Influência de um bloqueador do transporte de elétrons na variação diurna da fotossíntese líquida e da fluorescência da clorofila

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1 Influência de um bloqueador do transporte de elétrons na variação diurna da fotossíntese líquida e da fluorescência da clorofila Fotossíntese INTRODUÇÃO JOÃO PAULO DE SOUZA Doutorando do Programa de Pós-Graduação em Ecologia e Recursos Naturais, UFSCar, joaopaulobio@hotmail.com CARLOS HENRIQUE B. A. PRADO Professor Associado I do Departamento de Botânica da Universidade Federal de São Carlos, UFSCar prado_chba@yahoo.com.br Publicado em maio de O desempenho de converter energia luminosa em química do aparato fotossintético para o uso na redução de CO 2 em carboidratos pode ser alterado em função de estresses ambientais. A atrazina (um herbicida) na folha é um fator de estresse, agindo por meio de ligação ao sítio da plastoquinona na proteína D 1 1 no centro de reação 1 Proteína integrante do corpo central do fotossistema II (peso molecular 33 kda). 1

2 F I S I O L O G I A V E G E T A L do fotossistema II, o que impede o fluxo de elétrons entre os fotossistemas II e I. Como resultado da ação da atrazina, a eficiência fotoquímica potencial e efetiva do fotossistema II em converter energia luminosa em química é diminuída. A irradiância absorvida que não é direcionada para as reações fotoquímicas pode (e deve) ser dissipada na forma de calor e de fluorescência da clorofila. A fluorescência da clorofila é uma eficiente ferramenta para a detecção de mudanças do desempenho fotossintético, principalmente quando acompanhada pela determinação das trocas gasosas foliares. Para detalhes dos parâmetros da fluorescência da clorofila consulte o texto específico na obra impressa O estudo da fluorescência da clorofila e a detecção de estresses ambientais em plantas, no final do capítulo de fotossíntese. A assimilação de carbono fica comprometida sem a formação acoplada de ATP (molécula energética) e NADPH (molécula redutora) em função da inibição do transporte de elétrons entre os fotossistemas II e I. Assim, ocorre uma diminuição significativa na capacidade de redução de CO 2 em carboidrato por meio do ciclo de Calvin. Ao final, com a diminuição da fotossíntese líquida induzida pela ação da atrazina, o balanço de carbono da folha tende a ser cada vez menos positivo e o CO 2 a se acumular na câmara estomática. Nesta aula prática, serão investigadas as alterações provocadas pela atrazina no direcionamento da energia radiante para as reações fotoquímicas e a conseqüente diminuição da assimilação de carbono em uma espécie arbustiva, Hibiscus rosa-sinensis, no período diurno. Por meio das trocas gasosas foliares poderemos acompanhar a assimilação líquida de carbono simultaneamente às determinações da fluorescência da clorofila em exemplares livres de atrazina (controle) e em exemplares submetidos a diferentes doses de atrazina. 2

3 OBJETIVOS I N F L U Ê N C I A D E U M B L O Q U E A D O R D O T R A N S P O R T E D E E L É T R O N S O objetivo principal desta aula prática complementar é o de avaliar o efeito da atrazina nas fases fotoquímica (por meio da fluorescência da clorofila) e bioquímica (por meio das trocas gasosas de CO 2 ) da fotossíntese durante o período diurno em uma espécie arbustiva (Hibiscus rosa-sinensis). Será verificada a possível relação entre o decréscimo no fluxo de transporte de elétrons (FTE) entre os fotossistemas II e I, a diminuição da fotossíntese líquida (A) e o acúmulo de CO 2 na câmara subestomática. Outro objetivo é o de verificar como o excesso de energia radiante estará sendo dissipado frente ao impedimento do transporte de elétrons, se por meio do aumento da dissipação de energia na forma de calor (extinção não fotoquímica da energia radiante, ENF) ou pelo aumento da emissão da fluorescência basal (F o ) ou máxima (F m ). PROCEDIMENTOS a) Confeccionar quinze etiquetas (2,0 x 1,0 cm) de marcação, as quais devem ser furadas em uma das extremidades para serem fixadas em ramos. Cinco etiquetas devem ser marcadas com dose 0, cinco com dose 5 e cinco com dose 250. b) Preparar soluções de atrazina nas concentrações de 5 e 250 g L -1 (gramas de atrazina por litro de solução). Pode-se utilizar qualquer produto comercial a base de atrazina (Atranex, Atrazina Nortox, Gesaprim). É importante notar a concentração do produto utilizado. Nesta aula prática será utilizado o herbicida Gesaprim (concentração comercial de 500 g L -1 ). Preparar 200 ml de cada concentração em um béquer de 250 ml (a atrazina é tóxica, usar luvas e avental para manipulação). Fotossíntese 3

