1) + Tiossulfato de sódio (2) + água (3) Alimentação Fase superior Fase inferior LA 100w 1 100w 2 100w 1 100w 2 ph 100w 1 100w 2 ph CLA S PEG ,97 18,95 31,59 9,73 6,14 3,33 28,86 6,08 34,13-1, ,04 21,06 36,35 7,82 6,07 1,33 33,15 6,02 43,21-1, ,02 23,04 40,00 6,55 6,10 0,62 36,10 6,12 49,23-1, ,00 24,98 44,44 5,21 6,04 0,34 38,19 6,01 55,07-1,34 PEG ,07 16,08 31,36 7,18 5,98 0,42 27,91 6,02 37,24-1, ,06 18,06 35,84 5,66 6,12 0,13 30,55 6,06 43,52-1, ,95 19,98 39,41 4,59 6,08 0,04 32,82 6,11 48,45-1, ,02 22,02 42,18 3,86 6,17 0,01 35,56 6,12 52,76-1,33

6 Continuação da Tabela 2 PEG ,09 15,93 33,81 6,13 6,09 0,35 26,99 6,11 39,43-1,6 2 18,07 18,07 37,18 5,19 6,03 0,08 30,19 5,99 44,74-1, ,06 20,03 41,04 4,25 6,14 0,02 32,42 6,09 49,76-1, ,99 21,98 44,00 4,06 6,11 0,00 34,7 6,16 53,62-1,44 A Figura 2 mostra os diagramas de fases obtidos pela metodologia de quantificação de Merchuk et al. (1998) para os sistemas PEG 1500 ou PEG 4000 ou PEG tiossulfato de sódio + água a 30 ºC. Figura 2: Diagrama de fases para o sistema: PEG (1) + Tiossulfato de sódio(2) + água(3) a 30 C A qualidade dos dados de ELL obtidos foi verificada usando os testes de Othmer-Tobias e Bancroft, cujos resultados estão apresentados na Tabela 3. Pôde ser visto que os coeficientes de determinação foram maiores que 0,98 para todos os sistemas investigados, sendo, portanto, de qualidade adequada. Tabela 3. Parâmetros das Equações (8-9) para o sistema PEG (1) + Tiossulfato de sódio (2) + água (3) a 30 C Othmer-Tobias (Equação 8) Bancroft (Equação 9) PEG k 1 n R 1 2 k 2 r R ,7272 1,2207 0,9845 1,4214 0,7961 0, ,5873 1,3751 0,9892 1,5446 0,7646 0, ,5155 1,4129 0,9983 1,6758 0,7338 0,9989 A Tabela 4 traz a análise da partição das biomoléculas em relação ao comprimento das LAs (CLA). As frações mássicas de alimentação dos sistemas ternários para a partição são as mesmas apresentadas na Tabela 2. De uma forma geral, observou-se que o aumento do CLA, provoca uma

7 ligeira redução no coeficiente de partição (k p ) em todos os sistemas estudados, exceto PEG Tanto a BSA quanto a lisozima foram particionadas em sua maior parte para a fase inferior, rica em sal. Para a BSA, as eficiências de extração (EE) foram superiores a 74 %. Para a lisozima, o menor valor de EE encontrado foi de 67 %. Segundo Ruiz-Ruiz e colaboradores (2012), o uso de sistemas de extração envolvendo polímeros e sais, pode provocar uma interação biológica dos grupos iônicos de certas moléculas para a fase rica em sal. No entanto, a afinidade de biomoléculas em sistemas desse tipo ainda tem sido pouco estudada. Tabela 4. Partição e recuperação teórica de biomoléculas no sistema PEG (1) + Tiossulfato de sódio (2) + água a 30 C LA CLA k p EE (%) CLA k p EE (%) CLA k p EE (%) PEG 1500 PEG 4000 PEG 6000 Albumina de soro bovino (BSA) 1 34,13 0,317±0,004 74,28 37,24 0,529±0,012 63,83 39,43 0,270 ±0,013 75, ,21 0,267±0,058 77,38 43,52 0,499±0,014 60,40 44,74 0,233 ±0,008 77, ,23 0,231±0,025 79,68 48,45 0,429±0,004 60,53 49,76 0,198±0,020 79, ,07 0,209±0,002 80,45 52,76 0,323±0,006 59,34 52,36 0,249±0,014 76,01 Lisozima (LS) 1 34,13 0,450±0,002 67,02 37,24 0,335±0,004 72,63 39,43 0,304±0,013 73, ,21 0,407±0,030 69,15 43,52 0,281±0,025 75,22 44,74 0,242±0,008 77, ,23 0,314±0,025 74,18 48,45 0,258±0,013 76,32 49,76 0,220±0,020 78, ,07 0,308±0,002 73,58 52,76 0,236±0,002 78,12 52,36 0,215±0,014 78,56 4.Conclusão Dados de equilíbrio líquido-líquido para os SABs formados por PEG (1) + Tiossulfato de sódio (2) + água (3) foram obtidos a 30 C pela combinação do método do ponto de névoa e da quantificação sugerida por Merchuk et al. (1998). Os dados obtidos pelo ELL foram verificados pelos testes de Othmer-Tobias e de Bancroft, obtendo coeficientes de correlação adequados, o que comprovou a qualidade dos dados experimentais. A partição das biomoléculas BSA e da lisozima nestes sistemas foi posteriormente estudada. Neste caso, observou-se que existe uma relação entre o aumento do CLA e os coeficientes de partição ( k p ), que em geral decresce com o aumento no comprimento da linha de amarração. Foi verificado também que ambas as biomoléculas foram particionadas para a fase inferior, rica em sal, apresentando eficiência de extração próximas ou superiores à 70 % para todos os sistemas estudados.

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