AVALIAÇÃO DA OXIDAÇÃO DA LECITINA DE SOJA PELA ADIÇÃO DE PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO

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1 AVALIAÇÃO DA OXIDAÇÃO DA LECITINA DE SOJA PELA ADIÇÃO DE PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO 1 Letícia V. Castejon, 2 Vinícius S. Cardoso, 3 Eduardo S. Almeida, 4 Kássia G. dos Santos, 5 José Roberto Delalibera Finzer 1 Discente da Pós-graduação Doutorado em Engenharia Química. 2 Bolsista de iniciação Científica PIBIC/IFTM, discente do curso de Tecnologia de Alimentos. 3 Colaborador técnico em química do Instituto Federal do Triângulo Mineiro. 4 Professor colaborador da Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM/MG) 5 Professor orientador da Faculdade de Engenharia Química da Universidade Federal de Uberlândia (UFU/MG) e Professor no curso de Engenharia Química da Universidade de Uberaba(UNIUBE). 1, 5 Instituto Federal do Triângulo Mineiro, Campus Uberlândia. Fazenda Sobradinho, s/n, Zona Rural, Caixa Postal 1020, Uberlândia - MG, CEP jrdfinzer@ufu.br/jrdfinzer@uol.com.br RESUMO - A lecitina de soja é obtida pelo processo de degomagem do óleo bruto de soja, composta por fosfolipídeos e substâncias hidrossolúveis como proteínas, carboidratos e sais. Possui cor âmbar e aplicação alimentar como emulsificante. A forte coloração pode ser atenuada na clarificação. O objetivo desse trabalho foi avaliar a qualidade oxidativa da lecitina de soja sob variação de concentração (0,28% a 2,7% de peróxido de hidrogênio), tempo (15 a 625 segundos) e temperatura (25 a 55 C). Como resultado, o aumento de temperatura, agitação e concentração, aumentaram a quantidade de dienos e trienos conjugados. Apenas, à temperatura de 40 C, 1,5% de adição de peróxido de hidrogênio e tempo de agitação de 625 segundos (Experimento 14), verificou-se que as quantidades de compostos dienos e trienos conjugados foram menores do que em qualquer, outros pontos experimentais. Os extremos de tempo, temperatura e concentração de peróxido mostraram que a variável concentração influenciou mais no aumento de compostos dienos e trienos conjugados, seguido da variável temperatura e do tempo. Conclui-se que condições experimentais influenciam para obtenção de menor oxidação e, portanto, um produto de melhor qualidade. Palavras-Chave: dienos e trienos conjugados; espectrofotometria; coeficiente de extinção específica. INTRODUÇÃO A lecitina de soja consiste em subproduto lipídico da linha de produção de óleo de soja refinado. É obtida pelo processo de degomagem com água. A lecitina compõe-se de fosfolipídeos ou fosfatídeos (fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina e fosfatidilinositol), possui teores residuais de proteínas, açúcares, ácido fosfatídico e sais de cálcio, magnésio ou ferro complexados formando estruturas denominadas marrons, possui também alto teor de clorofila e carotenóides (Moretto; Fett, 1998). Na Figura 1 podem ser observadas fórmulas moleculares dos fosfolipídeos que compõem a lecitina de soja comercial, sendo R1 e R2 radicais de ácidos graxos. Geralmente, o radical de ácido graxo localizado em R2 é insaturado e o radical de ácido graxo periférico (R1) possui cadeia saturada (Riberio; Seravalli, 2007). Fosfatidilcolina Fosfatidiletanolamina

2 Fosfatidilinositol Figura 1 Estruturas químicas dos fosfolipídeos que compõe a lecitina de soja comercial (Damoradan et al, 2010). Toda estrutura lipídica que contem pelo menos um ácido graxo de cadeia insaturada é passível de sofrer oxidação. A rancidez oxidativa é a denominação usada para a oxidação resultante da quebra da dupla ligação na cadeia do ácido graxo insaturado, ação do oxigênio e por consequência geração de sabor e odor de ranço (Damoradan et al, 2010). Os agentes pró-oxidantes, causadores da rancidez oxidativa são: oxigênio singlete, substâncias fotossensíveis (exemplo, clorofilas, riboflavinas e mioglobinas), enzima lipoxigenase, radiações ionizantes, metais de transição, luz e temperatura elevada. Todos esses agentes próoxidantes possuem como mecanismos oxidativos, a formação, propagação e terminação de radicais livres, com a formação de radicais intermediários como radical peróxido (OO-), radical hidroperóxido (-OOH) e radical hidroxil (-OH) (Damoradan et al, 2010). O peróxido de hidrogênio pode ser um agente pró-oxidante de ácidos graxos insaturados, principalmente na oxidação lipídica biológica e em fosfolipídeos da membrana celular (Akoh, et al, 2002). A adição de peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ) pode ser realizada ao final do processo de produção da lecitina de soja devido à ação bactericida que apresenta, de acordo com Dorsa (1998) ou pode ser realizada com a intenção de clarificar ou diminuir a coloração característica âmbar da lecitina comercial de soja, segundo Myasaka e Medina (1981). Dessa forma, a oxidação lipídica dos fosfolipídeos que compõe a lecitina ocorre em menor grau ao se intencionar a inibição microbiológica e em maior grau na diminuição de cor. Portanto, o presente trabalho possuiu como objetivo, quantificar a oxidação através dos componentes intermediários formados pela análise de coeficiente de extinção específica em espectrofotômetro. MATERIAL E MÉTODOS A clarificação da lecitina de soja foi realizada mediante Planejamento Experimental, compondo-se um planejamento composto central, com 20 experimentos, nos quais foram 6 pontos centrais, 6 pontos axiais, 8 pontos experimentais propriamente ditos, alfa (α) ortogonal igual 1,52465 e variação de cinco níveis. A matriz do planejamento foi obtida no software STATISTICA versão 7.0 e possui como variáveis independentes: a) temperatura ( C), b) o tempo de contato em segundos, efetuando rotação constante do agitador e c) concentração de peróxido de hidrogênio (%, m/v), conforme mostrado na Tabela 1. Tabela 1 Variáveis independentes, valores reais e níveis codificados. Variáveis\ Níveis Codificados -α (-1,52465) α (1,52465) Tempo (segundos) Temperatura ( C) Concentração de H 2 O 2 (%) 0,28 0,70 1,50 2,30 2,72 O Planejamento foi desenvolvido no laboratório de química do Instituto Federal do Triângulo Mineiro, Campus Uberlândia e utilizada a metodologia descrita pelo Instituto Adolf Lutz (2008), na determinação do coeficiente de extinção específica a 232 nm e a 270 nm, para a determinação respectivamente de estruturas dienos e trienos conjugados da reação de oxidação lipídica. Foram quantificados 0,25g de lecitina de soja clarificada, realizados em triplicata para cada ponto do planejemento e analisados em espectrofotômetro da marca RAY LEIGH UV e cubeta de quartzo de 1cm. As massas foram diluídas com 50 ml de clorofórmio PA da marca Synth, para se obter diluição de 1:200, pois nessa diluição se obedece a Lei de Labertbeer. Na Figura 2 tem-se a imagem da unidade experimental e na Figura 3, o espectrofotômetro utilizado para leitura da absorbância a 232 nm e 270 nm. Segundo a metodologia do Instituto Adolf Lutz (2008), pela leitura da absorbância a 232 nm e 270 nm, pode-se obter através da Equação 1 os coeficientes de extinção específica, K 232 e K 270, respectivamente. K λ = A [C (m. v 1 ) x l (cm)] (1) Na Equação 1, A é a absorbância determinada pela leitura a 232 nm e 270 nm, C é a concentração da solução de lecitina de soja

