EFEITO DO CONSUMO MATERNO E PATERNO DE EXTRATO DE AMORA PRETA (Rubus spp.) NOS MARCADORES ANTIOXIDANTES DA PROLE FEMININA

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1 EFEITO DO CONSUMO MATERNO E PATERNO DE EXTRATO DE AMORA PRETA (Rubus spp.) NOS MARCADORES ANTIOXIDANTES DA PROLE FEMININA Orientadora: Prof. Dr. Neuza Mariko Aymoto Hassimotto, Autora: Sara Lima Anacleto, Colaboradores: Vanessa Cardoso Pires, Prof. Dr. Thomas Prates Ong Resumo Universidade de São Paulo/ Faculdade de Ciências Farmacêuticas sara.lima@usp.br O presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito do consumo de extrato de amora preta (EA) por camundongos fêmeas durante a gestação e de camundongos machos antes do acasalamento (35 dias), na prole feminina, na modulação das enzimas antioxidantes. As antocianinas e os elagitaninos foram os compostos majoritários na fruta, apresentando concentrações de 5 mg/ g e 44 mg/ g b.u., respectivamente. Dentre as antocianinas, a cianidina 3-glucosídeo foi identificada como composto majoritário. Após o tratamento dos camundongos com o EA, na concentração de,84g antocianinas totais/l, houve aumento significativo (p<,5) na atividade SOD, no fígado, de aproximadamente 5% nos machos tratados em relação aos machos não tratados. Entretanto, nas fêmeas tratadas com EA, observou-se diminuição de aproximadamente 33% na atividade em relação às fêmeas não tratadas. Esta diferença pode ser devido ao estado de prenhes da fêmea. Em testículos dos machos tratados com EA apresentaram diminuição significativa da atividade das enzimas CAT e SOD de aproximadamente 5% e 4%, respectivamente, em relação aos respectivos machos controle. Contudo, o tratamento com EA nos pais não influenciou a atividade das enzimas antioxidantes na prole feminina. Assim, o tratamento dos camundongos macho antes do acasalamento e das fêmeas durante a gestação aparentemente não influenciou na atividade das enzimas antioxidantes na prole feminina. Palavras Chaves: Amora preta, enzimas antioxidantes, catalase, glutationa peroxidase, superóxido dismutase. Abstract This study aimed to evaluate the effect of consumption of blackberry extract (EA) for female mice during pregnancy and male mice prior to mating (35 days), in female spawn, in the modulation of antioxidant enzymes. Anthocyanins and ellagitannins were the major compounds in blackberry, with concentrations of 5 mg/ g and 44 mg/ g f.w., respectively. Among the anthocyanins, cyanidin 3-glucoside was identified as the major compound. After treatment of mice with the EA at a concentration of.84 g total anthocyanins / L, a significant increase (p <.5) on SOD activity was observed in the liver of male treated when compared to untreated one (approximately 5% increase). However, in female mice treated with EA, it was observed a decrease on SOD activity (approximately 33%) when compared to untreated one. This difference may be due to the pregnancy condition. Testicle of male mice treated with EA showed a significant decrease in the CAT and SOD activities (approximately 5% and 4%, respectively), compared to their male control. However, treatment of parents with EA had not influenced the activity of antioxidant enzymes in female spawn. Thus, treatment of male mice prior to mating and during gestation apparently had not influenced on activity of the antioxidant enzymes in female spawn. Key words: Blackberry, antioxidant enzymes, catalase, glutathione peroxidase, superoxide dismutase. SIICUSP 4 º Simpósio Internacional de Iniciação Científica e Tecnológica da USP