4 F I S I O L O G I A V E G E T A L c) Selecionar 15 ramos de Hibiscus rosa-sinensis L. (Malvaceae). Esta espécie foi escolhida pela facilidade de obtenção (utilizada, em geral, como cerca viva). Porém, qualquer espécie lenhosa, arbustiva ou arbórea, pode ser usada para este experimento. Espécies herbáceas são muito sensíveis e, portanto, não recomendadas para este tipo de experimento. Etiquetar apenas uma folha totalmente expandida, livre de herbivoria e de patógenos em cada ramo. Cada dosagem deverá ser aplicada em cinco folhas diferentes (cada uma em um ramo), sendo que cinco folhas serão o controle (dose 0). A aplicação da solução deve ser feita por meio de imersão total da folha no béquer contendo a solução, por 30 segundos. d) As medições da fluorescência da clorofila e das trocas gasosas devem ser realizadas em dia claro, no quinto dia após a aplicação da atrazina. No curso diurno das trocas gasosas e da fluorescência da clorofila as medições devem ser realizadas entre 8 e 18 h com intervalos de 2 horas. Todas as quinze folhas marcadas com as três diferentes doses devem ser medidas ao longo do dia. e) Para as medidas das trocas gasosas utilizaremos o analisador de gases por infravermelho (IRGA, do inglês infra red gas analyzer), modelo LCA-4, da firma Analytical Development Company (ADC), Hoddesdon, UK (Figura 1). Neste modelo, todas as variáveis das trocas gasosas são calculadas de forma automática pelo IRGA. Para comentários das fórmulas utilizadas pelo IRGA (e uma planilha de cálculo contendo estas fórmulas em Excel) consulte a aula prática complementar 1 neste site, no capítulo de fotossíntese: Trocas gasosas e fluorescência da clorofila. f) A câmara foliar utilizada será do modelo PLCB-4 (Figura 1B), porém, dependendo da morfologia da folha em outra espécie, pode ser necessário utilizar outro modelo de câmara em que a folha é capaz de cobrir toda a área de trabalho. Qualquer modelo de IRGA 4

5 I N F L U Ê N C I A D E U M B L O Q U E A D O R D O T R A N S P O R T E D E E L É T R O N S Fotossíntese Figura 1 A) Analisador de gases por infravermelho (IRGA), modelo LCA-4, com a câmara foliar PLCB-4 abaixo. Neste modelo, o computador do IRGA realiza os cálculos das variáveis das trocas gasosas de forma automática. Para comentários das fórmulas utilizadas pelo IRGA e uma planilha de cálculo contendo estas fórmulas em Excel consulte a aula prática complementar 1 neste site, no capítulo de fotossíntese: Trocas gasosas e fluorescência da clorofila. B) Câmara foliar PLCB-4 com a folha de Hibiscus rosa-sinensis. Note o sensor do fluxo de fótons na câmara (pequeno círculo branco no meio da câmara foliar). pode ser utilizado. Para exemplos de vários modelos de IRGA consulte neste site (no capítulo de fotossíntese) o item equipamentos. g) Antes de iniciar o experimento verifique a carga das baterias, a limpeza das câmaras, as conexões elétricas e gasosas e as colunas químicas do IRGA. Fazer a calibração do CO 2 e H 2 O antes do início das medições. Verifique também o espaço de memória e as variáveis a serem mostradas no visor do IRGA (configuração), bem como os valores iniciais necessários para o IRGA realizar os cálculos (como o valor da resistência da camada fronteiriça). 5

