Aula de Bioquímica Avançada. Tema: Sinalização Celular. Prof. Dr. Júlio César Borges

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1 Aula de Bioquímica Avançada Tema: Sinalização Celular Prof. Dr. Júlio César Borges Depto. de Química e Física Molecular DQFM Instituto de Química de São Carlos IQSC Universidade de São Paulo USP borgesjc@iqsc.usp.br

2 Princípios da Sinalização Celular ORGANISMOS UNICELULARES Células respondem a estímulos do meio: disponibilidade de oxigênio, nutrientes, etc ORGANISMOS MULTICELULARES Células enviam sinais umas às outras células mediante centenas de tipos de moléculas extracelulares. A partir da integração dos sinais, as células devem decidir o que fazer Diversos sinais simultâneos Célula??? Morrer Viver Dividir Proliferar Proliferação celular Especialização celular Interação celular Movimento celular

3 Princípios da Sinalização Celular Célula sinalizadora As células-alvo possuem proteínas receptoras. As proteínas-receptoras reconhecem o 1º Mensageiro e respondem de forma específica. Alta especificidade e sensibilidade TRANSDUÇÃO DE SINAL CÉLULAS SINALIZADORAS MOLÉCULA SINAL: 1º MENSAGEIRO PROTEÍNAS RECEPTORAS (CÉLULAS ALVO) EMITE SINAL ALTERAÇÃO DO COMPORTAMENTO CELULAR

4 Princípios da sinalização celular Transdução de sinal Maneira pela qual a célula recebe um determinado tipo de sinalização e o transmite para diversas vias, que poderão ser novamente transformadas, até chegar a função efetora Dividir, proliferar, morrer... 1º mensageiro - Proteínas - Peptídeos - Aminoácidos - Nucleotídeos - Ácidos graxos - Esteroides - Gases

5 Transdução de sinal Uma dada célula responde a um conjunto limitado de sinais - Depende de seu próprio conjunto de moléculas efetoras Diferentes moléculas-sinais extracelulares alteram o comportamento da célula-alvo. Células diferentes respondem de modo diferente ao mesmo tipo de sinal. A informação transmitida pelo sinal depende de como a célula-alvo recebe e interpreta o sinal.

6 Integração da sinalização Intracelular TRANSDUÇÃO INICIAL TRANSMISSÃO AMPLIFICAÇÃO Receptores celulares específicos responsáveis em disparar processos celulares conforme a disponibilidade de moléculas executoras INTEGRAÇÃO DISTRIBUIÇÃO - RESPOSTA DIFERENCIADA DEPENDENTE DO TIPO CELULAR RESPOSTA CELULAR

7 Sinalização Celular Moléculas-sinal extracelulares: 1º Mensageiro Receptores específicos Leveduras unicelulares sinalização feita por poucos tipos de moléculas Células de animais superiores Centenas de diferentes tipos de moléculas Maioria das moléculas é secretada por exocitose. Outras são liberadas por difusão através da membrana plasmática e outras ficam expostas ao meio extracelular, mas permanecem ligadas a superfície da célula sinalizadora (proteínas de membrana) Emissão do sinal Independente da natureza do sinal, a célula-alvo responde por meio de uma proteína específica: RECEPTOR. Local onde a molécula sinalizadora se liga de forma específica iniciando uma resposta nas células- alvo. Alta especificidade Proteínas modulares Múltiplas isoformas tecido-específicas Pontos de convergência/divergência de sinais

8 Sinalização Celular Moléculas-sinal extracelulares 1º Mensageiro Características químicas Influencia as características estruturais do RECEPTOR Grandes e hidrofílicas Pequenas e hidrofóbicas Maior parte dos receptores Proteínas transmembrana que ao se ligarem a molécula sinalizadora são ativados e geram uma cascata de sinais intracelulares alterando o comportamento da célula. Ligante tem que penetrar na célulaalvo para ativação Ativa receptores citoplasmáticos e/ou nucleares

