Avaliação da atividade antioxidante de duas espécies de leguminosae

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1 Avaliação da atividade antioxidante de duas espécies de leguminosae FARMÁCIA Débora Pinheiro Rodrigues Alves Pesquisadora Patricia Sartorelli Orientadora Resumo A flora brasileira é particularmente rica em plantas medicinais empregadas como antioxidantes. Uma série de compostos resultantes do metabolismo secundário de plantas superiores apresenta propriedade de capturar radicais livres. Entre as espécies vegetais que apresentam potencial antioxidante estão as pertencentes à família Leguminosae, devido ao acúmulo de compostos fenólicos, resultante de seu metabolismo secundário. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antioxidante de extratos vegetais obtidos a partir de duas espécies de Leguminosae, (Cassia Fistula e Bauhinia forficata). Estas espécies são descritas na literatura por apresentarem em sua composição flavonóides e outros derivados fenólicos. A partir da sub-fração BF-13.3, obtida do extrato de folhas (Acoet) de Bauhinia forficata, foram identificadas duas substâncias como sendo flavonóides, sendo uma delas a quercetina. A avaliação da atividade antioxidante foi realizada in vitro através do ensaio de redução do radical DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil). Foi observado que os extratos avaliados de Bauhinia forficata apresentaram-se ativos, gerando perspectivas de isolamento de substâncias com propriedades antioxidantes. A espécie de Cassia fistula também apresentou grande potencial antioxidante, com vários extratos e frações ativas. Palavras-chave: Bauhinia forficata. Cassia fistula. Radicais livres. Atividade antioxidante. 57 Abstract The Brazilian flora is particularly rich in medicinal plants used as antioxidants, mainly secondary metabolites from superior plants show property to capture free radicals. Among the plants that present antioxidant potential there are plants of Leguminosae family, which have been an accumulation of phenolic compounds, because its secondary metabolism. The main goal of this work was to evaluate the antioxidant activity of two vegetable species of Leguminosae, Cassia fistula and Bauhinia forficata. These species are described in literature for presenting in its composition, flavonoids and other phenolic derivatives. From sub-fraction BF-13.3 obtained from the leaves of Bauhinia forficata, it was identified two flavonoids, including quercetin. These species had been evaluated as antioxidant activity by the test of reduction of radical DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl). It was observed that all extracts evaluated of Bauhinia forficata showed antioxidant activity and the species of Cassia fistula, also presented great antioxidant potential. Key words: Bauhinia forficata. Cassia fistula. Free radicals. Antioxidant activity.

2 Débora Pinheiro Rodrigues Alves 1 Introdução Os radicais livres são responsáveis pelo mecanismo de uma série de danos celulares, gerando vários processos patológicos entre eles a aterosclerose, inflamação, diabetes, infarto, catatarata, neoplasias, artrite reumatóide (HALLIWELL, 1987). 58 Entende-se por radicais livres substâncias químicas que apresentam número ímpar de elétrons em sua última camada eletrônica (FERREIRA; MATSU- BARA, 1997), ou seja, possuem pelo menos um elétron desemparelhado, conferindo-lhes alta reatividade (BIANCHI; ANTUNES, 1999). A flora brasileira é particularmente rica em plantas medicinais empregadas como antioxidantes; uma série de compostos resultantes do metabolismo secundário de plantas superiores demonstram propriedade de capturar radicais livres. Entre esses compostos destaca-se o grupo de compostos fenólicos que inclui os flavonóides (WILHELM FILHO et al., 2001), cumarinas, derivados do ácido cinâmico e ácidos fenólicos (KAHL, 1991), além de algumas lignanas (LARSON 1988; LEE, 1999). Entre as espécies vegetais que apresentam potencial antioxidante, estão as pertencentes à família Leguminosae, devido ao acúmulo de compostos fenólicos, resultantes de seu metabolismo secundário (WILHELM FILHO et al., 2001). O presente projeto visou avaliar a atividade antioxidante de duas espécies vegetais de Leguminosae, Cassia fistula (Figura 1), também conhecida como chuva-de-ouro, e a Bauhinia forficata (Figura 2), conhecida popularmente como pata de vaca. Figura 1- Exemplar da espécie Cassia fistula. Figura 2 - Exemplar da espécie Bauhinia forficata. 2 Materiais e Métodos 2.1 Coleta e identificação do material vegetal Os tecidos vegetais da espécie Cassia fistula foram coletados em um parque localizado na região norte de São Paulo em março e setembro de 2004, nos seguintes dados de GPS S 23 o W 46 o Esta espécie foi identificada pela Professora Dra Adriana Amaral Baroli (UNIFIEO), e uma exsicata (SPSF 30711) foi depositada no Herbário do Instituto