6 F I S I O L O G I A V E G E T A L h) Ligue o IRGA, faça a determinação do zero de CO 2 e certifique-se de que a cânula (haste fina de cerca de 4 m de altura) para obtenção do volume de ar de referência está distante de qualquer fonte de CO 2. Introduza a folha na câmara PLCB-4 do IRGA (Figura 1B) e espere até que os valores da fotossíntese líquida estabilizem (cerca de 30 segundos). Após esse período (se os valores estiverem estáveis), registrar as variáveis das trocas gasosas. A densidade do fluxo de fótons fotossinteticamente ativos (DFFFA) será determinada por meio de um sensor de luz acoplado na parte superior da câmara foliar (Figura 1B). i) Para a transferência dos dados utilize o cabo de conexão e o programa de comunicação entre o IRGA e o computador. As variáveis das trocas gasosas utilizadas nessa aula prática são: fotossíntese líquida (A, μmol m -2 s -1 ), condutância estomática (g s, mol m -2 s -1 ), transpiração (E, mmol m -2 s -1 ), concentração intercelular (C i, μmol mol -1 ) e ambiente (C e, μmol mol -1 ) de CO 2. j) Para as medições da fluorescência da clorofila será utilizado o fluorômetro de luz modulada modelo PAM-2000, da firma Heinz Walz, Alemanha (Figura 2A). No entanto, qualquer fluorômetro de luz modulada poderá ser utilizado. A DFFFA e a temperatura foliar serão determinadas com o suporte de clipe foliar do PAM-2000, modelo 2030-B (Heinz Walz, Alemanha, Figura 2D). k) Coloque um clipe de escurecimento fechado em cada folha trinta minutos antes das medições (Figura 2B). Se a folha estiver suja com a solução de atrazina na epiderme superior (superfície adaxial) limpe a área do clipe com um algodão com pouca umidade. Ligue o fluorômetro e verifique se a fibra óptica, o suporte de clipe foliar e o computador portátil estão corretamente conectados. Uma tela com todos os parâmetros da fluorescência da clorofila aparecerá no visor do computador. 6

7 I N F L U Ê N C I A D E U M B L O Q U E A D O R D O T R A N S P O R T E D E E L É T R O N S Fotossíntese Figura 2 A) Fluorômetro de luz modulada, modelo PAM-2000, com a fibra óptica e o clipe foliar 2030-B. B) Folha de Hibiscus rosasinensis com o clipe de escurecimento fechado. C) Fibra óptica acoplada ao clipe de escurecimento (clipe aberto). D) Clipe foliar 2030-B (note o sensor do fluxo de fótons logo abaixo da fibra óptica, no centro da área anelada pelo clipe). l) Encaixe a fibra óptica no clipe de escurecimento (abra o clipe de escurecimento, Figura 2C) e aperte a tecla M no computador, este comando liga um pulso de luz saturante sobre a folha pré-adaptada ao escuro. No visor aparecerão os valores da fluorescência basal (F o ) e máxima (F m ) em folhas pré-adaptadas ao escuro, e os valores da eficiência fotoquímica potencial do fotossistema II, calculada por meio da equação F m -F o /F m. O valor resultante da subtração de F m -F o é denominado fluorescência variável (F v ). 7

8 F I S I O L O G I A V E G E T A L m) Logo após o desligamento da luz saturante, retire a fibra óptica do clipe de escurecimento e encaixe no suporte de clipe foliar 2030-B em uma outra área da folha sob irradiância natural correspondente ao horário do dia (Figura 2D). Prenda a folha com o suporte de clipe foliar e pressione a tecla Y. Será então aplicado outro pulso de luz saturante (na folha sob luz). Aparecerá na tela do computador os valores da fluorescência máxima sob luz (F m ) e a eficiência fotoquímica efetiva do fotossistema II (Yield, em inglês). A eficiência fotoquímica efetiva do fotossistema II é calculada pela fórmula ΔF/F m, o mesmo que (F m -F t )/F m, sendo que F t representa o rendimento estável (após atingir várias vezes o mesmo valor) da fluorescência depois de vários pulsos de saturação sob iluminação. Também será mostrado o fluxo de transporte de elétrons (FTE= ΔF/F m x DFFFA x 0,5 x 0,84). O valor 0,5 representa a partição igual da irradiância absorvida entre os fotossistemas II e I e 0,84 é o valor que representa 84% de irradiância incidente absorvida pelos fotossistemas (valor aproximado para a maioria das folhas). Para mais detalhes dos cálculos das variáveis da fluorescência da clorofila consulte o texto específico O estudo da fluorescência da clorofila e a detecção de estresses ambientais em plantas, no final do capítulo de fotossíntese, na obra impressa. n) O valor da extinção não fotoquímica (ENF) da energia radiante absorvida pelos fotossistemas é obtido por meio da seguinte fórmula: ENF = (F m -F m )/F m. Para a transferência dos dados utilize o cabo de conexão e o programa de comunicação entre o PAM e um microcomputador. RESULTADOS a) Os dados coletados não apresentaram distribuição normal. Desta forma, foi aplicada uma análise de variância não paramétrica 8

