Cancer Genomes Moderator: Eleftherios P. Diamandis1,2,3* Experts: Thomas Hudson,4,5,6 Olli Kallioniemi,7 Edison T. Liu,8,9,10 and Carlos López-Otı n11

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1 Cancer Genomes Moderator: Eleftherios P. Diamandis1,2,3* Experts: Thomas Hudson,4,5,6 Olli Kallioniemi,7 Edison T. Liu,8,9,10 and Carlos López-Otı n11 Genomas do Câncer Eleftherios P. Diamandis, Moderador 1,2,3,* Thomas Hudson 4,5,6, Olli Kallioniemi 7, Edison T. Liu 8,9,10 e Carlos López-Otín, Peritos 11 1 Department of Pathology and Laboratory Medicine, Mount Sinai Hospital; 2 Department of Clinical Biochemistry, University Health Network; and Departments of 3 Laboratory Medicine and Pathobiology, 4 Molecular Genetics, and 5 Medical Biophysics, University of Toronto; 6 Ontario Institute for Cancer Research (OICR), Toronto, Ontario, Canada; 7 Institute for Molecular Medicine (FIMM), University of Helsinki, Helsinki, Finland; 8 Genome Institute of Singapore (Biomedical Sciences Institutes); 9 National University of Singapore; 10 Health Sciences Authority of Singapore, Singapore; 11 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Medicina, Universidad de Oviedo, Oviedo, Spain. Envie correspondência para esse autor para: 60 Murray St., 6th Floor, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. Fax ; ediamandis@mtsinai.on.ca. Câncer tem sido considerado por um longo tempo como uma doença dos genes. Existem excelentes exemplos de alterações genômicas que levam ao câncer familiar ou esporádico; entretanto, apesar dos avanços espetaculares na genômica durante os últimos 20 anos, a base genética da vasta maioria dos cânceres esporádicos permanece obscura. Novas tecnologias de sequenciamento e de baixo custo agora permitem sequenciamento completo do DNA para grandes números de tumores. Recentemente, o Consórcio Internacional do Genoma do Câncer (ICGC) 12 foi criado para coordenar estudos em grande escala do genoma do câncer de tumores de 50 diferentes tipos de câncer. Espera-se que análises sistemáticas de > genomas de cânceres ao nível genômico, epigenômico e transcriptômico revelem mutações oncogênicas anteriormente não identificadas, que nos ajudarão a entender a patogênese do câncer e facilitarão o desenvolvimento de novas terapias do câncer. Nós pedimos que 4 peritos explicassem mais sobre essa organização e seus objetivos. Quais são os principais objetivos do ICGC, e como seu país desempenha esse papel? Thomas Hudson: Os principais objetivos do ICGC são coordenar esforços em muitos países para gerar e rapidamente disseminar extensivos catálogos de mutações somáticas e outras anormalidades genômicas presentes nos tumores de pelo menos 50 diferentes tipos de câncer e/ou subtipos. Com exceção dos raros tumores, cada catálogo incluirá grupos de dados genômicos, epigenômicos, e transcriptômicos de pelo menos 500 pares de amostras do tumor e normais. O Instituto de Ontário para Pesquisa do Câncer (OICR) já lançou um projeto para estudar o adenocarcinoma ductal pancreático, uma forma altamente fatal de câncer. OICR está atualmente no estágio de planejamento de um projeto do genoma do câncer

2 de próstata, em parceria com o Instituto de Câncer de Próstata do Canadá. OICR também atua coordenando organismos do ICGC: a Secretaria do ICGC, que apóia a comunicação e workshops entre os membros do ICGC, o Centro de Coordenação de Dados, que coordena a troca de dados entre os membros, e o Portal do Dados do ICGC (no que fornece à comunidade científica acesso aos dados e um conjunto de ferramentas de consulta. Olli Kallioniemi: A plena caracterização genômica, transcriptômica, e epigenômica de todos os principais tipos de câncer e subtipos relevantes. Edison Liu: Singapura é um país observador e não participa diretamente. Contudo, nós apoiamos plenamente o objetivo do ICGC de identificar as mutações mais comuns nos cânceres humanos com os maiores encargos da saúde no mundo todo. Carlos López- Otín: A identificação das principais alterações genéticas nos 50 cânceres mais prevalentes no mundo todo. Para fazer isso, o genoma das células tumorais e das células não tumorais do mesmo paciente será completamente sequenciado com as tecnologias de sequenciamento de última geração. Isso será feito em 500 pacientes por tipo de câncer para identificar genes mutados recorrentes