9 Tipos de Sinalização Extracelular Endócrinos: liberados no plasma ação a longa distância Neuronais ação mediada por neurotransmissor Parácrinos: liberados no espaço extracelular ação local em outras células Autócrinos: liberados no espaço extracelular ação na mesma célula que os libera

10 Hormônios: 1º mensageiro Conjunto de moléculas responsáveis pela manutenção e coordenação das funções em um organismo complexo. Mensageiros químicos secretados no plasma ou interstício celular para regular a atividade de outras células ou tecidos do organismo. Função Pressão arterial Volume sanguíneo Balanço eletrolítico Embriogênese Diferenciação sexual Desenvolvimento e reprodução Fome Comportamento alimentar Digestão Distribuição de combustíveis Tecido/célula/sistema alvo sistema vascular sistema vascular e rins sistema vascular e rins embriões órgãos sexuais e organismo órgãos sexuais e organismo cérebro cérebro e sistema digestivo cérebro e sistema digestivo fígado

11 Sinalização de longa distância Liberação do 1º mensageiro: Tipos de sinalização a longa distância Sinalização neuronal Sinalização Endócrina Distribuição lenta depende da difusão no fluxo sanguíneo Concentração baixa de hormônios Efeito disperso Distribuição muito rápida 100 m/seg Concentração alta do neurotransmissor Efeito localizado Maior precisão e rapidez

12 Vias de Sinalização Intracelular Hormônios Sistema neuroendócrino

13 Tipos de Sinalização Extracelular A transmissão dos sinais em relação a distância Mediadores locais (Ex: Inflamação) Sinalização parácrina Curtas Distâncias Contato direto, sem liberação de sinais (Ex: desenvolvimento embrionário) Sinalização dependente de contato Secreção de sinais (Ex: Hormônios) Sinalização endócrina Longas Secreção de neurotransmissores (Ex: Acetilcolina) Sinalização neuronal

14 Transdução de sinais A resposta celular a um sinal pode ser rápida ou lenta A Especificidade da ação depende da interação do 1º mensageiro com receptores celulares 1) Liberação de 2º mensageiro no citoplasma modificações covalente reversíveis de proteínas alvo - Ativação/inativação de enzimas efetoras 2) Abertura de canais - Efeito direto 3) Modulação da expressão gênica - Pode ser ação decorrente da integração conjunta com 2º mensageiro ou receptores nucleares

15 Sistemas de amplificação de sinal As vantagens do uso de 2º mensageiros Efeito Cascata de sinalização 1) Amplificação de sinal - Um pequeno sinal pode produzir amplas respostas celulares 2) Difusão do sinal por todos os compartimentos celulares - Modulação de toda célula para a nova situação celular 3) Comunicação cruzada - Integração com outros sinais

16 Transdução de sinais: características gerais Alta conservação dos mecanismos de transdução de sinais biológicos Tipos de sinais biológicos milhares Maquinaria de transdução conta com alguns tipos básicos de componentes proteínas

17 Resumindo Célula sinalizadora Sinal (1º mensageiro) Ex: hormônio Proteína receptora Modulação da Célula-alvo Distância 1. Intracelular - Óxido nítrico - Hormônios esteroides - Hormônios tireoidianos 2. Superfície 1. Parácrina 2. Dependente de contato 3. Endócrina 4. Neuronal Transdução do sinal 1. Canais iônicos 2. Receptores enzimáticos 3. GPCR Proteínas G 4. Guanilil-ciclase Tiroquinases 2º mensageiros camp IP3 DAG Ca 2+ cgmp

18 Hormônios 1 os Mensageiros Tipos de hormônios

19 Hormônios Tipos de hormônios

20 Hormônios Tipos de hormônios: continuação

21 Hormônios Hormônios peptídicos Ação dependente de receptores de membranas e segundos mensageiros Ex: Insulina e glucagon: metabolismo de carboidratos Angiotensina II e bradicinina: pressão e volume sanguíneo

22 Hormônios Hormônios catecolamínicos Ação dependente de receptores de membranas e segundos mensageiros Produzidos na medula adrenal Papel importante na neurotransmissão e metabolismo energético Adrenalina/epinefrina Noradrenalina/norepinefrina