9 I N F L U Ê N C I A D E U M B L O Q U E A D O R D O T R A N S P O R T E D E E L É T R O N S (Kruskal-Wallis) a fim de verificar diferenças significativas dos valores médios de trocas gasosas e fluorescência da clorofila entre os tratamentos com e livre de atrazina. b) Os valores da DFFFA determinados pelo IRGA atingiram μmol m -2 s -1 às 14 h (Figura 3) em função de poucas nuvens no dia das medições. A maior temperatura do ar também foi registrada às 14 h. Houve um aumento da transpiração (E) entre 12 e 14 h e um declínio da condutância estomática (gs) e dos valores da razão Ci/ Ce entre 10 e 16 h. Porém, não foi observado declínio nos valores médios da fotossíntese líquida (A) durante o meio-dia (Figura 3). c) Os parâmetros mais afetados das trocas gasosas pela aplicação da atrazina foram A e Ci/Ce (Tabela 1). Os valores de A em folhas livres de atrazina foram sempre maiores que nas folhas tratadas com atrazina (5 e 250 g L -1 ) no período diurno. O contrário ocorreu com a razão Ci/Ce, que foi maior em folhas sob atrazina em relação ao controle (Figura 3). A dose de 5 g L -1 foi suficiente para a redução significativa dos valores de A e da razão Ci/Ce ao longo do dia. No entanto, apenas sob 250 g L -1 foi verificado decréscimo nos valores de E e gs (Tabela 1). d) O declínio dos valores médios do FTE, ΔF/F m, F v /F m e ENF ocorreu entre 10 e 14 h (Figura 4). Porém, F o e F m não apresentaram diminuição durante esse período (Figura 4). As folhas sem aplicação de atrazina apresentaram ao longo do dia maiores valores de FTE, ΔF/F m, F v /F m e ENF em relação às folhas sob atrazina (5 e 250 g L -1, Figura 4). Porém, os valores de F o foram sempre menores nas folhas livres de atrazina (controle). e) A dose de 5 g L -1 foi suficiente para uma redução significativa dos valores de FTE, ΔF/F m, F v /F m e ENF, porém, a dose de 250 g L -1 de atrazina não causou maior redução nos valores de FTE, ΔF/F m e ENF em relação à dose de 5 g L -1 (Tabela 2). Fotossíntese 9

10 F I S I O L O G I A V E G E T A L Figura 3 Curso diário das trocas gasosas em folhas de Hibiscus rosasinensis sob diferentes doses de atrazina, controle ( ), dose 5 g L -1 ( ) e dose 250 g L -1 ( ), na estação chuvosa em março de Densidade do fluxo de fótons fotossinteticamente ativos (DFFFA), temperatura do ar (Tar), fotossíntese líquida (A), razão da concentração de CO 2 intercelular (Ci) e ambiente (Ce), transpiração (E) e condutância estomática ao vapor de água (gs). Os asteriscos indicam diferenças significativas entre as médias de cada tratamento em cada horário (P < 0,05). Os símbolos representam as médias e as linhas abaixo e acima dos símbolos representam o erro padrão. 10

