Perfil de resistência a antimicrobianos por Salmonella Heidelberg isoladas de abatedouro avícola em 2005 e 2009

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1 Acta Scientiae Veterinariae, : RESEARCH ARTICLE Pub ISSN Perfil de resistência a antimicrobianos por Salmonella Heidelberg isoladas de abatedouro avícola em 2005 e 2009 Antimicrobial Resistance Profile of Salmonella Heidelberg Isolated from a Poultry Slaughterhouse in 2005 and 2009 Ligiani Mion¹, Fernanda Lúcia Colla 2, Isabel Cristina Cisco¹, Bruna Webber¹, Luísa Neukamp Diedrich¹, Fernando Pilotto¹, Laura Beatriz Rodrigues¹, Vladimir Pinheiro do Nascimento & Luciana Ruschel dos Santos¹ ABSTRACT Background: Salmonella spp. is recognized as being one of the most common bacterial causes of food-borne illness spread on poultry production due to easy adaptation to environment and difficult to eradicate. In poultry production system antimicrobials are added in feed as growth promoters in continuous and sub-therapeutic doses, inducing a selective pressure and consequent antimicrobial resistance. This management causes public health problems to disseminate resistant pathogens through food chain and reduce the options of treatment of bacterial infections. Materials, Methods & Results: The samples were isolated in a poultry slaughterhouse under Federal Inspection in a monitoring, research and quantification project of Salmonella spp in critical control points in slaughterhouse. Adapted methodology was used for quantification of Salmonella as follows: swabs and cages were placed in 50 ml of peptone water buffered 1% (PW 1%) and incubated at 7ºC for 12 h; for the analysis of water 100 ml were inoculated in 50 ml of peptone water buffered in triple concentration and incubated at 7ºC for 12 h; the chickens and carcasses were packed in sterile bags with a capacity of 4000 ml, added 150 ml of peptone water buffered 1%, agitated manually for one minute and the rinsing broth incubated by 12 h at 7ºC. After hatching were made decimal dilutions Rapapport Vassiliadis broth (RV), inoculated 1 ml in 9 ml of RV broth until 10 - dilution and incubation for 12 h at 41 C in a water bath with agitation. After this period 100 µl of RV broth were seeded in Agar Rambach and Agar XLD and the plates incubated at 7ºC for 12 h. Salmonella-like growth were placed in Agar Rambach and confirmed as Salmonella to biochemical tests (TSI, LIA, urea broth) and assayed for polyvalent antiserum to Salmonella. The final identification of the samples was carried out by the Polymerase Chain Reaction (PCR, Premi Test Salmonella DSM). Were selected 20 samples of Salmonella Heidelberg isolated in 2005 (14 samples) and 2009 (6 samples) for antimicrobial susceptibility testing by diffusion in agar front of amoxicillin with clavulanic acid, ampicillin, cephalothin, ciprofloxacin, chloramphenicol, gentamicin, enrofloxina, cephalexin, streptomycin, ceftiofur, doxycycline and neomycin. It was observed that 46,1% of the samples isolated in 2005 were resistant to an antimicrobial while 100% of the isolates in 2009 were resistant to at least four antimicrobial. Isolated samples in 2005 were resistant to ceftiofur (8.4%), ampicillin (2.0%), cephalexin (15.%) and cephalothin (7.6%) while 100% of the isolates in 2009 were resistant to these antimicrobials. It was concluded that samples of Salmonella Heidelberg isolated in 2009 were phenotypically more resistant to antimicrobials tested than isolated samples in Discussion: S. Heidelberg resistance can be related to the indiscriminate use of antimicrobials in poultry industry. Multiple resistance bacteria like Salmonella can be transferred from animal products to consumers and causes public health problems. Antimicrobial sensitivity tests enable the identification of antimicrobials that have action against pathogenic microorganisms like Salmonella, reinforce the importance of achieving these tests for the definition of appropriate programs of use of antimicrobials in livestock production. Keywords: antimicrobial resistance, Salmonella Heidelberg, poultry slaughterhouse. Descritores: resistência a antimicrobianos, Salmonella Heidelberg, abatedouro avícola. Received: 18 December 201 Accepted: 8 June 2014 Published: 2 June 2014 ¹Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade de Passo Fundo (UPF), Passo Fundo, RS, Brazil. ²M.V. Autônoma, Porto Alegre, RS. Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Porto Alegre, RS. CORRESPONDENCE: L.R Santos [luruschel@upf.br - Tel.: +55 (54) ]. Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária (FAMV) - UPF. BR 285, Bairro São José. CEP Passo Fundo, RS, Brazil. 1