2 Introdução A amora-preta é um fruto rico em compostos polifenois relacionados à proteção contra o estresse oxidativo no organismo. Esses compostos bioativos podem oferecer uma proteção direta através de sua propriedade antioxidante e/ou indireta, ativando os sistemas de defesa antioxidante endógeno, como as enzimas superóxido dismutase, glutationa peroxidase e a catalase. Essas enzimas formam o principal sistema de defesa do organismo contra efeitos nocivos da produção de espécies reativas de oxigênio. Objetivo Avaliar o efeito do consumo de extrato de amora preta por camundongos fêmeas durante a gestação e camundongos machos antes do acasalamento, na prole feminina, na modulação das enzimas antioxidantes. Material e Métodos A amora-preta (Rubus spp.) foi fornecida pelo Sítio do Belo (São Paulo) e mantido a - C até uso. Para a obtenção do extrato aquoso (EA) de amora-preta, uma porção de g de amostra foi triturada, com o auxílio de um liquidificador, com 3 ml de metanol 7% (MeOH) acidificado com ácido acético,% e posteriormente rotaevaporada a 4 C até completa remoção do MeOH. Em seguida, a amostra foi ressuspendida em água e armazenada a -8 C em ultrafreezer até seu uso. A extração de flavonoides foi realizada de acordo com o método descrito por Arabbi et al. (4), em duplicata, utilizando metanol 7% acidificado com ácido acético,%, com posterior separação em fase sólida utilizando resina de poliamida CC6 (CC 6, Macherey-Nagel). A quantificação e identificação de flavonoides, tanto no fruto quanto no EA, foi realizada por CLAE/DAD (sistema Agilent 6, com injetor automático e bomba quaternária, Hewlett-Packard, Palo Alto, CA). A coluna utilizada foi a Prodigy 5 ODS 3 (5 x 4,6 mm) (Phenomenex Ltd., Reino Unido), com fluxo de ml/min, temperatura de 5 C, e eluição com gradiente de solventes constituído por A: ácido fórmico,5% e B: acetonitrila acidificada com,5% de ácido fórmico. As corridas foram monitoradas nos comprimentos de onda de 7 nm e 55 nm. Os padrões utilizados foram cianidina 3-glucosídeo (Extrasynthese, Genay, France), quercetina e ácido elágico (Sigma-Aldrich). A identificação foi realizada pela similaridade do espectro de absorção e tempo de retenção. Os resultados foram expressos como média ± DP. Para o tratamento dos animais, camundongos machos receberam EA ad libitum, na concentração de,84g antocianinas/l, em substituição à água de beber (controle) logo após o desmame e por 35 dias consecutivos. Este projeto foi aprovado pelo Comitê em experimentação animal da FCF-USP (protocolo CEUA 4). Após este período, os machos foram acasalados com fêmeas formando quatro grupos. Foram 48 fêmeas e 4 machos no total. Grupo (controle: fêmeas controle acasaladas com machos controle); Grupo (Pai amora: fêmeas controle acasaladas com machos tratados com EA); Grupo 3 (Mãe amora: fêmeas que receberam EA acasaladas com machos controle); Grupo 4 (Pai e Mãe amora: fêmeas que receberam EA acasaladas com machos tratados com EA). Na ocasião da confirmação da prenhez os camundongos machos foram eutanasiados e os testículos, fígado e sangue foram coletados. Durante a gestação e amamentação, as mães tiveram acesso à ração comercial e EA ou água ad libitum, dependendo do grupo experimental. Após o nascimento, a prole feminina de todos os grupos foi desmamada, momento da eutanásia das mães e coleta de sangue e fígado. A prole feminina foi eutanasiada com 7 semanas de idade (n=6 de cada grupo) e o fígado e plasma foram coletados. Este protocolo foi aprovado pela CEUA-FCF-USP n 4). Os tecidos testicular e de fígado foram extraídos com tampão fosfato de potássio, M ph 7, e posterior análise da atividade enzimática da glutationa peroxidase (GPx) (Wendel, 98), catalase (CAT) (Adamo et al, 989) e superóxido dismutase (SOD) (Ewing e Janero, 995). O conteúdo de proteínas do fígado e testículo foram quantificadas pelo método de Bradford (Bradford, 976). SIICUSP 4 º Simpósio Internacional de Iniciação Científica e Tecnológica da USP