3 Avaliação da atividade antioxidante de duas espécies de leguminosae florestal de São Paulo. Já a espécie vegetal de Bauhinia forficata foi coletada no município de Santana de Parnaíba nas seguintes coordenadas 23º26 38 S, 46º55 04 W, Estado de São Paulo, entre os meses de agosto à outubro de A identificação desta espécie também foi realizada pela Professora. Dra Adriana Amaral Baroli. 2.2 Ensaio para a detecção de atividade antioxidante Os extratos obtidos a partir das espécies vegetais foram submetidos à avaliação da atividade antioxidante, utilizando-se a técnica de revelação com DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil). O ensaio, relativamente simples, consistiu em aplicar os extratos vegetais em cromatoplacas de Sílica-gel. Após a aplicação dos extratos nas cromatoplacas, realizouse a cromatografia em camada delgada (CCD) dos mesmos, em um sistema de solvente adequado. Após a secagem, as placas foram reveladas com a solução DPPH (solução metanólica de 2 mg/ml). As substâncias com atividade anti-radicalar, ou seja, antioxidante, foram detectadas através de manchas amareladas sobre o fundo violeta, devido à captura de um H radicalar da fonte antioxidante e formação do composto difenilpicrilhidrazila (não radical) (Figura 3). Após a determinação da atividade antioxidante dos extratos vegetais, avaliaram-se também frações previamente preparadas por outro grupo de pesquisas, através do fracionamento dos extratos. 59 Figura 3 - Variação de coloração no teste com DPPH. 2.3 Fracionamento cromatográfico bomonitorado As frações de Bauhinia forficata, que apresentaram atividade antioxidante, foram então submetidas a várias etapas de cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP), a fim de monitorar o fracionamento cromatográfico e identificar as frações ativas. Trata-se do mesmo procedimento que foi utilizado na purificação das frações ativas de Cassia fistula, utilizando-se a técnica de cromatografia em camada delgada preparativa. Adicionalmente foi realizada a purificação das frações ativas de Bauhinia forficata. 2.4 Identificação estrutural das substâncias ativas Após a purificação das frações ativas, as substâncias isoladas foram analisadas por técnicas espectroscópicas de ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN- 1 H), com o principal objetivo de realizar a identificação estrutural da substância presente no extrato vegetal que é responsável pela atividade anti-radicalar.