2 INTRODUÇÃO O uso rotineiro de antimicrobianos em animais de produção é um fator importante de desenvolvimento e disseminação de resistência bacteriana que pode ser transferida para seres humanos via cadeia alimentar [6]. Na avicultura industrial a adição de antibióticos e quimioterápicos na ração em pequenas concentrações e de forma contínua proporciona um aumento significativo do ganho de peso e melhora a conversão alimentar [1,15,19]. Entretanto, este manejo é considerado sub-terapêutico, pois a dose de fármaco utilizada é inferior àquela empregada no tratamento de doenças bacterianas, o que favorece a resistência antimicrobiana e diminui a ação destes fármacos no tratamento de infecções em humanos e animais [11,14]. Dentre as salmonelas que causam infecções em humanos, o sorovar Heidelberg parece ser mais invasivo e causar doenças de maior gravidade do que outros sorovares paratíficos [17]. A crescente importância de Salmonella Heidelberg tem gerado estudos devido à frequente resistência deste sorovar ao ceftiofur e a redução da susceptibilidade aos antimicrobianos relacionados à ceftriaxona (cefalosporina de terceira geração). Tais fatos podem limitar as opções de tratamento de gestantes e crianças que desenvolvem salmonelose extra-intestinal por S. Heidelberg e representar uma preocupação extra com relação à saúde pública [9]. O objetivo do trabalho foi avaliar a ação de 12 antimicrobianos frente a amostras de Salmonella Heidelberg isoladas em abatedouro avícola nos anos de 2005 e 2009 e a provável progressão da resistência bacteriana frente a estes princípios ativos, utilizados tanto na produção animal como no tratamento de humanos infectados. MATERIAIS E MÉTODOS As amostras foram isoladas em abatedouro de frangos de corte sob Inspeção Federal durante a condução de um projeto de monitoria, pesquisa e quantificação de Salmonella spp. em pontos críticos de controle em frigoríficos. Foram amostrados oito pontos do fluxograma de abate com coletas de swabs (cloacais e de gaiolas), água da escaldagem e do chiller e frangos antes e depois da escaldagem, da depenagem e do resfriamento. As análises foram realizadas no Laboratório de Bacteriologia e Micologia do Hospital Veterinário da Universidade de Passo Fundo. Utilizou-se metodologia adaptada para quantificação de Salmonella [10,12], como segue: swabs de cloaca e de gaiolas foram colocados em 50 ml de água peptonada tamponada 1% 1 (AP 1%) e incubados a 7ºC por 12 h. Para as análises de água inoculou-se 100 ml da amostra em 50 ml de água peptonada 1 com concentração tripla e incubou-se a 7ºC por 12 h. Os frangos e carcaças foram acondicionados em sacos estéreis com capacidade para 4000 ml, adicionados 150 ml de AP 1% 1, agitados manualmente por um minuto e o caldo de rinsagem incubado por 12 h a 7ºC. Após incubação foram feitas diluições decimais da AP 1% em caldo Rapapport Vassiliadis1 (RV), sendo inoculado 1 ml de AP 1% 1 em 9 ml de caldo RV 1 até a diluição 10 - e os caldos RV 1 incubados por 24 h a 41ºC em banho-maria, com agitação. Após este período 100 µl de cada diluição de caldo RV 1 foram semeados com alça de Drigalski em Agar Rambach 2 e Agar XLD 1, em duplicata, e as placas incubadas a 7ºC por 24 h. Colônias compatíveis com Salmonella spp foram reisoladas em Agar Rambach 2, incubadas a 7ºC por 24 h e submetidas a provas bioquímicas de TSI 1, LIA 1, SIM 1, caldo uréia 1 e agar nutriente 1 para sorologia com anti-soro polivalente O para Salmonella 1. A identificação final das amostras foi realizada utilizando Premi Test Salmonella. Foram selecionadas 20 amostras de Salmonella Heidelberg isoladas em 2005 (14 amostras, denominadas