11 I N F L U Ê N C I A D E U M B L O Q U E A D O R D O T R A N S P O R T E D E E L É T R O N S Tabela 1. Valores médios (+ erro padrão) dos parâmetros das trocas gasosas em folhas de Hibiscus rosa-sinensis sob diferentes doses de atrazina ao longo do dia. Letras diferentes indicam diferenças significativas entre os valores das variáveis analisadas (P < 0,05). Fotossíntese líquida (A), razão entre a concentração interna (Ci) e externa (Ce) de CO 2 (Ci/Ce), transpiração (E) e condutância estomática (gs). Controle e A Ci/Ce E gs doses (g L -1 ) Controle 2,10+0,27 A 0,78+0,03 A 1,04+0,06 A 0,147+0,02 A Dose 5-0,47+0,09 B 1,00+0,01 B 1,14+0,09 A 0,198+0,05 A Dose 250-1,01+0,36 C 1,22+0,10 C 0,78+0,07 B 0,108+0,03 B Tabela 2. Valores médios (+ erro padrão) dos parâmetros da fluorescência da clorofila em folhas de Hibiscus rosa-sinensis sob diferentes doses de atrazina. Letras diferentes indicam diferenças significativas entre os valores dos parâmetros analisados (P < 0,05). Fluxo de transporte de elétrons (FTE), eficiência fotoquímica efetiva do fotossistema II (ΔF/F m ), fluorescência basal (F o ) e máxima (F m ) em folhas pré-adaptadas ao escuro, eficiência fotoquímica potencial do fotossistema II (F v /F m ) e extinção não-fotoquímica da energia radiante (ENF). Controle e FTE ΔF/F m F o F m F v / F m ENF doses (g L -1 ) Controle 6,99+1,56A 0,09+0,01A 0,62+0,03B 2,11+0,08B 0,70+ 0,01A 2,56+0,15A Dose 5 1,82+0,63B 0,03+0,01B 0,87+0,03A 2,27+0,51A 0,50+0,01B 1,93+0,11B Dose 250 1,86+0,67B 0,05+0,01B 0,85+0,03A 1,37+0,07C 0,24+0,02C 1,55+0,07B Fotossíntese 11

12 F I S I O L O G I A V E G E T A L Figura 4 Curso diário do comportamento da fluorescência da clorofila em folhas de Hibiscus rosa-sinensis sob diferentes doses de atrazina, controle ( ), dose 5 g L -1 ( ) e dose 250 g L -1 ( ), na estação chuvosa em março de Densidade do fluxo de fótons fotossinteticamente ativos (DFFFA), temperatura do ar (Tar), fluxo de transporte de elétrons (FTE), extinção não-fotoquímica da energia radiante (ENF), fluorescência basal (F o ) e fluorescência 12

13 I N F L U Ê N C I A D E U M B L O Q U E A D O R D O T R A N S P O R T E D E E L É T R O N S máxima após escurecimento (F m ), eficiência fotoquímica potencial (F v /F m ) e eficiência fotoquímica efetiva (ΔF/F m ) do fotossistema II. Os asteriscos indicam diferenças significativas entre as médias em cada horário (P < 0,05). Os símbolos representam as médias e as linhas abaixo e acima dos símbolos representam o erro padrão. Fotossíntese Os valores de Fm aumentaram com a dose de 5 g L -1 e sofreram forte redução sob 250 g L -1 (Tabela 2). Os valores de F o aumentaram com a aplicação da dose de 5 g L -1, mas a concentração de 250 g L -1 não condicionou valores maiores de F o. f) A maior eficiência fotoquímica (potencial e efetiva) do fotossistema II nas folhas livres de atrazina ocorreram pela manhã (Figura 4); o mesmo aconteceu com o FTE nestas folhas. As folhas controle apresentaram maior assimilação de carbono (fotossíntese líquida positiva e menor concentração de Ci na câmara subestomática) no período diurno em relação às folhas submetidas a atrazina. As folhas sob ação da atrazina não apresentaram valores positivos de fotossíntese líquida ao longo do dia, mas maiores valores da relação Ci/Ce. Os valores negativos de A nas folhas tratadas com atrazina indicam que estas estão apenas respirando e fotorrespirando. DISCUSSÃO a) A atrazina atua como um desacoplador do transporte de elétrons entre os fotossistemas II e I por meio de sua ligação com a plastoquinona. Como conseqüência, a formação acoplada de ATP e NADPH é seriamente impedida, mesmo sob irradiância intensa, 13