3 Resultados Na amora-preta foram identificadas quatro derivados de cianidina, entre eles, a cianidina 3- glucosídeo (cy 3-glu), como antocianina majoritária, três picos correspondentes a derivados do ácido elágico (AE), sendo um deles o próprio AE, e um pico de derivado de quercetina (Figura ). (B) 3 Figura. Cromatograma obtido por CLAE/DAD. 55 nm e (B) 7 nm. Picos identificados como () derivados de cianidina, () derivados do ácido elágico e (3) derivado de quercetina. A concentração de antocianinas na amora-preta foi de 4,86 ± 6,3 mg cy 3-glu eq/ g b.u., representando 9% do total de compostos fenólicos; e 6 ±,6 mg quercetina/ g b.u. Os elagitaninos corresponderam a fração majoritária (44 ± 6 mg ácido elágico eq/ g b.u. ou 75%). O EA apresentou o mesmo perfil de compostos fenólicos quando comparado ao fruto, entretanto apresentando a proporção de 34% antocianinas e 54% elagitaninos. SIICUSP 4 º Simpósio Internacional de Iniciação Científica e Tecnológica da USP

4 Atividade Enzimática Atividade Enzimática (B) (C) 8 (D) (E) 5 (F) Figura. Atividade das enzimas antioxidantes de fígado dos machos e fêmeas controle e tratados com EA (A, B, C) e da prole (D, E, F), expresso em UA/min/g proteína. Atividade Catalase (A e D), Glutationa Peroxidase (B e E) e Superóxido Dismutase (C e F) (n=6 animais). Grupos (Prole controle), (Pai amora), 3 (Mãe amora) e 4 (Pai e mãe amora). Diferença significativa p<,5 (ANOVA, post hoc Teste Tukey). Em relação à atividade SOD (Figura C), houve aumento significativo de aproximadamente 5% nos machos tratados com EA em relação aos machos controles. Entretanto, a atividade da SOD nas fêmeas tratadas com EA, apresentou diminuição de aproximadamente 33% em relação as fêmeas controles, mas este resultado não foi significativo. Essa diferença de resultados em machos e fêmeas tratados com EA em relação à atividade enzimática da SOD pode ser devido as diferentes condições que cada grupo esteve submetido no período de tratamento com EA. Enquanto os machos recebiam o EA já na fase adulta, as fêmeas só foram submetidas ao tratamento com EA durante a gestação. Não houve diferença significativa nas atividades das enzimas CAT e GPx (Figura A e B, respectivamente) nos machos e fêmeas controle e tratados. Não houve diferenças significativas nas atividades das enzimas antioxidantes CAT, SOD e GPx nos grupos da prole feminina em relação a prole controle (Figura D, E, F), mas observa-se que a prole do grupo (Pai amora) apresentou ligeira redução na atividade SOD, mas não significativa. Os testículos dos machos tratados com EA apresentaram diminuição significativa da atividade das enzimas CAT e SOD de aproximadamente 5% e 4% (Figura 3A e C), respectivamente, em relação aos respectivos machos controle. Já, a atividade enzimática da GPx (Figura 3B) não apresentou diferença significativa. 35 (C) SIICUSP 4 º Simpósio Internacional de Iniciação Científica e Tecnológica da USP

5 Atividade Enzimática (B Figura 3. Atividade das enzimas antioxidantes de testículo dos machos controle e tratados com EA expressos em UA/min/g proteína. Catalase, Glutationa Peroxidase (B) e Superóxido Dismutase (C) (n=6). Diferença significativa p<,5 (ANOVA). Conclusão Observa-se tanto no fruto quanto no EA, os elagitaninos correspondem a fração majoritária, seguida pelas antocianina. O tratamento com EA nos pais não influenciou a atividade das enzimas antioxidantes na prole, entretanto influencia na atividade dos pais de diferentes maneiras. Referências Bibliográficas Adamo A.M.; Llesuy S. F.; Pasquini J. M.; Boveris A. Brain chemiluminescence and oxidative stress in hyperthyroid rats. Biochemical Journal, 63, 73-7, 989. Brand-Williams W; Cuvelier M. E.; Berset C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity et al. Lebensm. Wiss. u.- Technol. 8, 5-3, 995. Ewing J.F.; Janero D.R. Microplate superoxide dismutase assay employing a nonenzymatic superoxide generator. Anal Biochem. 3, 43-8, 995. Wendel, A. Glutathione peroxidase. Methods Enzymol. 77, , 98. SIICUSP 4 º Simpósio Internacional de Iniciação Científica e Tecnológica da USP