EB) e em 2009 (6 amostras, denominadas SL). As amostras EB foram isoladas de carcaças antes e depois do chiller e de swabs de cloaca enquanto as amostras SL foram isoladas de frangos após a depenagem e da água do chiller. Os testes de sensibilidade a antimicrobianos foram realizados pela técnica de disco-difusão [8] frente aos seguintes princípios ativos: Amoxicilina com Ácido Clavulânico 0 µg; Ampicilina 10 µg; Cefalotina 0 µg; Ciprofloxacina 5 µg; Cloranfenicol 0 µg; Gentamicina 10 µg; Enrofloxina 16 µg; Cefalexina 0 µg; Estreptomicina 10 µg; Ceftiofur 0 µg; Doxiciclina 1µg e Neomicina 0 µg. RESULTADOS As amostras de Salmonella Heidelberg isoladas em 2009 foram 100% resistentes aos princípios ativos que haviam apresentado ação sob este sorovar em 2005 (Figura 1). Em nosso estudo, 46,1% das amostras isoladas em 2005 foram resistentes a pelo menos um princípio ativo enquanto 100 % das amostras isoladas em 2009 apresentaram resistência a pelo menos quatro princípios ativos. Os isolados em 2005 foram 2

3 resistentes a ceftiofur (8,4%), ampicilina (2,0%), cefalexina (15,%), cefalotina (7,6%) e neomicina (7,6%) e os isolados em 2009 a ampicilina, cefalotina, cefalexina e ceftiofur (100%), neomicina (66,6%) e gentamicina (50%). Dos três aminoglicosídeos testados (gentamicina, neomicina e estreptomicina), apenas a estreptomicina apresentou 100% de eficácia, enquanto a gentamicina e a neomicina apresentaram 50% e,4% de ação, respectivamente. As amostras isoladas nos anos de 2005 e 2009 foram 100% sensíveis a enrofloxacina, ciprofloxacina, cloranfenicol e estreptomicina. Figura 1. Progressão da resistência antimicrobiana de sorovares de Salmonella Heidelberg isolados em abatedouro avícola em 2005 e Legendas: EB: amostras isoladas de carcaças antes e depois do chiller e de swabs de cloaca, em 2005; SL: amostras isoladas de frangos após a depenagem e da água do chiller, em DISCUSSÃO O uso terapêutico de antimicrobianos tem um papel importante na prevenção da disseminação de doenças entre os animais, no tratamento de animais doentes, na promoção do crescimento e na prevenção da transmissão de agentes zoonóticos. Entretanto, desde que a aplicabilidade destes fármacos em animais de produção tornou-se rotineira observa-se o crescimento da resistência antimicrobiana aos mais variados agentes antimicrobianos nos diferentes seguimentos de produção animal [5], o que ficou evidente com os resultados do nosso estudo. A progressão de resistência antimicrobiana na produção animal tem sido observada também para Escherichia coli e enterobactérias lactose negativa, isoladas de diversos estágios de criação de frangos de corte [16], com amostras resistentes ao ácido nalidíxico, ampicilina, cefalotina e cloranfenicol, demonstrando que estas bactérias podem ser reservatórios de genes de resistência à antibióticos de importância em medicina veterinária e humana [20]. Neste sentido, um estudo sobre sensibilidade antimicrobiana de Streptococcus suis tipo II isolados de suínos, mostrou percentuais crescentes de resistência, principiados por cloranfenicol, cefalotina e penicilina (,5%), oxacilina (7,1%), ampicilina (7,1%), gentamicina (5,7%), tetraciclina e sulfazotrim (85,7%) []. Outro trabalho com amostras de Salmonella spp. isoladas de carcaças suínas identificou 66,7% de resistência a um ou mais princípios ativos,,% de resistência intermediária e 2,% de amostras multirresistentes (resistentes a pelo menos três antimicrobianos), sendo 16,7% ao cloranfenicol [18]. Em nosso estudo, o cloranfenicol, citado como um dos fármacos de eleição para a terapêutica de salmonelose em humanos [1], apresentou 100 % de eficácia frente aos isolados de S. Heidelberg em 2005 e Já a crescente resistência de Salmonella Heidelberg ao ceftiofur e redução da susceptibilidade aos antimicrobianos relacionados à ceftriaxona [2], bem como a limitação de tratamento de infecções em gestantes e crianças [17] está em consonância com