23 Hormônios Os efeitos da Epinefrina e Glucagon no metabolismo do Glicogênio - Cascatas de sinalização - Amplificação de sinal

24 Hormônios Hormônios eicosanoides Ação dependente de receptores de membranas e segundos mensageiros - mediadores celulares locais inflamação, febre, dor e agregação plaquetária

25 Hormônios Hormônios esteróides Ação dependente de receptores nucleares modulação da expressão gênica Aldosterona cortisol Testosterona Estradiol

26 Hormônios Hormônios vitamina D Ação dependente de receptores nucleares modulação da expressão gênica

27 Hormônios Hormônios Retinoides Ação dependente de receptores nucleares modulação da expressão gênica

28 Hormônios Hormônios Retinoides Ação dependente de receptores nucleares modulação da expressão gênica

29 Hormônios Hormônios Tireoides Ação dependente de receptores nucleares modulação da expressão gênica Produzido na tireoide Estimulam o metabolismo energético

30 Hormônios Óxido nítrico Radical livre estável Síntese dependente da NO-sintase Ação local por intermédio da guanilato-ciclase segundo mensageiro GMPc

31 Hormônios

32 Hormônios

33 Hormônios

34 Transdução de sinais Os 6 mecanismos básicos A redundância mecanística permite fazer generalizações

35 1) Receptores acoplados a Proteínas G GPCR: G protein-coupled recpetors ~1/2 dos fármacos atuam sobre GPCR Sistema de transdução de sinal formado por 3 componentes: 1) Receptor de membrana plasmática com 7 segmentos transmembrana - Receptor hepta-helicoidais 2) Proteína G que alterna entre forma ativa (GTP) e inativa (GDP) 3) Proteína G-GTP ativa uma enzima que libera 2º mensageiros Protótipo de funcionamento GPCR Receptor β-adrenérgico Receptor adrenalina 4 tipos básicos: α 1, α 2, β 1, β 2 Adrenalina = epinefrina Dispara sinais de alarme - Mobiliza energia metabólica - Aumenta capacidade cardiovascular lutar ou fugir Agonista: simula ligante natural Antagonista: bloqueia efeito do ligante natural = Fármaco

36 1) Receptores acoplados a Proteínas G GPCR: G protein-coupled receptors ~1/2 dos fármacos atuam sobre GPCR ~1000 genes em humanos ~150 órfãos (sem ligantes descritos) ~350 para hormônios e outras moléculas endógenas ~ 500 para receptores olfativos e gustativos moléculas exógenas Alta conservação estrutural e funcional - Aminas de baixa massa molecular adrenalina - Peptídeos opióides - Proteínas - Peptídeos - Eicosanoides - Receptores de luz

37 Receptor β-adrenérgico Protótipo do grupo Presente no músculo esquelético, fígado e adipócitos - Degradação de glicogênio e triacilgliceróis 1) Receptores acoplados a Proteínas G Adenilil-ciclase proteína de membrana forma camp na face citoplasmática Proteína G Ancorada a membrana via palmitoil G s - estimulatória Forma inativa Heterotrímero αβγ G sαβγ (GDP) Ativação do receptor - dissociação da G sα (GDP) - Dissociação do GDP - Ligação do GTP Ativação da Adenililciclase

38 1) Receptores acoplados a Proteínas G 1) camp ativa a PKA induzindo a dissociação da cadeia catalítica ativa da cadeia regulatória inibitória 2) Fosforilação indiscriminada de proteínas diversas como Glicogênio Fosforilase Kinase (degradação de glicogênio) e Glicogênio Sintase kinase (inibição da síntese de glicogênio) Susceptível a cascata de amplificação de sinal