em pelo menos 3% dos tumores. Todos os tipos de mutações tumorais serão analisadas, incluindo mutações pontuais, translocações, e grandes deleções ou inserções. Adicionalmente, dados epigenômicos e transcriptômicos sobre esses tumores serão gerados. Nosso país está liderando o sequenciamento e análise da leucemia linfocítica crônica, a leucemia mais comum em países Ocidentais. Essa é uma colaboração internacional. Quem vai patrociná-la? Thomas Hudson: Cada projeto dos membros do ICGC é patrocinado por uma ou mais agências que fornecem um mínimo de $20 milhões de dólares americanos durante 5 anos. Os fundos cobrem uma gama de atividades que incluem coletas de tecidos, análises de genomas, e bioinformática. Além disso, muitos países têm investido substancialmente em infraestrutura e em instrumentos de sequenciamento de última geração. Carlos López-Otín: Essa é uma colaboração internacional na qual cada país propõe um tipo de câncer a ser estudado e fornece patrocínio para realizar os estudos para aquele tipo específico de tumor. O papel do ICGC é o de coordenar os diferentes tipos de cânceres estudados para evitar a duplicação dos esforços e fornecer uma metodologia similar, padrões de qualidade, e objetivos, de modo que após o término do projeto, os resultados gerados por diferentes membros do consórcio sejam comparáveis e acessíveis aos outros cientistas. Durante os últimos anos uns poucos genomas do câncer foram publicados. O que nós aprendemos a partir desses estudos iniciais? Thomas Hudson: Embora muitos genomas do câncer precisarão ser estudados para ajudar a distinguir as mutações condutoras das mutações de passageiros, eu estou sur-

3 preso que as primeiras publicações dos genomas do câncer que descrevem um ou um punhado de tumores forneceram consideráveis pistas sobre os processos do câncer. Por exemplo, estudos do melanoma e das culturas celulares do câncer de pulmão têm mostrado que padrões específicos de mutações observadas em tumores combinam com as exposições dos pacientes aos carcinógenos tais como luz ultravioleta e tabaco. Outros estudos que comparam tumores primários, metástases, e xenotransplantes fornecem evidência de processos de seleção nos tumores e sugerem genes que podem estar implicados nos processos metastático e de transplante. O alto número de mutações somáticas, frequentemente excedendo por tumor, oferece alguma evidência atormentadora de novos genes do câncer, contudo a validação dessas necessidades precisa de trabalho adicional. Olli Kallioniemi: Um entendimento mais profundo de que os cânceres são muito heterogêneos em termos de seu espectro mutacional e dos genes envolvidos. Apenas algumas mudanças genéticas comuns, tais como mutações do BRAF (oncogene v-raf sarcoma murino viral homólogo B1), foram encontradas até agora. Entretanto, apesar de uma aparente falta de pontos mutacionais quentes, muitas mutações têm como alvo diferentes membros ao longo de vias principais do câncer. Perfis moleculares integrados (de acordo com o protocolo do ICGC ) de grandes números de tumores, com pleno perfil transcriptômico e epigenômico, ainda não existem. Edison Liu: Primeiro a heterogeneidade e a singularidade da maioria dessas mutações sugere que apenas algumas mutações comuns serão encontradas. A maioria parece ser de mutações particulares até agora. Entretanto, eu realmente acredito que quando nós tivermos os números de pacientes, nós encontraremos "estrutura" de ordem maior para essas mutações relativas aos agrupamentos de genes e vias. Carlos López-Otín: As primeiras iniciativas nesse sentido revelaram que o número de genes mutados num tumor é maior do que o anteriormente pensado. A partir desses estudos, alguns genes já foram identificados como frequentemente mutados num certo tipo de tumor, e estudos subsequentes confirmaram a importância desses genes no desenvolvimento do tumor. Adicionalmente, os estudos genômicos do melanoma ou das células do carcinoma pulmonar revelaram a presença de padrões específicos de mutações que nos informam sobre a exposição aos carcinógenos específicos que estiveram na origem do desenvolvimento desses tumores específicos. Outra lição que nós aprendemos desses estudos iniciais é a heterogeneidade das mutações tumorais, que torna muito difícil identificar as mutações condutoras e distingui-las das mutações