4 nosso estudo, onde os isolados de S. Heidelberg em 2005 apresentaram 8,4% de resistência ao ceftiofur, índice ampliado consideravelmente dentre os isolados de 2009, quando 100% das amostras foram resistentes a este princípio ativo. Nossos resultados reforçam a importância da carne de frango como uma fonte potencial de Salmonella Heidelberg resistentes e multirresistentes a antimicrobianos [4]. As tetraciclinas são uma das classes de antimicrobianos mais utilizados terapeuticamente em animais de produção [21]. Em nosso estudo identificou-se 7,6% de resistência a doxiciclina entre os isolados de 2005 e,% entre os isolados de 2009, demonstrando que o uso contínuo das tetraciclinas tem ampliado os índices de resistência a esta droga e tornando mais restritas as opções terapêuticas disponíveis. Neste contexto, o alto nível de resistência múltipla revela um risco potencial para a saúde pública e pode dificultar o tratamento de doenças em animais e humanos [7,22] agravando quadros clínicos que poderiam ser curáveis. Assim, destaca-se a necessidade da adoção de estratégias para redução da contaminação por Salmonella spp. na cadeia alimentar, embasadas no uso prudente de antibióticos e no monitoramento da resistência a antimicrobianos na produção animal a fim de prevenir e diminuir o desenvolvimento e a difusão desta resistência. CONCLUSÃO Ocorreu progressão da resistência antimicrobiana de sorovares de Salmonella Heidelberg isolados em abatedouro de aves no período de quatro anos, uma vez que 46,1% das amostras isoladas em 2005 foram resistentes a um princípio ativo e todos os isolados em 2009 foram resistentes a pelo menos quatro princípios ativos. SOURCES AND MANUFACTURERS ¹Difco Microbiologia. Sparks, USA. 2 Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha. Premi Test, R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany Acknowledgements. Ao CNPq, por ter financiado esta pesquisa. Declaration of interest. The authors report no conflicts of interest. The authors alone are responsible for the content and writing of the paper. REFERENCES 1 Alecrim W. D., Loureiro A.C.S.P., Moraes R.S., Monte R.L. & Lacerda M.V.G Febre tifóide: recaída por resistência antimicrobiana. Relato de caso. Revista Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 5(6): Borsoi A., Santos L.R., Rodrigues L.B., Moraes H.L.S., Salle C.T.P. & Nascimento V.P Behavior of Salmonella Heidelberg and Salmonella Enteritidis strains following broiler chick inoculation: evaluation of cecal morphometry, liver and cecum bacterial counts and fecal excretion patterns. Brazilian Journal of Microbiology. 42(1): Bosco S.M.G., Pezerico S.B., Cabral K.G., Silva A.V. & Langoni H Streptococcus suis tipo II em suínos e perfil de susceptibilidade a antimicrobianos. Arquivo do Instituto Biológico de São Paulo. 67(2): Carramiñana J.J., Rota C., Agústin I. & Herrera A High prevalence of multiple resistance to antibiotics in Salmonella serovars isolated from a poultry slaughterhouse in Spain. Veterinary Microbiology. 104(1-2): Centers for Disease Control and Prevention (CDC) Preliminary Food Net data on the incidence of infection with pathogens transmitted commonly through food--10 states, Disponível em: <: Acessado em 07/ Chuanchuen R. & Padungtod P Susceptibilities to antimicrobials and disinfectants in Salmonella isolates obtained from poultry and swine in Thailand. Journal Veterinary Medicine Science. 70 (6): Chiappini E., Galli L., Pecile P., Vierucci A. & Martino M Results of a 5-year prospective surveillance study of antibiotic resistance among Salmonella enterica isolates and ceftriaxone therapy among children hospitalized for acute diarrhea. Clinical Therapeutics. 24(10): Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) Performance standards for antimicrobial susceptibility testing: twenty-second information supplement M100-S22. CLSI, Wayne, PA, USA. 9 Colla F.L., Rodrigues L.B., Borsoi A., Dickel E.L., Nascimento V.P. & Santos L.R Isolamento de Salmonella Heidelberg em diferentes pontos da tecnologia de abate de frangos de corte. Arquivos do Instituto Biológico. 79(4): Desmidt M., Ducatelle R. & Haesebrouck F Serological and bacteriological observations on experimental infection with Salmonella Hadar in chickens. Veterinary Microbiology. 60(2-4):

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