3 Absorbância Absorbância clarificada misturada com clorofórmio (m/v) e l corresponde ao caminho óptico da cubeta de quartzo. RAY LEIGH UV-1800, utilizando-se diluições da lecitina com o clorofórmio P.A. da marca Synth. 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 R² = 0,984 0,00 1,00 2,00 3,00 Concentração de peróxido de hidrogênio (%) Figura 2 Unidade experimental composta por agitador elétrico (1), placa aquecedora com display de temperatura (2), termômetro (3) e cronômetro 4. Figura 4 Absorbância obtida a 232 nm pelo percentual da concentração de lecitina diluída em clorofórmio 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 R² = 0,994 0,00 2,00 4,00 6,00 Concentração de peróxido de hidrogênio (%) Figura 3 Espectrofotômetro UV acoplado a computador. O K 232 é a variável correspondente à estruturas de dienos conjugados, ao início da oxidação de óleos, azeites e gorduras. São estruturas formadas como dienos conjugados, os hidroperóxidos e radicais peróxidos. O K 270 refere-se à formação de estruturas mais estáveis oriundas da oxidação, como cetonas insaturadas, aldeídos e cetonas, e referem-se aos trienos conjugados formados (Ferrari; Souza, 2009). RESULTADOS E DISCUSSÕES Inicialmente como resultado de aplicação do método, elaborou-se a curva de calibração espectrofotométrica para se verificar o atendimento à linearidade de que trata a Lei de Lambertbeer. Na Figura 4 e 5, tem-se as curvas de calibração para as leituras realizadas a 232 nm e a 270 nm, respectivamente, no espectrofotômetro Figura 5 Absorbância obtida a 270 nm pelo percentual da concentração de lecitina diluída em clorofórmio. Na Figura 4 e 5, indicam-se os valores de R² os quais foram próximos de 1, mostrando que a linha de calibração se ajustou aos valores experimentais. Com o resultado da calibração determinou-se a diluição requerida para leitura e determinação do coeficiente de extinção específica. A diluição adequada foi de 1:200, ou seja, uma parte de lecitina (1 g) para 199 ml de clorofórmio. A determinação do coeficiente de extinção específica a 232 nm e a 270 nm deu-se em triplicata, posteriormente ao procedimento de clarificação da lecitina de soja. Na Tabela 2 tem-se a matriz do planejamento experimental e os valores de coeficiente de extinção específicos obtidos. Tabela 2 Matriz do Planejamento Composto Central com α ortogonal e os resultados de K 232 e K 270.

4 Coeficientes de extinção específica Pontos Experimentais Temperatura Concentração Tempo K 232 K 270 C de H 2 O 2 (%) (s) , ,6396±0,02 1,6915±0, , ,7508±0,01 1,7578±0, , ,7273±0,02 1,6040±0, , ,7357±0,05 1,6251±0, , ,6310±0,02 1,5690±0, , ,7099±0,01 1,6562±0, , ,8937±0,02 1,6112±0, , ,9658±0,00 1,5986±0, , ,8301±0,01 1,6739±0, , ,7963±0,02 1,7119±0, , ,0228±0,03 1,7123±0, , ,0068±0,03 1,7631±0, , ,6049±0,01 1,6105±0, , ,5573±0,01 1,5423±0, , ,8883±0,01 1,6328±0, , ,8772±0,01 1,6264±0, , ,8825±0,02 1,6137±0, , ,8685±0,02 1,6338±0, , ,8853±0,02 1,6294±0, , ,8759±0,00 1,6361±0,00 Com os resultados de K 232 e K 270, calculados através da Equação 1, foi possível elaborar a Figura 6, na qual se verifica a variação dos valores de coeficiente de extinção específica a 232 nm e 270 nm. 2,0 1,8 232 nm 270 nm 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0, Experimentos Figura 6 Variação dos valores nos coeficientes de extinção específica a 232 nm e 270 nm. Nota-se na Figura 6 que os valores dos coeficientes de extinção a 232 nm foram menores que os determinados a 270 nm, isso se deve à reação de formação de dienos conjugados, iniciadores e propagadores da reação de oxidação de óleos e gorduras, para posterior etapa de finalização com a formação de trienos conjugados, os quais são analisados a 270 nm. Segundo, Ramalho e Jorge (2006) a teoria dos radicais livres é descrita como mecanismo da auto-oxidação de óleos e gorduras e possui etapas seqüenciais de reações com geração de