4 Débora Pinheiro Rodrigues Alves 3 Resultados e Discussões 60 Ao avaliar a espécie vegetal de Cassia fistula, pode-se verificar que esta apresentou potencial antioxidante. Dentre os extratos avaliados, os que apresentaram forte atividade foram os obtidos a partir de folhas (Hexânico e Butanólico), os de flores (Hexânico), frutos (Acoet) e de galhos (Hexânico e Butanólico). Já os obtidos a partir de folhas (DCM), apresentaram atividade moderada e os de sementes (Hexânico), fraca atividade (Figura 4). Após a determinação da atividade antioxidante dos vários extratos vegetais de Cassia fistula, avaliaram-se também, através de ensaio com DPPH, frações dos frutos de Cassia fistula (Acoet) previamente obtidas por nosso grupo de pesquisa. Das 16 frações (AR-1 à AR-16) obtidas a partir do fracionamento cromatográfico dos frutos (AcOEt) de Cassia fistula, as frações que se apresentaram mais ativas foram as AR-5, AR-6, AR-7, AR-8, AR-9, AR-10, AR-11 e AR-12 (Figura 5). Vale ressaltar que as frações ativas AR-5 e AR-6 foram purificadas através de várias etapas de cromatografia em camada delgada preparativa, e as subfrações obtidas posteriormente foram submetidas à avaliação da atividade antioxidante. Figura 4 - Extratos ativos de Cassia fistula. Figura 5 - Frações ativas do extrato dos frutos (AcOEt) de Cassia fistula. A outra espécie da família Leguminosae analisada, Bauhinia forficata, também apresentou potente atividade antioxidante (Figura 6), provavelmente devido à presença de flavonóides e outros derivados fenólicos, caracterizados por atuarem na captura e neutralização de radicais livres. A partir da fração BF-13, obtida a partir do fracionamento cromatográfico do extrato AcOEt de folhas de B. forficata, foi identificada a quercetina, citada na literatura por atuar como agente antioxidante. A quercetina pertence à classe dos flavonóis, apresenta essa denominação porque foi primeiramente identificada na planta Quercus sp. Junto com o canferol, galangina e miricetina constituem os flavonóis mais encontrados em vegetais, podendo estar associados com açúcares (ZUANAZZI; MONTANHA, 2004). A outra substância identificada 7-hidroxi-5,3,4 -trimetoxi-flavonol também pertence à classe dos flavonóis, caracterizados pela oxigenação no C3. Os flavonóides possuem importância farmacológica, resultado de algumas propriedades atribuídas a alguns representantes da classe, como por exemplo: antitumoral, antiinflamatória, antioxidante, antiviral e antimicrobiana. Inclusive alguns medicamentos são elaborados a partir de flavonóides, em particular para o tratamento de doenças circulatórias, hipertensão e agindo como cofator da vitamina C (ZUANAZZI; MONTANHA, 2004).

5 Avaliação da atividade antioxidante de duas espécies de leguminosae Figura 6 - Extratos ativos de Bauhinia forficata. 4 Conclusão A Cassia fistula, além de uma gama de atividades, também apresenta ação antioxidante, como esta pesquisa comprovou. Este potencial se dá provavelmente pelo acúmulo de compostos fenólicos característicos dessa espécie. A espécie de Bauhinia forficata também apresentou potente atividade antioxidante, provavelmente devido à presença de flavonóides e outros derivados fenólicos, caracterizados por atuarem na captura e neutralização de radicais livres. Do extrato de folhas (AcOEt) foi previamente identificado o flavonóide quercetina. A quercetina pertence à classe de flavonóise é citada por atuar como agente antioxidante. A busca por novos potenciais antioxidantes naturais vem aumentando com objetivo de minimizar os danos causados no organismo pelo acúmulo de radicais livres. Referências bibliográficas BIANCHI, M. de L.P; ANTUNES, L.M.G. Radicais livres e os principais antioxidantes da dieta. Revista de Nutrição, Campinas, v.12, n.2, maio/agosto FERREIRA,A.L.A; MATSUBARA,L.S. Radicais Livres: conceitos, doenças relacionadas, sistema de defesa e estresse oxidativo. Revista da Associação Médica Brasileira, São Paulo, v.43, n.1, jan./mar HALLIWELL,B. Oxidants and human diseases: some new concepts. FASEB Journal, v.1, p , KAHL, R. Protective and adverse biological actions of phenolic antioxidants. Em Oxidate stress: oxidant and antioxidant. London, p , LARSON, R. A. The antioxidants of highers plants. Phytochemistry, v.27, p , LEE, S. J., YUN, Y. S., LEE, I. K., RYOO, I. J., YUN, B. S. e YOO, I.D. An antioxidant lignan and other constituents from the root bark of Hibiscus syriacus. Planta Medica, v. 65, p , WILHELM FILHO, D., SILVA, E. L. e BOVERIS, A. Flavonóides antioxidantes de plantas medicinais e alimentos: Importância e perspectivas terapêuticas. Em YUNES, R. A.; CALIXTO, J. B. (Ed). Plantas Medicinais sob a Ótica da Química Medicinal Moderna. Chapecó: Argos - Editora Universitária, p , ZUANAZZI, J. A. S; MONTANHA, J. A. Flavonóides. Em SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; PALAZZO DE MELLO, J. C.; MENTZ, L. A.; PETROVICK, P. R. (Org) Farmacognosia: da planta ao medicamento. Porto Alegre/Florianópolis: Editora UFRGS/UFSC, p , 2004.