39 1) Receptores acoplados a Proteínas G Todo sistema de transdução de sinal tem um mecanismo de término de resposta Mecanismos de desligamento da ativação dos receptores β-adrenérgicos 1) Depende da dissociação do G sα GTP da adenilil ciclase 2) Atividade GTPase intrínseca da G sα sobre o próprio GTP - Existem proteínas ativadores da atividade GTPase (GAP) intrínseca da G sα 3) Hidrólise do camp fosfodiesterase de nucleotídeo cíclico 4) Fosfoproteínas-fosfatases atuam sobre as proteínas fosforiladas pela PKA Comutador binário autolimitante Estímulo da G sα (GTP) sobre a Adenilil-ciclase é autolimitada pela sua atividade GTPase intrínseca A G sα (GDP) se reassocia ao G sβγ e ao receptor de membrana

40 1) Receptores acoplados a Proteínas G Dessensibilizarão de receptores β-adrenérgicos Processo que sequestra os receptores em vesículas no citoplasma. Depende da fosforilação da face citoplasmática do receptor pela β-ark (βadrenergic receptor kinase) - Família GRK (G-protein coupled kinases) Bloqueio da interação com a Proteína G Recrutamento da β-arrestina e Clatrina Sequestro em vesículas citoplasmáticas

41 camp é um 2º mensageiro multifuncional Vários sistemas de transdução usam o camp camp ativa a CREB (camp response element binding protein) ativa transcrição gênica Proteína G-inibitória inibição da adenilil ciclase - Estruturalmente similar a G sαβγ - G Iαβγ (GDP) interage com receptores específicos [camp] reflete a integração de ambos os sistemas Resposta ao camp pode ser breve e localizada - Efeito dos complexos envolvendo proteínas de ancoragem da PKA (AKAP5) Reúnem Balsas lipídicas - Receptor-proteína G sαβγ - Adenilil ciclase - PKA - camp fosfodiesterase - Fosfoproteína fosfatase - Outras

42 1) Receptores acoplados a Proteínas G GPCR podem estar acoplados a Fosfolipase C (PLC) Respondem a ativação de hormônios diversos Ação conjunta de 2º mensageiros Diacilglicerol (DAG) Ativa isoenzima da PKC Inositol-1,4,5-trifosfato (IP 3 ) libera Ca 2+ Ca 2+ Ativa isoenzima PKC

43 1) Receptores acoplados a Proteínas G Acoplados resposta via Fosfolipase C (PLC) Efeito do Ca 2+ dependente da Calmodulina (CaM) sensor ubíquo de Ca 2+ Ativa a CaM-kinase Efeito do Ca 2+ interconexão com camp - Estimula a adenilil ciclase - Estimula a camp-fosfodiesterase Efeitos locais/temporais

44 2) Receptores Tirosina-kinases (RTK) Domínio extracelular de interação com o ligante Domínio citoplasmático com atividade kinase - Conectados por um único segmento transmembrana - Atividade Tyr-kinase intrínseca fosforilação cruzada Receptor da Insulina: INSR Protótipo da classe - Dímero - Regulação de metabolismo e expressão gênica - Interação com a Insulina fosforilação cruzada - Saída da sequência auto-inibitória do sítio ativo - Sítio ativo livre para interagir com proteínas citoplasmáticas O INSR ativo fosforila e ativa o IRS-1 (Insulin receptor substrate-1) O IRS-1 (Pi-Tyr) funciona como ponto de nucleação para complexo de proteínas

45 2) Receptores Tirosina-kinases (RTK) Possuem atividade kinase intrínseca: Receptor da Insulina: INSR Montagem do complexo envolve proteínas contendo o domínio SH2 liga Pi-Tyr Gbr2 - Reconhece Pi-Tyr da IRS-1 - Proteína conectora - Contém domínio SH3 - Liga proteínas ricas em Pro Sos - É fator de troca de nucleotídeos (GEF) - Induz troca de GDP/GTP na Ras Ras - Protótipo das pequenas proteína G - Ligada a GTP ativa a proteína kinase Raf1 uma MAPK (mitogen-activated protein kinase) - Raf1 fosforila e ativa a MEK (uma MAPK kinase - MAPKK) - MEK fosforila e ativa a ERK (uma MAPKK kinase - MAPKKK) Cascatas das MAPK