5 compostos radicalares e estáveis como mostrado na Figura 7. Figura 7 Demonstrativo da teoria de radicais livres na oxidação de óleos e produto gerados. De acordo com Ramalho e Jorge (2006), a etapa de iniciação ocorre devido à liberação de um hidrogênio do carbono localizado entre as duplas ligações alternadas dos ácidos graxos insaturados. Na etapa de propagação, os radicais livres formados na inicialização, são susceptíveis à reação com oxigênio atmosférico, gerando produtos primários da oxidação, como peróxidos e hidroperóxidos, que são propagadores da reação. Na fase de término, os radicais reagem entre si, formando produtos estáveis como epóxidos, cetonas, aldeídos, obtidos pela cisão ou rearranjo dos peróxidos. Castejon (2010) analisou as absorbâncias obtidas a 232 nm e a 270 nm, ao clarificar lecitina de soja com até 2% de peróxido e verificou o mesmo comportamento, em que as quantidades de dienos conjugados foram inferiores às quantidades de trienos conjugados. Na Figura 6, os pontos de 1 a 8 são resultados experimentais propriamente ditos, de 9 a 14 são resultados experimentais axiais e de 15 a 20 os resultados centrais do planejamento. Observando os resultados Experimentais de 1 a 8, nota-se que na condição de 30 C, concentração de 0,7% (m/v) e tempo de 520 segundos (experimento 2), o K 270 foi maior e o valor de K 232 semelhante aos obtidos nos pontos experimentais 3 e 4, onde se tem variações no tempo de agitação. Nos resultados experimentais propriamente ditos, situa-se o Experimento 5 que apresentou as menores quantidades de dienos e trienos conjugados e o ponto 8 que apresentou o maior valor de K 232, mas não o maior valor de K 270, mostrando que nessa condição (temperatura de 50 C, 2,30%, m/v, de peróxido e tempo de 520 segundos) não houve deslocamento da reação para a formação maior quantidade de trienos conjugados. Nos resultados experimentais axiais do planejamento, tem-se variáveis nos extremos de temperatura, concentração e tempo de agitação. Como resultados teve-se que a maior temperatura e a maior concentração de H 2 O 2, influenciaram a formação de trienos conjugados. Na fase de propagação dos radicais livres, a maior causa das reações em cadeia são devido à presença de oxigênio atmosféricos (Domoradan et al, 2010). Assim, nos pontos 10, 11 e 12, notase que a menor ou maior adição de peróxido de hidrogênio influencia no aumento da quantidade de dienos conjugados e a variável temperatura extremamente elevada (55 C) fez com que diminuísse a quantidade de K 232, ou seja, deslocamento da reação para a finalização de radicais livres e a formação de estruturas estáveis. Nos Experimentos 2 e 11, as concentrações adicionadas de peróxido de hidrogênio foram inferiores e os resultados obtidos em dienos e trienos conjugados foram maiores do que nos Experimentos de 15 a 20, o que parece incoerente, mas refletem um estado oxidativo adverso decorrente de baixa concentração de oxigênio e deslocamento da reação para formação de compostos oxidativos que não só radicais peróxidos e hidroperóxidos ou estruturas pequenas voláteis. Regitano-d`Arce, Oetterer e Spoto (2006) em seu capítulo sobre deterioração lipídica, descreveram que a decomposição dos dienos conjugados (hidroperóxidos) pode ocorrer por quebra homolítica dos ácidos graxos formando radicais alcoxi e esses formam aldeídos, cetonas, alcoóis, hidrocarbonetos, ésteres, furanos e lactonas. Os hidroperoxidos podem reagir com o oxigênio presente e formar produtos secundários como epoxihidroperoxidos, cetohidroperoxidos, dihidroperoxidos, peróxidos cílicos e endoperóxidos bicílicos. Esses podem se decompor em monohidroperóxidos ou podem se condensar e formar dímeros ou polímeros que se quebram e produzem material volátil. A decomposição dos hidroperóxidos aumenta com a temperatura e conforme os resultados obtidos nos Experimentos 2 e 11 com o tempo de agitação, que foi maior (520 segundos) a uma temperatura de 30 C e um menor tempo (320 segundos) com o aumento em 10 C na temperatura (40 C). Uma análise de regressão foi realizada para destacar quais das variáveis estudadas são significativas sobre os coeficientes de extinção específicos medidos em cada experimento. Para tal, foi empregado um teste de hipótese utilizando a distribuição t de Student com nível de significância de 12 %, sendo desconsiderados os