14 F I S I O L O G I A V E G E T A L comprometendo a fixação de carbono pelo ciclo de Calvin no estroma do cloroplasto. Portanto, folhas sob ação da atrazina perdem a eficiência dos fotossistemas na conversão de energia radiante em química (produção de ATP e NADPH), apresentando menores valores de eficiência fotoquímica potencial e efetiva (menores valores de F v /F m e ΔF/F m, respectivamente, Tabela 2). b) O impedimento da formação de ATP e de NADPH sob a ação da atrazina pode ser evidenciado pelos valores reduzidos do fluxo de transporte de elétrons (FTE) entre os fotossistemas II e I (Figura 4). Como conseqüência da escassez de ATP e de NADPH, a fotossíntese líquida diminui (menor assimilação de CO 2 ), causando um balanço de carbono desfavorável para o crescimento (valores negativos de assimilação, as folhas apenas respiram ao longo do dia, Tabela 1). O CO 2 intercelular que não é assimilado (convertido em carboidrato) no ciclo de Calvin é acumulado nos espaços intercelulares, aumentando a razão Ci/Ce em folhas sob atrazina (Tabela 1). c) A condutância estomática diminuiu em folhas com aplicação de atrazina em função do acúmulo de CO 2 nos espaços intercelulares. Sob altas concentrações de CO 2 na câmara subestomática o poro estomático tende a se fechar (Salisbury e Ross, 1992). Alta pressão parcial de CO 2 na câmara subestomática indica alta disponibilidade de carbono para o aparato estomático realizar o processo fotossintético, e o acesso ao CO 2 atmosférico poderá diminuir sem prejuízo da assimilação de carbono e com menor perda de água (fechamento do poro). Esse tipo de mecanismo de controle de abertura do poro estomático é denominado circuito do CO 2 e compete com o circuito do ABA no controle da abertura estomática. d) A energia radiante em excesso é reemitida na forma, principalmente, de fluorescência basal (aumento dos valores de F o ) e con- 14

15 I N F L U Ê N C I A D E U M B L O Q U E A D O R D O T R A N S P O R T E D E E L É T R O N S seqüente diminuição da subtração F m -F o e dos valores de F v /F m nas folhas sob atrazina (Figura 4 e Tabela 2). O aumento na dissipação da irradiância pela fluorescência da clorofila (aumento de F o ) ocorre em função das moléculas de atrazina ligarem-se às moléculas de plastoquinona, impedindo o FTE entre os fotossistemas II e I. O aumento de F o ocorre como forma de dissipar a irradiância absorvida. Os fotossistemas não podem utilizar a energia luminosa na via fotoquímica devido ao bloqueio do fluxo eletrônico entre os fotossistemas II e I pela atrazina. A dissipação via aumento acentuado de F o no sistema antena impede a separação de cargas no centro de reação do fotossistema II e o acúmulo de prótons H + no lúmen do tilacóide. e) A variável ΔF/F m apresentou o mesmo comportamento que FTE sob atrazina. Os valores de ΔF/F m representam a parte da energia radiante que é efetivamente convertida em energia química na via fotoquímica. Mesmo com os centros de reação abertos (oxidados, sem os elétrons), a energia radiante não pode ser convertida em ATP, pois a atrazina estava ligada ao carregador de elétrons plastoquinona nos centro de reação do fotossistema II (Heldt, 2004). Com o impedimento da redução da plastoquinona, o fluxo linear de elétrons entre os fotossistemas II e I fica comprometido, diminuindo a eficiência dos fotossistemas de converter energia luminosa em química. Como as variáveis FTE e ΔF/F m são inter-relacionadas (ΔF/F m é usada para o cálculo do FTE), observa-se o mesmo padrão de decréscimo para ambas. f) A energia radiante excessiva que não é utilizada na via fotoquímica pode ser liberada na forma de calor (Maxwell e Johnson, 2000). A energia radiante em excesso liberada na forma de calor não foi uma via importante em Hibiscus rosa-sinensis nas folhas tratadas com atrazina, pois não houve aumento nos valores de ENF. Esta forma não fotoquímica de dissipação de energia ra- Fotossíntese 15

16 F I S I O L O G I A V E G E T A L diante em excesso foi utilizada principalmente pelas folhas livres de atrazina (controle). Assim, a aplicação da atrazina diminuiu um importante mecanismo de dissipação da energia radiante (ENF, geração de calor). Portanto, há neste experimento uma inversão na forma não-fotoquímica de dissipação da irradiância excessiva. Nos exemplares sob atrazina, esta dissipação é principalmente via F o (rápida extinção da irradiância, em função dos fotossistemas não poderem converter a energia luminosa em química) e nas folhas livre de atrazina a dissipação é pela via da extinção não fotoquímica (ENF). AGRADECIMENTOS Os autores agradecem o Dr. Rafael Vasconcelos Ribeiro, pela leitura crítica e sugestões ao manuscrito, e o CNPq pela bolsa de doutoramento e produtividade em pesquisa ao primeiro e segundo autores, respectivamente. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS HELDT, H-W. Plant biochemistry. San Diego, Elsevier, p. MAXWELL, K.; JOHNSON, G.N. Chlorophyll fluorescence a practical guide. Journal of Experimental Botany 2000; 51: SALISBURY, F.B.; ROSS, C.W. Plant physiology. Belmont: Wadsworth, p. 16