46 2) Receptores Tirosina-kinases (RTK) Possuem atividade kinase intrínseca: Receptor da Insulina: INSR Ativação de enzimas contendo o domínio SH2 Fosfoinositídeo-3-kinase PI3K - Reconhece Pi-Tyr da IRS-1 - Atua sobre fosfatidilinositol-4,5- fosfato (PIP 2 ) - Formação do fosfatidilinositol- 3,4,5-fosfato (PIP 3 ) - O PIP 3 ativa a PDK1 fosforila a Akt (PKB) - GSK3 não fosforilada Fosforila Insulina inibe a enzima que inibe a Glicogênio Sintase a Glicogênio Sintase - Síntese de glicogênio PKB - Disponibiliza o Glut4 - Fosforila Ser e Thr de proteínas alvo inativa GSK3 Glicogênio sintase kinase 3 - Redução da síntese de glicogênio

47 2) Receptores Tirosina-kinases (RTK) Possuem atividade kinase intrínseca: Outros exemplos Envolvem dimerização dependente do 1º mensageiro - Usam proteínas que interagem com Pi- Tyr via domínios SH2 - Permite ampla integração de sinal Envolvem dimerização dependente do 1º mensageiro - Citocina Eritropoitina - Modulação da expressão gênica direta e indireta via cascata das MAPK

48 Integração de vias Insulina versus Adrenalina Metabolismo é entrelaçado e estratificado Integração do sinal da insulina Insulina induz sequestro de receptores β-adrenérgicos devido a fosforilação do C- terminal do receptor via IRS-1 e PKB Fosforilação receptores α 2 - adrenérgicos permite nucleação do complexo via SH2 e ativação da cascata das MAPK modulação da expressão gênica

49 3) Receptores Guanilil-ciclases Ação via cgmp e Proteínas Kinases G (PKG) cgmp transmite diferentes mensagens para diferentes tecidos - Rins e intestino retenção de água - Relaxamento do músculo cardíaco Fator natriurético atrial (ANF) - Secretado pelos átrios cardíacos - Excreção renal de sódio - Excreção de água - Vasodilatação Efeito do cgmp é revertido pela cgmpfosfodiesterase (cgmp-pde) - O Sildenafil (Viagra) inibe a isoforma peniana vasodilatação ereção prolongada Guanilil ciclase citosólica ativada por óxido nítrico (NO) - cgmp reduz tônus cardíaco - Via da ação da nitroglicerina - Tratamento da angina pectoris

50 Proteínas adaptadoras Tema recorrente Fosforilação criam sítios de ancoragem em proteínas multivalentes Proteínas multi-domínios que participam de circuitos proteicos Interação específica de Pi-Tyr - Interação específica mediada pela sequencia adjacente da Pi-Tyr Exemplos: - domínio SH2 - PTB (Phosphotyrosin-Binding protein) Auto-inibição via fosforilação interna

51 Proteínas adaptadoras Tema recorrente Proteínas multi-domínios que participam de circuitos proteicos Módulos de interação recorrentes - Múltiplos domínios de interação comuns em diferentes proteínas Em humanos - 87 proteínas contendo o domínio SH2-24 proteínas contém o domínio PTB Muitas contém o domínio SH3 - liga PIP 3 na face interna da membrana formado em resposta a PIK3 e IRS-1 - Proteínas multivalentes

52 Proteínas adaptadoras Tema recorrente Circuitos proteicos, proteínas de ancoragem e balsas lipídicas EX: A cascata das Raf (MAPK), MEK (MAPKK) e Erk (MAPKKK) depende da proteína de ancoragem KSR Possibilita resposta combinatória Regulação da intensidade de resposta via fosforilação no sítio de ancoragem Ex: Raf Proteínas Tyr-fosfatases também contém domínios de interação comuns aos envolvidos nos circuitos de ativação - Ex: domínio SH2