passageiras, desse modo reforçando a necessidade de estudar um grande número de amostras para entender os mecanismos do desenvolvimento e progressão do câncer. Você acredita que sequenciar genomas completos, não apenas os exons fornecerá informação adicional valiosa? Thomas Hudson: Com certeza. Nós não podemos ignorar a evidência de que existe extensiva atividade reguladora, RNAs nãocodificantes, e outras unidades funcionais fora dos genes de codificação das proteínas. Enquanto as ferramentas para estudar essas características do genoma estiveram menos desenvolvidas e a capacidade de prever as consequências de milhares de mutações somáticas fora dos exons estiver relativamente limitada, eu antecipo que as células cancerosas terão tantas mutações condutoras nas regiões não-codificantes do genoma quanto elas têm nos exons. Uma consequência de

4 analisar um grande número de genomas tumorais será a observação de mutações recorrentes fora dos exons, o que fascinará os biólogos moleculares e incentivará a pesquisa nessa classe de mutações condutoras. Olli Kallioniemi: Contanto que a capacidade de sequenciamento não seja limitadora, sequenciar genomas inteiros é importante para se adquirir um entendimento completamente não tendencioso dos eventos mutacionais através do genoma. No momento, nossa capacidade de interpretar todas as mudanças nos locais não exônicos é limitada, mas isso é especificamente uma área onde os dados do ICGC serão muito úteis. Edison Liu: Sim eu acredito. Há evidência de que mutações ou variações estruturais possam ter um papel maior na progressão do câncer do que anteriormente pensávamos. Tais rearranjos não ocorrem nos exons, e os rearranjos funcionais ocorrem nos íntrons e nas regiões não gênicas. A única maneira de verificá-los é sequenciando todo o genoma. Carlos López-Otín: Sequenciamento do exoma é uma ferramenta muito útil para identificar mutações pontuais ou pequenas inserções/deleções rapidamente e de forma rentável e provavelmente será muito útil para identificar a vasta maioria das mutações implicadas no desenvolvimento do tumor. Contudo, sequenciamento do exoma não pode identificar algumas das alterações genéticas que são importantes para o crescimento do tumor, incluindo translocações, grandes inserções ou deleções, inversões ou mudanças no número de cópias. Além disso, existem muitas alterações importantes para o desenvolvimento e progressão do câncer que ficam fora das regiões de codificação das proteínas. Portanto, sequenciamento de todo o genoma será essencial para se obter a completa visão do cenário genético do câncer. Qual é a sua expectativa sobre o resultado interpretativo dessa iniciativa? Thomas Hudson: A tradução dos genes do câncer recentemente descobertos e as mudanças para a clínica como testes, serviços, ou produtos bem validados levarão anos e substancial trabalho. Resultados iniciais (isto é, 5 anos) que possuem benefícios clínicos seriam a identificação de mutações ou de padrões de expressão gênica que classificariam os tumores em novas subclasses que fossem clinicamente relevantes. Por exemplo, seria útil distinguir formas indolentes contra agressivas de câncer de próstata e evitar incontinência e impotência associadas com cirurgia em pacientes que acreditamos possam ter tumores não ameaçadores. Eu suspeito que levará mais do que 15 anos para desenvolver novas intervenções para novos genes e mutações do câncer descobertos pelos projetos do ICGC, tendo em conta as linhas de tempo para conduzir estudos abrangendo validação do objetivo, descoberta inicial da droga, e estudos clínicos e préclínicos. A pressão para adotar novas abordagens, particularmente para cânceres avançados que não respondem às drogas convencionais, será considerável. Olli Kallioniemi: ICGC desenvolverá o banco de dados de referências definitivo das mudanças genômicas no câncer e ajudará a servir como referência para estudos genômicos diagnósticos. Dados do ICGC esperançosamente enfatizarão os alvos terapêuticos, prognósticos e diagnósticos específicos e facilitarão a transição em andamento em direção à medicina personalizada. Edison Liu:Primeiro, será o avanço conceptual no entendimento das mutações genéticas detalhadas e da carga mutacional dos cânceres humanos. A coalescência das vias com as grandes cargas mutacionais pode nos guiar para opções terapêuticas. Segundo, nós podemos encontrar diagnósticos prontos nos