6 parâmetros com nível de significância maior que este valor. A Equação 2 descreve a dependência do coeficiente de extinção específica a 232 nm, que apresentou um valor de 0,856 para o quadrado do coeficiente de correlação da regressão. Este valor indica que 85,6 % da variabilidade dos dados de K 232 são explicados pela Equação 2. Os resíduos da regressão foram aleatórios e normalmente distribuídos. Pode-se observar na Equação 2 que todas as variáveis estudadas têm influência sobre a resposta. Um aumento da temperatura conduz a uma diminuição do coeficiente a 232 nm, enquanto que um aumento da concentração de peróxido favorece a formação dos dienos conjugados. Quanto ao tempo, este influencia a resposta de forma não linear e possui grande efeito sobre a resposta, sendo que um aumento no tempo diminui a formação dos dienos. Este resultado é coerente, já que a tendência é que os dienos sejam consumidos e formem trienos com o passar do tempo. Também foi possível constatar a influência do termo de interação entre a temperatura e a concentração, que tende a favorecer a formação dos dienos. K 232 = 0,8824 0,0351x ,0448x + 0,0516x 2 2 0,1350x ,0558x 1 x 2 (2) A análise de regressão da absorbância a 270 nm apresentou um baixo coeficiente de correlação quadrática, não sendo possível realizar uma análise estatística confiável dos dados. Isso se deve principalmente ao fato de que a resposta da absorbância a 270 nm se refere à quantidade de trienos formados e que parte destes são provenientes da decomposição dos dienos. Portanto, pequenas variações na concentração, temperatura e tempo, influenciam no resultado de oxidação. Outras variáveis como a rotação da hélice do agitador ou mesmo o tipo de impulsor utilizado poderiam alterar os valores de coeficientes de extinção específicos obtidos. CONCLUSÃO A formação dos dienos conjugados e as variáveis que influenciam à formação desses são determinantes, pois a maior concentração de H 2 O 2 e operando com maior temperatura resulta (em experimentos independentes, sendo mantidas as condições extremas, variável codificada iguala 1 para as outras variáveis), em maiores quantidades de trienos representado pelo maior coeficiente de extinção (K 270 acima de 1,70) que pode significar oxidação excessiva, devendo ser comparado com o resultado de cor e outros índices analíticos ou instrumentais. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AKOH, C. C.; MIN, D. B.; BOFF, J. M Food Lipids: Chemistry, Nutricion and Biotechnology. Editicion by Marcel Dekker Inc. New York, 1014p. CASTEJON, L. V Estudo da clarificação da lecitina de soja. PPGEQ/Faculdade de Engenharia Química da UFU, Uberlândia- MG. (Dissertação de Mestrado), 140 p. DAMODARAN, S.; PARKIN, K, L.; FENNEMA, O. R Química de Alimentos de Fennema. Editora Artmed Porto Alegre RS, p. DORSA, R Tecnologia de processamento de óleos e gorduras vegetais. GEA/WESTFALIA, São Paulo SP. 227p. FERRARI, R. A.; SOUZA, W. L. de Avaliação da estabilidade oxidativa de biodiesel de óleo de girassol com antioxidantes. Revista Química Nova, Vol. 32, N. 1, p. MYASAKA, S.; MEDINA, J. C A soja no Brasil. Instituto Tecnológico de Alimentos ITAL, Campinas SP p. MORETTO, E.; FETT, R Tecnologia de óleos e gorduras vegetais na indústria de alimentos. Editora Varela, São Paulo SP, 98p. RAMALHO, V. C.; JORGE, N Antioxidantes utilizados em óleos, gorduras e alimentos gordurosos. Revista Química Nova. V. 29, n. 4, p. REGITANO d`arce, M. A. B.; OETTERER, M.; SPOTO, M. H. F Deterioração de lipídeos ranço: Fundamentos de ciência e tecnologia de alimentos. Editora Manole, Barueri (SP), p. RIBEIRO, E. P.; SERAVALLI, E. A Química dos alimentos. Editora Blucher, São Paulo SP, 86p. AGRADECIMENTOS Ao Instituto Federal do Triângulo Mineiro, campus Uberlândia e à empresa Caramuru Alimentos Ltda.