53 4) Receptores acoplados a canais iônicos Convertem sinais QUÍMICOS em sinais ELÉTRICOS - Funcionam de maneira simples e direta - Responsáveis pela transmissão rápida de sinais (sinapses do sistema nervoso) - Contração muscular, secreção hormonal, processos sensoriais, memória, etc. Potencial de membrana Polarização da membrana decorrente a diferente concentração de íons Gradiente de concentração de íons e potencial elétrico são mantidos a custas de ATP - Na + K + -ATPase Gradiente/potencial elétrico rompido pela abertura de Canais iônicos passivos específicos induzida por ligantes ou variação de potencial elétrico transmembrana Fluxo de íons continua até consumir a força propulsora provida pelo gradiente de íons e potencial de membrana. - É especifico para cada íon - É influenciado pelo tempo de abertura e fechamento de um dado canal iônico

54 4) Receptores acoplados a canais iônicos Canal de membrana controlados por voltagem Sinalização no sistema nervoso central - Potencial de ação em extremidades do neurônio - Liberação de neurotransmissores na fenda sináptica - Potencial elétrico passado adiante Ação conjunta de 3 canais iônicos controlados por voltagem 1) Onda de despolarização abre canais de Na + entrada de Na + 2) Despolarização atrasada de canais de K + saída de K + - Participa da repolarização 3) Despolarização final abre canais de Ca + entrada de Ca + - Ca + age como 2º mensageiro 4) Exocitose de vesículas de acetilcolina neurotransmissor na fenda sináptica - Ativação de receptores na membrana pós-sináptica - Abertura de canais iônicos

55 4) Receptores acoplados a canais iônicos Funcionamento do canal iônico de Na + sensível a voltagem 1840 resíduos 4 domínios contendo 6 α- hélices transmembrana formando um canal central em funil específico para Na + - Filtro de seletividade loop entre hélice 5 e 6 α-hélice 4 é carregada +++ e funciona como sensor de abertura Inativação depende de mecanismo de bola de corrente que bloqueia o canal - Comprimento da corrente determina o tempo de abertura do canal

56 4) Receptores acoplados a canais iônicos Funcionamento do canal iônico de Na +, K + e Ca + ativado por acetilcolina Receptor nicotínico de acetilcolina - Sensível a nicotina - Sinapses e junções neuromuscular Receptor formado por 5 subunidades α 2 βγδ - Cada subunidade tem 4 segmentos α- hélices transmembrana (M1-M4) - A hélice M2 é anfipáticas com Leu voltadas para o centro do poro A isoformas α contém o sítio de interação para acetilcolina Acetilcolina induz uma rotação no segmento M2 de cada subunidade levando as Leu para o lado, abrindo o poro. Outros neurotransmissores com receptores similares: Serotonina, glutamato e glicina A despolarização da membrana neuronal depende da integração dos diversos sinais que o neurônio recebe

57 Transdução sensorial na visão, olfato e paladar Envolvem integração de GPCR e canais de membranas 2º mensageiros intracelulares regulam canais iônicos acoplados a receptores específicos Disparam despolarização/polarização da membrana de neurônios acoplados Guardam semelhanças estruturais e funcionais com GPCR hormonais - Ativação dependente da percepção de luz ou composto exógeno - Modulação da concentração de um 2º mensageiro - Supressão do sinal devido a ação autolimitante da Proteína G α

58 5) Integrinas: Receptores Bidirecionais Dímeros αβ Genoma indica 8 genes e 18 genes β 24 integrinas identificadas Interações macromoleculares seletivas - Desenvolvimento embrionário, coagulação, angiogênese, sistema imune, diferenciação celular, crescimento e metástase tumoral Sinalização de fora para dentro e de dentro para fora liga citoesqueleto a matriz extracelular integra intra- e extracelular - Influencia diretamente a adesividade celular Ligantes extracelulares - Colágeno - Fibrinogênio - Fibronectina - Outras Ligantes intracelulares - Proteínas do citoesqueleto - Talina - α-actinina - Vinculina - Paxilina - outras

59 6) Receptores nucleares Ação hormônios esteroides, tireoidianos e retinóide - Livre trânsito pela membrana plasmática pequenos e hidrofóbicos - Ativação da transcrição de genes específicos Presença de sequências HRE: elementos de resposta hormonal específicos