5 dados resultantes. Por último, o espectro mutacional e o contexto da sequência dessas mutações, quando examinados em tais grandes números, inevitavelmente fornecerão dicas quanto à gênese das mutações associadas com o câncer. Carlos López-Otín: Novos marcadores para diagnóstico e prognóstico do câncer, melhor classificação dos pacientes para resposta à terapia, e novos objetivos terapêuticos. Por que algumas instituições e investigadores notáveis não fazem parte da iniciativa? Thomas Hudson: É correto que embora mais de 50 instituições e 200 investigadores estejam envolvidos com o ICGC, existem excelentes equipes que ainda não se envolveram. A principal razão para isso é o patrocínio. São necessários recursos consideráveis para apoiar um projeto do ICGC, visto que cada projeto envolve grandes equipes de clínicos, patologistas, biólogos do câncer, cientistas do genoma, técnicos em bioinformática, e outros. O ICGC ainda está aberto para novos membros e projetos. Várias agências patrocinadoras estão planejando se unir ou apoiar projetos adicionais, particularmente para tipos de tumores ainda não selecionados. Edison Liu: Apenas grandes centros de sequenciamento podem efetivamente participar dessa iniciativa por causa do âmbito do sequenciamento e das exigências da produção. Centros menores de sequenciamento com um foco na biologia celular podem não ter o interesse ou a infraestrutura para fazer isso eficazmente. Carlos López-Otín: O sequenciamento dos genomas tumorais contribuirá para um melhor entendimento dos mecanismos implicados no desenvolvimento do câncer, contudo não fornecerá todas as respostas para essa doença. Alguns investigadores consideram que o sequenciamento de genomas tirará importantes recursos financeiros de outras áreas da pesquisa do câncer e estão céticos quanto aos resultados futuros dessa iniciativa. Eu me lembro que perguntas e dúvidas semelhantes foram levantadas nos primeiros estágios do Projeto do Genoma Humano. Entretanto, em meu ponto de vista, o sequenciamento do genoma humano provou ser um recurso inestimável para o avanço da ciência em todos os níveis, e especialmente para a pesquisa do câncer. Esse é o motivo pelo qual eu estou convencido de que a conclusão do projeto do ICGC também será de enorme valor para toda a comunidade científica. Os dados esperados desse esforço seriam milhares de alterações genéticas (mutações pontuais, inserções/deleções, rearranjos cromossômicos, e variações do número de cópias) que podem ser "passageiros" (vasta maioria, não causador) ou "condutores" (muito poucos, causador). Quem distinguirá os "condutores" dos "passageiros" e como? Thomas Hudson: Evidência estatística dos "condutores" contra "passageiros" requer a detecção dos genes que estão mutados em uma frequência mais alta do que a taxa de mutação base. Na fase do projeto do ICGC, foi considerado importante que cada projeto teria o poder de detectar genes mutados ao nível de 3%, um nível que é mais alto do que a taxa de mutação base (estimada ser menos do que 1 mutação por gene para um tamanho de amostra de 500). Validação funcional dos condutores, particularmente aqueles que podem ser clinicamente relevantes, está fora do âmbito do ICGC. Pesquisadores básicos de clínicas criarão um amplo espectro de estudos que avaliarão os genes do câncer. É antecipado que métodos de alta produtividade (tais como testes de interferência do RNA) serão importantes para priorizar objetivos, dado o alto número

6 de genes mutados que precisarão de investigações adicionais. Olli Kallioniemi: Parte da resposta será alcançada através da análise bioinformática dos dados reais do ICGC e da integração desses dados com outros grupos de dados independentes. A disponibilidade pública dos dados do ICGC permite que qualquer biólogo associe seus achados específicos sobre genes, proteínas, e vias com os dados do ICGC. Desse modo, a biologia celular global e a comunidade de pesquisa do câncer eventualmente ajudarão a separar os principais eventos condutores. Estudos funcionais nas culturas celulares do câncer, tais como interferência do RNA na escala do genoma de alta produtividade, ajudará a separar as principais mutações condutoras. Meu ponto de vista pessoal é que muitas das raras mutações que nós atualmente consideramos "mutações de passageiros" com base em considerações teóricas e estatísticas podem eventualmente vir a contribuir para alguns aspectos da biologia tumoral, desse modo sendo eventualmente marcadas como "condutoras." Edison Liu: O resto da comunidade fará a separação. Essa informação, como o HapMap, fornecerá conhecimento verdadeiramente capacitado para a comunidade científica maior explorar. Carlos López-Otín: Hoje em dia, a discriminação entre mutações condutoras e passageiras é uma difícil tarefa. Validação funcional nas culturas celulares ou em modelos animais definitivamente fornecerá uma resposta para esse problema. Entretanto, aquelas abordagens são geralmente consumidoras de tempo e caras, embora necessárias. Estudos anteriores sobre os genes condutores mostraram que a maioria dos genes condutores aparece mutado em diferentes pacientes com o mesmo tipo de tumor. No projeto do ICGC, um número mínimo de 500 pacientes por tipo de tumor foi selecionado para o sequenciamento porque com esse número será possível identificar genes que mostrem estatisticamente mais mutações do que se esperaria por acaso com base no tamanho do gene. Presume-se que dentro do ICGC cada membro deva ser capaz de identificar aqueles genes que são recorrentemente mutados em pelo menos 3% dos pacientes. Além disso, todos os dados gerados pelo ICGC ficarão disponíveis para toda a comunidade, e meta análise de diferentes tipos de tumores para identificar genes recorrentemente mutados através dos tipos de tumores será realizada ou por membros do ICGC ou por qualquer outro pesquisador. Com essa abordagem, é provável que muitos pacientes tenham mutações nos genes que não estejam recorrentemente mutados em outros tumores, mesmo assim possam ser o condutor para aquele tumor específico. Existem 2 iniciativas para se lidar com esses genes: A primeira é estudar as vias de sinalização e não apenas genes individuais, visto que o resultado pode ser similar se 2 genes fizerem parte da mesma via. Um grupo no ICGC realizará aquele tipo de análise, e os dados também estarão disponíveis para a comunidade. A segunda será realizar análises funcionais daqueles genes nas células ou em modelos animais. Alguns acreditam que o melhor resultado estrondoso para o dólar poderia ser alcançado patrocinando-se pesquisadores individuais (tais como subvenções NIH RO1) em vez de grandes consórcios e aconselhar esperar até que os custos do sequenciamento estejam ainda mais reduzidos. Por exemplo, o genoma humano poderia ter sido completado hoje, em vez de 10 anos atrás, com <0.1% de seu custo, poupando bilhões de dólares. O que você diz? Thomas Hudson: Essa pergunta foi debatida extensivamente por agências patrocina-

7 doras e cientistas na fase de planejamento do ICGC ( ). As reduções drásticas nos custos do sequenciamento foram antecipadas, e foi importante decidir "quando" o projeto deveria começar. Projetos-piloto nos Estados Unidos e no Reino Unido claramente mostraram a importância de se organizar cedo. Também foi reconhecido que os principais gargalos e custos se moveriam do sequenciamento do genoma para as coletas de amostras, armazenamento de dados, e análise. Finalmente, foi reconhecido que seria mais caro para as agências patrocinadoras patrocinarem grandes números de laboratórios que fazem seu próprio sequenciamento e que esses projetos geralmente não satisfariam os baixos custos e padrões mais altos que podem ser alcançados e monitorados em centros maiores ou que resultaria em disseminação generalizada dos dados para uma grande comunidade de usuários. Escolher o equilíbrio certo dos investimentos estratégicos, tais como projetos do ICGC e de pesquisa orientada pelo investigador, foi uma questão de debate em todo país participante. A divisão dos custos do projeto (atualmente $400 milhões em 12 países; custos projetados durante uma década de $1 bilhão) torna o projeto mais acessível para as agências patrocinadoras. De uma perspectiva econômica, uma mera redução de 1% na mortalidade por câncer pouparia quase $500 bilhões para os atuais e futuros Canadenses e Americanos (e supostamente trilhões no mundo todo). Uma infusão de $1 bilhão para a pesquisa do genoma do câncer para empreender uma "guerra contra o câncer" mais eficaz claramente produziria um excelente retorno sobre o investimento. Olli Kallioniemi: Ambos os tipos de esquemas de patrocínio são necessários, e eles não devem ser considerados como alternativas. Tecnologia dirige o progresso na ciência genômica, e as necessidades científicas farão a tecnologia mudar. A descoberta não pode esperar, e sempre será mais caro no começo. Sem exemplos como o Projeto do Genoma Humano, nenhuma de nossas atuais tecnologias de sequenciamento teria evoluído até o ponto em que estão hoje. O sequenciamento de tumores está agora parecendo muito realista e acessível e será muito mais barato em 3 5 anos. Produtividade do sequenciamento passou por uma melhora exponencial nos últimos 5 anos, com um correspondente declínio nos custos por base, e essas tendências muito provavelmente continuarão por mais alguns anos. Edison Liu: Eu discordo dessa afirmação. A única razão pela qual o sequenciamento é muito melhor agora do que há 10 anos atrás é porque existiram de fato condutores científicos e monetários para desenvolver as tecnologias de sequenciamento da próxima geração na ausência de qualquer utilidade clínica óbvia. Além disso, um atraso de 10 anos na divulgação do genoma humano teria significado um atraso de 10 anos em nossas descobertas e avanços científicos. Literalmente cada aspecto da biologia humana depende da informação da sequência. Deve haver um equilíbrio entre ciência grande e ciência individual. Não podemos otimamente realizar um sem o outro. Carlos López-Otín: O genoma humano tem catalisado a pesquisa em muitas áreas e tem provavelmente poupado bilhões de dólares no sequenciamento para os laboratórios individuais, acelerando a identificação dos genes implicados na doença. Um equilíbrio adequado é necessário, mas esse aspecto foi extensivamente discutido durante a fase de planejamento da iniciativa do ICGC. Notas de Rodapé 12 Abreviações não padronizadas:icgc, Consórcio Internacional do Genoma do

8 Câncer; OICR, Instituto de Ontário para Pesquisa do Câncer RFN1RFN1 Contribuições dos Autores: Todos os autores confirmaram que eles contribuíram para o conteúdo intelectual desse paper e satisfizeram os 3 seguintes requisitos: (a) contribuições significantes para a concepção e design, aquisição de dados, ou análise e interpretação dos dados; (b) rascunhando ou revisando o artigo para conteúdo intelectual; e (c) aprovação final do artigo publicado. Revelações dos Autores de Potenciais Conflitos de Interesse: Na submissão do manuscrito, todos os autores completaram o formulário de Revelações de Potenciais Conflitos de Interesse. Potenciais conflitos de interesse: Emprego ou Liderança: Nada a declarar. Consultor ou Papel Consultivo: O. Kallioniemi, Medisapiens; E.T. Liu, Lilly Singapore Centre for Drug Discovery and Veracyte. Posse dos Valores: O. Kallioniemi, Medisapiens. Honorários: Nada a declarar. Fundo de Pesquisas: O. Kallioniemi, Bayer Schering Pharma and Hoffman-La Roche. Testemunho Hábil: Nada a declarar. Outras Remunerações: O. Kallioniemi, intellectual property rights, patent, and licensing relationship with Vysis/Abbott Laboratories on fluorescence in situ hybridization/comparative genomic hybridization. Papel do Patrocinador: As organizações patrocinadoras não desempenharam papel algum no design do estudo, escolha dos pacientes inscritos, revisão e interpretação dos dados, ou preparação ou aprovação do manuscrito. Recebido para publicação em 25 de Agosto de Aceito para publicação em 25 de Agosto de This article has been translated with the permission of AACC. AACC is not responsible for the accuracy of the translation. The views presented are those of the authors and not necessarily those of the AACC or the Journal. Reprinted from Clin Chem, 2010; 56 no , by permission of AACC. Original copyright 2010 American Association for Clinical Chemistry, Inc. When citing this article, please refer to the original English publication source in the journal, Clinical Chemistry. Este artigo foi traduzido com a permissão da AACC. AACC não é responsável pela acurácia da tradução. Os pontos de vista apresentados são aqueles dos autores e não necessariamente os da AACC ou do Jornal. Reimpresso da ClinChem, 2010; 56 no , por permissão da AACC. Cópia original 2010 American Association for Clinical Chemistry, Inc. Quando citar este artigo, por favor refira-se à fonte de publicação original em inglês na revista,clinical Chemistry.